CN109157656B - 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109157656B
CN109157656B CN201811196350.4A CN201811196350A CN109157656B CN 109157656 B CN109157656 B CN 109157656B CN 201811196350 A CN201811196350 A CN 201811196350A CN 109157656 B CN109157656 B CN 109157656B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpr124
tumor
eukaryotic expression
peptide
expression plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201811196350.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109157656A (zh
Inventor
杨曌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University
Original Assignee
Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University filed Critical Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University
Priority to CN201811196350.4A priority Critical patent/CN109157656B/zh
Publication of CN109157656A publication Critical patent/CN109157656A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109157656B publication Critical patent/CN109157656B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用。本发明的肿瘤疫苗由肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒和融合肽通过静电作用结合，GPR124重组真核表达质粒又由GPR124基因和真核表达载体连接组成。本发明的的双靶标肿瘤疫苗有如下优点：1)肿瘤疫苗具有双靶标，可同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡；2)本疫苗安全、易于制备纯化，免疫原性强，易被APC摄取；3)大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

Description

一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。血管生成是原发和转移性肿瘤的生长的必要条件，早在30～40年代就有学者发现肿瘤组织中血管生长绝对数急剧增多。一旦肿瘤体内有新生血管时，肿瘤细胞迅速增生，瘤体快速生长，且易发生浸润和转移。
继手术、放射治疗和化学治疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手段。当前，肿瘤生物治疗策略有肿瘤相关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫治疗等，但均由于技术成熟性、有效性、安全性和经济性等问题，在实际应用中受到很大限制。
近年来研究发现，单纯抑制肿瘤血管生成在肿瘤治疗中仍存在一定局限性，若同时联用针对肿瘤细胞的治疗手段，将会产生更加理想的抗瘤效果。因此，以肿瘤新生血管内皮细胞靶标和肿瘤细胞(细胞凋亡靶标)为双靶标的治疗策略成为肿瘤治疗的新方向。
最近有学者研究结果表明，G蛋白偶联受体(GPR124)在血管生长过程中对内皮细胞有迁移和分化作用，GPR124是一种粘附的G-蛋白偶联受体含有一个神秘的RGD序列在其胞外结构域。最近研究表明GPR124缺失导致血管的发育障碍，而过表达则引起血管增多畸形。RGD域(Arg，Gly，ASP)在ECM的几种蛋白质发现，通过结合到细胞表面上的特定的整合素受体介导细胞粘附。GPR124也包含了一个神秘的RGD序列。Cullen Mike等人利用凝血酶直接切割可溶性GPR124，暴露GPR124的RGD序列，并发现该RGD序列可以与整合素αvβ3结合。在MMP9的水解作用下，可溶性GPR124片段可以与整合素αvβ3调节HUVEC的黏附与存活，并可能进一步调节血管的生成。这表明GPR124参与血管的生长。
以细胞内物质为靶标的药物(大分子、蛋白质、多肽及核酸)只有穿透细胞膜才能进一步发挥其药效。细胞穿透多肽(穿膜肽)是由少于30个氨基酸残基组成的小肽,它们能够通过与细胞膜相互作用而穿透细胞膜这一天然屏障。穿膜肽大致分为宿主防御肽、基于信号序列的穿膜肽和富含精氨酸的穿膜肽；穿膜肽进入细胞的机制尚未完全阐明,存在倒置微团模型、地毯式模型及打孔模型等假说。穿膜肽能够携带各种物质进入细胞的特性受到人们的关注。
线粒体促凋亡蛋白即Smac(the second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding proteinwith low PI Smac/DIABLO)是一种存在于线粒体并且调节细胞凋亡的蛋白质，通过其N端AVPI四肽序列与IAPs结合，解除IAPs对Caspase-9的抑制作用，进而激活Caspase－3及Csapase级联***，具有促进细胞凋亡的作用。
综上可知，研发一种更有效、更安全的，可在体内激发有效的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用的双靶标肿瘤疫苗显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种双靶标肿瘤疫苗，该疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化的优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱、在体内不易被抗原递呈细胞(APC)摄取等不足，可在体内激发有效的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
由肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒和融合肽通过静电作用结合，所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒由GPR124基因和真核表达载体连接组成，所述GPR124基因具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列,所述SEQ ID No.2的序列为GPR124全长编码基因，GenBan的k登录号为NM_054044.2；所述融合肽由穿膜肽与AVPI肽连接组成，具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。
进一步的，所述真核表达载体为pcDNA3.5。
进一步的，所述肿瘤疫苗靶向肿瘤血管内皮标志物GPR124基因和线粒体促凋亡蛋白。
进一步的，所述融合肽由穿膜肽具有如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。
穿膜肽为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与质粒DNA聚合形成致密颗粒，显著增强质粒DNA在体内外的转染效率。而且，穿膜肽为天然活性肽，可携带多肽、蛋白、寡核苷酸甚至脂质体等大颗粒物质以非内吞的方式进入胞浆，并促进其进入主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类抗原呈递途径，从而激活细胞免疫应答。
本发明的目的之二在于提供了一种双靶标肿瘤疫苗的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1)构建所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒；
2)制备所述穿膜肽与AVPI肽的融合肽；
3)制备所述肿瘤疫苗：于室温、混旋条件下，向含有所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒的等渗电解质溶液中，滴加所述穿膜肽与AVPI肽的融合肽溶液，滴加完毕后，室温下继续混旋60-120分钟，再静置60-120分钟，即得所述肿瘤疫苗。
进一步的，步骤1)先克隆得到GPR124基因，再将其***真核表达载体pcDNA3.5的XBI和Ecor1多克隆位点之间，构建肿瘤血管内皮标志物GPR124基因重组真核表达质粒pcDNA3.5/GPR124。
进一步的，步骤2)所述融合肽用固相合成法制备，所述融合肽具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。
进一步的，步骤3)中所述重组真核表达质粒的浓度为0.5-2.0mg/ml，所述融合肽的浓度为0.5-2.0mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。
优选的，步骤3)中所述重组真核表达质粒的浓度为1.0mg/ml，所述融合肽的浓度为1.0mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。
进一步的，步骤3)中所述等渗电解质溶液包括PBS、生理盐水、0.9％NaCl溶液和5％葡萄糖溶液。
优选的，步骤3)中所述室温下继续混旋的时间为90分钟，静置时间为90分钟。
本发明的目的之三在于提供了一种双靶标肿瘤疫苗的用途。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种双靶标肿瘤疫苗在用于制备抗肿瘤药物中的用途。
所述双靶标肿瘤疫苗靶向肿瘤血管内皮标志物GPR124基因和线粒体促凋亡蛋白，肿瘤血管内皮标志物GPR124基因可以与整合素αvβ3调节HUVEC的黏附与存活，并可能进一步调节血管的生成。这表明GPR124参与血管的生长。线粒体促凋亡蛋白通过其N端AVPI四肽序列与IAPs结合，解除IAPs对Caspase-9的抑制作用，进而激活Caspase－3及Csapase级联***，具有促进细胞凋亡的作用。因此，该双靶向肿瘤疫苗具有抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性。所述肿瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、结肠/直肠癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、脑肿瘤等。
本发明的有益效果在于：融合肽带正电荷，可以与带负电荷的GPR124基因重组真核表达质粒通过静电相互作用聚缩形成与天然病毒大小相近的致密颗粒。因具有颗粒性和穿膜肽的穿膜活性，在体内易于被APC摄取，GPR124基因重组真核表达质粒在APC细胞内表达GPR124，穿膜肽可有效促进GPR124进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径，从而激发有效的针对肿瘤新生血管内皮细胞的特异性CTL应答。同时，其表面的AVPI肽可以被肿瘤新生血管内皮细胞及肿瘤细胞表面的整合素受体介导摄取，从而抑制肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移，并且促进Caspase-3及Csapase级联***，促进肿瘤细胞的凋亡。
因此，1)本发明的双靶向肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点；2)又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易被APC摄取等不足；3)可以发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
附图1为GPR124基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
附图2为GPR124基因重组真核表达质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
附图3为穿膜肽与AVPI肽的融合肽的高效液相色谱鉴定图；
附图4为穿膜肽与AVPI肽的融合肽的质谱鉴定图。
附图5为肿瘤疫苗抑制肿瘤血管生成活性的检测，图5a为绘制肿瘤生长曲线，图5b为小鼠生存率检测。
附图6为肿瘤疫苗诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1GPR124基因重组真核表达质粒pcDNA3.5/GPR124的制备
(1)GPR124全长编码基因的克隆
根据GenBank登录号为NM_054044.2的GPR124基因序列，设计并合成PCR引物以扩增GPR124全长编码基因；以人胎盘cDNA文库为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体pGEM-T连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有Amp、IPTG、X-GAL的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pGEM-T/GPR124；
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如附图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见1泳道在约1000bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示***基因序列与GPR124全长编码基因序列(SEQ ID No.2)一致。
(2)GPR124基因重组真核表达载体的制备
根据GPR124全长编码基因序列和真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，设计并合成PCR引物以扩增包含GPR124全长编码基因、5’端XBI酶切位点和3’端Ecor1酶切位点的cDNA片段；以pGEM-T/GPR124为模板进行PCR，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶XBI和Ecor1进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经XBI和Ecor1双酶切的pcDNA3.5在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有Amp、IPTG、X-GAL的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，用XBI和Ecor1进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，将序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒命名为pcDNA3.5/GPR124；
重组真核表达质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如附图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为双酶切产物，可见1泳道在约3500bp和1000bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示***基因序列无突变，阅读框架正确，无移码。
实施例2穿膜肽与AVPI肽的融合肽的制备
融合肽由穿膜肽的羧基端与AVPI肽的氨基端直接连接而成，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。
融合肽在AB-431A型多肽合成仪上固相合成，采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，以0.25mmol的对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂，按照SEQ ID No.1的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，反应液用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用
Figure BDA0001828850250000071
explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10％上升至50％，流速为1mL/min，收集融合肽的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽，用去离子水溶解制成浓度为3mg/ml的溶液，用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，-70℃冻存备用。
融合肽的洗脱液用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10％上升至60％，流速为1mL/min，所得高效液相色谱鉴定图如附图3所示，经峰面积归一化法计算，融合肽的纯度为99％。
融合肽的洗脱液用API 2000LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，所得质谱鉴定图如附图4所示，融合肽的分子量测定值与理论值相符。
实施例3肿瘤疫苗的制备
于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为1mg/ml的pcDNA3.5/GPR124和浓度为1mg/ml的PBS的水溶液中，滴加1体积份浓度为1mg/ml的融合肽融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋60分钟，再静置60分钟，即得肿瘤疫苗。
实施例4肿瘤疫苗的制备
于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为1.5mg/ml的pcDNA3.5/GPR124和浓度为1mg/ml的PBS的水溶液中，滴加1体积份浓度为1.5mg/ml的融合肽融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋120分钟，再静置120分钟，即得肿瘤疫苗。
实施例5肿瘤疫苗的制备
于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为0.5mg/ml的pcDNA3.5/GPR124和浓度为1.0mg/ml的PBS的水溶液中，滴加1体积份浓度为0.5mg/ml的融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋90分钟，再静置90分钟，即得肿瘤疫苗。
实施例6抑制肿瘤血管生成活性的检测
将荷瘤裸鼠随机分为三组：对照组Ⅰ、对照组Ⅱ和实验组，对照组Ⅰ尾静脉注射生理盐水；对照组Ⅱ尾静脉注射融合肽与pcDNA3.5的复合物；实验组尾静脉注射本发明所述肿瘤疫苗；观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；60天后，取小鼠体内肿瘤组织进行病理切片检查，并用免疫组化法检测肿瘤新生血管密度(以抗CD31单克隆抗体为一抗)。
结果：与对照组Ⅰ和对照组Ⅱ相比，实验组小鼠生存率高(附图5b)，肿瘤生长缓慢且肿瘤新生血管密度降低(附图5a)。
实施例7诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测
实验随机分为三组：对照组Ⅰ、对照组Ⅱ和实验组，对照组Ⅰ用PBS处理CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞)；对照组Ⅱ用融合肽与pcDNA3.5的复合物处理CT-26细胞；实验组用本发明所述肿瘤疫苗处理CT-26细胞，共培养48小时后，PBS洗涤，再加入浓度为250μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的磷脂结合蛋白V(Annexin V)5μL和浓度为250μg/mL的碘化丙啶(PI)5μL，冰浴避光孵育10分钟，PBS洗涤，用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况：正常活细胞Annexin V和PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染而PI低染；坏死细胞Annexin V和PI均高染。
结果：对照组Ⅰ的细胞凋亡率为6.8％，对照组Ⅱ的细胞凋亡率为7.2％，实验组的细胞凋亡率为62.1％，表明本发明所述肿瘤疫苗能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡(如附图6)。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110>重庆医科大学附属永川医院
<120>一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用
<130> 0000
<160> 3
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 1
Arg Arg Met Lys Trp Arg Gln Ile Ala Val Pro Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 5520
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gggcgcccgggactcccgctgagcactcctcccgcacgcccgggtccctccggccggcga 60
gccgtccggcccctgcgctgtaggtccccgcggggcgatgggttgatgggcgcgggggga 120
cgcaggatgccggtgcctcccgcgcgtttgctgctgctgccgctgctgccttgtcttctg 180
ctcctggctcctggaactcggggtgcgcctggctgcccggtccctatccgcggttgcaag 240
tgctctggggagcggcccaagggactaagtggcggcgcccacaacccggctcgaaggagg 300
gtggtgtgcggcggtggggatctccccgaacctccagatcccggccttctgccaaacggc 360
accatcaccttgctcttgagcaacaacaagattactgggctccgcaatggatccttcttg 420
ggactgtccctgttggagaagttggacctgaggagcaatgtcatcagcactgtgcagcct 480
ggagccttcctaggtctgggagagctaaaacgcttagatctctccaacaatcggattggc 540
tgtctcacctctgagacatttcaagggctccctagacttctcagactaaacatatctgga 600
aacatctactctagtctgcaacctggggtctttgatgagctgccagcccttaagattgtg 660
gactttggtactgagtttctgacctgtgactgccgcctgcgctggctgctgccctgggcc 720
cggaatcactccctgcagctgtctgagcgcacactctgtgcctaccccagtgccctgcac780
gcccatgccctgagcagcctccaggagtcccagcttcgctgtgaaggggccctggaactg 840
cacacccactacctcatcccatcccttcgccaagtggtgttccagggtgaccgcctgccc 900
ttccagtgctcagccagctacttgggcaacgatacccggatccactggtaccacaatggg 960
gctcctatggagagcgatgagcaggccggcatcgtccttgctgaaaaccttatccatgat 1020
tgcaccttcatcaccagtgagctgaccctgtctcacattggtgtgtgggcctctggtgaa 1080
tgggagtgctccgtgtccacagtccaaggcaacaccagcaagaaggtggagatagtagtg 1140
ctggagacctctgcctcctactgccctgcagagcgggtgaccaacaaccgtggggacttc 1200
aggtggccccgaaccttggctggcatcacggcttaccagtcctgtttacagtaccccttc 1260
acctctgtgcccttgagtgggggagccccgggtacccgagcctcacgcaggtgtgaccga 1320
gctggccgctgggagccaggggactactcgcactgtctgtacaccaatgacatcactcgg 1380
gtgctctacacctttgtgctgatgcccatcaacgcctccaatgcattgacgttggcccac 1440
cagctgcgagtgtataccgcagaggccgccagcttctcagacatgatggacgtggtctat 1500
gtggctcagatgatccagaagtttttgggttacgttgaccagatcaaggagctggtggag 1560
gtgatggtggacatggccagcaacctgatgctggtggatgagcaccttctgtggctggcc 1620
cagagagaagacaaagcctgcagtggcattgtgggtgccctggagcgaatcggaggagct 1680
gctcttagcccccatgcccagcacatctctgtgaattcaagaaatgtggcactggaggcc 1740
tacctcatcaagcctcacagctacgtgggtctgacttgcacggctttccagaggagggag 1800
gtaggagtgtcgggtgcacagccaagcagcgtcggccaggatgccccagtggagcccgaa 1860
cccctagctgatcagcagcttaggttccgctgcaccactgggaggcccaacatttctctg 1920
tcatccttccacatcaagaatagcgtggccctggcctccatccagctgccccccagcctg 1980
ttctcaacccttccggctgccctggctcccccagtccctccagattgcaccctgcaactg 2040
ctggtcttcagaaatggccgtcttttccgcagccacggcaacaacacttcccgtcctgga2100
gcagctgggcctggcaagaggcgtggtgtggccaccccagtcatatttgcaggaaccagt 2160
ggctgtggtgtgggaaacttgacggagcccgtggctgtgtcactgaggcactgggctgaa 2220
ggagctgaccccatggcagcttggtggaaccaggacgggcctggaggctggagttctgaa 2280
ggctgcaggctccgctacagccagcccaacgtcagctccctgtactgccagcacttgggc 2340
aatgtggccgtgcttatggagctgaatgcattcccgcgggaggcaggaggctctggggct 2400
gggttgcatcccgtcgtgtacccctgcacggctttgctgctactctgtctcttctccacc 2460
atcatcacgtacatcctcaaccacagctccatccacgtgtcccggaagggttggcacatg 2520
ctgctgaacctttgtttccatatggccatgacctctgctgtcttcgtggggggcgtcacg 2580
ctcaccaactaccaaatggtttgtcaagcggtgggcatcactctgcactactcttccttg 2640
tcgtcactgctctggatgggggtcaaggctcgagtcctccacaaggagcttagttggagg 2700
gcaccccctctggaagaaggggaagcagctccgcctggtcctcgccccatgctccggttc 2760
tacttgattgctggagggatccccctcataatctgcggcatcaccgctgcggtcaacatc 2820
cacaactaccgggaccacagtccctattgttggctggtgtggcgtccaagccttggtgcc 2880
ttctacataccggtggcgttgattctgcctatcacctggatctacttcttgtgtgcaggc 2940
cttcacttacggagccatgtggcccagaatccaaagcagggtaacaggatctctctggag 3000
ccaggggaagagctgaggggttccaccaggctcaggagtagtggcgtcctcctgaatgac 3060
tctggttctcttttggctacagttagcgcaggagtagggacacctgcgcccccagaggat 3120
ggtgatggcgtatattctcctggagtccagctgggggcgctgatgaccacgcatttcctg 3180
tacctggctatgtgggcttgtggtgccttggcggtgtctcagcgctggctgccccgagtg 3240
gtgtgtagctgtctgtacggcgtggcagcttcagctcttggtctgtttgtcttcactcac 3300
cactgtgccagacgtagagatgtccgggcttcctggcgcgcctgctgccctcctgcttcg 3360
ccctcggcctcccatgtcccagcccgggccctgccgactgctacagaggatggatcccca 3420
gtgttgggggagggaccagcctctctcaagtcctccccaagtggcagcagtggccgcgcg 3480
ccgccacccccctgcaaactcaccaatctgcaggtggcccagagtcaggtgtgcgaggca 3540
agcgtggccgcccgcggagatggagagccagagcccaccggctcccgtggcagcctagct 3600
ccccggcaccataacaacctgcatcatgggcgccgagtacacaagagtcgggccaagggg 3660
caccgagccggagagactggtggtaagagccggctcaaggcgttgcgcgcgggcacgtcc 3720
ccaggagctcccgagctgttgtccagtgagagcggcagtttgcacaacagcccgtctgac 3780
agctacccgggcagcagccgcaacagtccaggcgacggtcttccactcgagggtgagccc 3840
atgcttacgccgtcggagggcagtgacacaagcgccgcgccaatcgctgagacggggcgc 3900
cccgggcagcgccgcagcgccagccgtgacaacctcaagggcagcggcagcgcgctggag 3960
agggagagcaagcgccgctcctatccgctcaacactaccagtcttaacggtgcccccaaa 4020
gggggcaagtatgaggatgccagtgtaactggtgcagaggccatagcgggaggctccatg 4080
aagactggcctctggaaaagcgagaccaccgtctaggtccagatttaggatgggcgggtc 4140
acgcgggcttgtttactcccaaatcctcttgggcggtccaagccgtctactgatgtgtat 4200
gtaggtttaaggcggccatgctgatgctgcccttgagtccaccatcattagttacccagg 4260
ctagggaaaggggagggaggcagatgcttgcccctactgtggactatccctcagcagtag4320
cgacagacaatcccagaccagttttggtggccaagttcttggtatcctgccaggtaggca 4380
taaaacatccatcggtccctagggtaacccataaactgagttgaagagcccagcccaggt 4440
aggctcaggaaatgagagggagaccggggaactgggttctccacaccagcccggcaaggt 4500
atcctgtgactgccaagatcccaggcctctctcccagttttggcttgggaaaccatccca 4560
gcaggtgagccagggggcgtaacaggtgctgcctttcagattaactatgcaagggggatg 4620
ggggtgggaggggtagggcagtgtggtgggcagctctagagatgagcttgtccctcagga 4680
ggcaggcaggtgggaaaaggtgcattagggagacagaatccctaactatgggagtggtac 4740
acagtttttccagcagagttcacagcaaaccctgaacccccacacacctgggaagtgata 4800
ctgccagcaggtgccttaagactcaaggggagggagctgatatgtggatctcacaaccta 4860
tacagtggtctgcaagtggctccacttagctgcttaattataatacccactgtctgttcc 4920
cagccctccaactccgggggactgaggggaaatgcctccatgaggctcctgtggcaaagc 4980
catgctaataatctgacttctaacctcagttagaaacccaaaatgccaaaccacctccta 5040
actcgctgaaacccaaccacactctgaggcagcgcctgggtccaggctgctcaagagcct 5100
atgcttccagcccccattttcctcaactcaagatgccttttaatacagaactacatggaa 5160
gtagaggaacccttgggcactgggaagtagcagggatcccagctctgatcaagtgagagg 5220
acagagcagggaagacgccatactcgctgagatgggtcccattatttatgctttgctgca 5280
cagacactattagaggaaaagctttgtattactctcccacgtgagctgctgctgtttacc 5340
ctgccaatgccttagcactggagagctttttgcaatatgctggggaaaggggagggaggg 5400
gatgaagtgccaaagaaaacacattttaaaagctctggttttatacaatagaatgttttc 5460
cagcagatgcctctttgttttaatatattaaaatcttgcaaaactctttgagcgacaaaa 5520
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 3
Ala Val Pro Ile
1

Claims (10)

1.一种双靶标肿瘤疫苗，其特征在于，由肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒和融合肽通过静电作用结合，所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒由GPR124基因和真核表达载体连接组成，所述GPR124基因由SEQ ID No.2所述的核苷酸序列构成；所述融合肽由穿膜肽与AVPI肽连接组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.5。
3.根据权利要求1所述的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于，所述AVPI肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.权利要求1所述的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒；
2）制备所述穿膜肽与AVPI肽的融合肽；
3）制备所述双靶标肿瘤疫苗：于室温、混旋条件下，向含有所述肿瘤血管内皮标志物GPR124重组真核表达质粒的等渗电解质溶液中，滴加所述穿膜肽与AVPI肽的融合肽溶液，滴加完毕后，室温下继续混旋60-120分钟，再静置60-120分钟，即得所述双靶标肿瘤疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）先克隆得到GPR124基因，再将其***真核表达载体pcDNA3.5的XBI和Ecor1多克隆位点之间，构建肿瘤血管内皮标志物GPR124基因重组真核表达质粒pcDNA3.5/ GPR124。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述融合肽用固相合成法制备。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述重组真核表达质粒的浓度为0.5-1.5mg/ml，所述融合肽的浓度为0.5-1.5mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述重组真核表达质粒的浓度为1.0 mg/ml，所述融合肽的浓度为1.0 mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述等渗电解质溶液为PBS、生理盐水、0.9% NaCl溶液和5%葡萄糖溶液中的任意一种或多种，所述室温下继续混旋的时间为90分钟 ，静置时间为90分钟。
10.权利要求1-3中任意一项所述的双靶标肿瘤疫苗在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
CN201811196350.4A 2018-10-15 2018-10-15 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用 Expired - Fee Related CN109157656B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811196350.4A CN109157656B (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811196350.4A CN109157656B (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109157656A CN109157656A (zh) 2019-01-08
CN109157656B true CN109157656B (zh) 2021-08-27

Family

ID=64877995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811196350.4A Expired - Fee Related CN109157656B (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109157656B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111358943A (zh) * 2020-03-03 2020-07-03 重庆医科大学附属永川医院 一种新冠病毒的双靶向免疫增强型多价疫苗及其制备方法
CN111388661A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 重庆医科大学附属永川医院 基于tipe-2的新冠病毒负调疫苗及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101623498B (zh) * 2009-08-06 2012-05-09 中国人民解放军第三军医大学 基于肿瘤内皮标记物-8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法
EP3408298A4 (en) * 2016-01-29 2019-09-04 Oncoceutics, Inc. MODULATION OF THE G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR (GPCR) BY IMIPRIDONE

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090214542A1 (en) * 2003-09-24 2009-08-27 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101623498B (zh) * 2009-08-06 2012-05-09 中国人民解放军第三军医大学 基于肿瘤内皮标记物-8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法
EP3408298A4 (en) * 2016-01-29 2019-09-04 Oncoceutics, Inc. MODULATION OF THE G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR (GPCR) BY IMIPRIDONE

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Co-delivery of Cell-permeable Chimeric Apoptosis AVPIR8 Peptide/p53 DNA for Cocktail Therapy;Huiyuan Wang 等;《Adv. Funct. Mater》;20131231;第23卷;6068-6075 *
具有穿膜功能的嵌合型AVPI-低分子量鱼精蛋白/DNA共给药***的抗肿瘤研究;谭娇 等;《药学学报》;20141231;第49卷(第12期);1718-1723 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109157656A (zh) 2019-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107814845B (zh) 新的抗pd-1纳米抗体及其应用
CN108840923B (zh) 一种靶向pd-l1的多肽及其应用
JP6574175B2 (ja) 細胞透過性ペプチド、及びそれを含むコンジュゲート
US10370410B2 (en) Cancer cell-targeting peptide and use thereof
CN105175527B (zh) 一种乳腺癌特异性的热休克蛋白复合物及其应用
US20200062811A1 (en) Yap protein inhibiting polypeptide and application thereof
CN109265565B (zh) 一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用
US10441628B2 (en) High activity tumour inhibitor and preparation method and use thereof
CN109157656B (zh) 一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN103805621B (zh) 靶向性抗肿瘤融合蛋白质lpo的新型制备工艺
EP3454879B1 (en) New compounds and pharmaceutical use thereof in the treatment of cancer
CN112409447B (zh) 一种靶向识别膜联蛋白a2的亲和短肽及其制备方法与用途
CN107805282A (zh) 一种靶向疗法和免疫疗法联合的多肽
CN109504698A (zh) 一种靶向全人源化mesothelin的嵌合抗原受体的方法和用途
CN106466485B (zh) 一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体
CN109400711B (zh) 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
CN113105554B (zh) 一种抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
CN110627905B (zh) 靶向vegf与egfr的双功能融合蛋白及其应用
CN104119444B (zh) 抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途
CN102391377A (zh) 一种可诱导和激活癌靶向t细胞的融合蛋白及制备方法及用途
CN109045290B (zh) 基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法
EP4112636A1 (en) Tumor immune enhancer, and preparation method therefor and application thereof
WO2013081233A1 (ko) 암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드
CN106589064A (zh) 高活性的肿瘤抑制剂及其制法和应用
KR20130011056A (ko) 염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210827