CN109157548B - 一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物及制备方法，由黑虎掌菌粉、黑松露菌粉组成；该组合物具有提高运动耐力、缓解疲劳、抗氧化和补肾壮阳之功效，经动物实验及临床实践证实具有良好的抗疲劳和壮阳作用。本发明根据中医配伍理论和中西医相结合理论配制成复方制剂，以黑虎掌和黑松露为主要原料，两者协同发挥显著的功能学活性，且大大降低了原料成本，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于保健品加工技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物及其制备方法及应用。
背景技术
随着社会发展、科技进步和生活节奏的日益加快，人们所承受的压力在逐渐增加，高强度高负荷的脑力和体力劳动使得大部分工作者长期处于疲劳或亚健康状态，如面白无力、失眠多梦、腰酸背痛、焦躁不安、记忆力衰退，阳瘘早泄、未老先衰等现象。我国乃至全世界每年都有因长时间过度疲劳而引发死亡的案例。据WHO调查，全球有35%以上的人处于疲劳状态，疲劳发生后如果得不到及时消除，逐渐积累会出现过度训练综合征 (OTS) 或慢性疲劳综合征 (CFS )等病症，同时伴随机体发生内分泌紊乱、免疫力下降，甚至出现器质性病变，成为威胁人类身心健康的重要因素。疲劳对肌肉和骨骼器官造成的损害能够直接影响骨骼肌肉的性能，阻滞心肌供血。在现有工作环境和压力不能改变的情况下，则需要疲劳工作者根据自身情况适时适量补充具有抗疲劳功效的保健食品以缓解和恢复机体疲劳，提高机体抗压能力。疲劳的发生机制主要包括（1）能源物质耗竭学说（2）代谢产物堆积学说（3）内环境稳定性失调学说（4）保护性抑制学说（5）内分泌***失调理论（6）突变理论（7）自由基影响理论；其中，自由基学说越来越得到研究者的认可，大量报道显示运动会诱发大量自由基的产生。如wang等人发现力竭游泳实验导致小鼠体内血乳酸、血尿素氮和血红蛋白含量下降，认为可能是运动产生的氧化应激导致的机能下降；Nazeer等人研究发现白花鱼蛋白酶解液具有抗脂质过氧化能力和提高抗氧化酶体系的活力，可能与其缓解氧化应激反应从而增强运动耐受力有关，这也从一定角度反映了抗氧化活性与抗疲劳作用之间存在着相关性。因此，研究如何通过阻止自由基的产生来提高机体运动耐力，从而起到补肾壮阳的作用显得尤为重要。
近年来，在民间医学和现代科学实验基础上，不少学者在寻求抗疲劳和***物方面做了大量的工作，这类主要治疗药物都存在着诸多副作用和不良反应如体力过度透支，同时药物成本也高昂。传统中草药因副作用少、不含对人体有害的***成分成为近年来抗疲劳药物的研究热点，由于“药补不如食补”，“是药三分毒”等观念深入人心，致使抗疲劳功能保健食品比起抗疲劳药物更受人们的欢迎，因此寻找开发有效、安全和副作用小的功能食品成为一种非常有前景的解决途径。
目前，中药类抗疲劳产品主要通过以下机制实现缓解疲劳的功效：
1、补充能量，通过补充身体消耗的营养因子达到维持机体正常生理功能、缓解疲劳的目的，如增加糖原储备量。
2、补充人体必需维生素和微量元素的摄入。
3、加速体内代谢物质的清除和排出，达到抗疲劳目的。
4、调节性激素水平，如睾酮、孕酮、***和皮质醇等含量。
5、清除过量游离自由基，提高机体抗氧化能力。
市场上现有的抗疲劳保健品，品种较多，作用效果各不相同，质量也参差不齐。据申请人所知，一般的抗疲劳药物通过为机体提供能量，加速代谢产物的清除速率，调节微环境，提高免疫力或直接刺激神经***达到抗疲劳作用。尽管这类神经***药物很有疗效，但对心脑血管和神经***的危害却很大，存在一定的风险，其疗效有待于进一步验证。
黑虎掌菌学名枣翘鳞肉齿菌（Sarcodon imbricatus (L.ex Fr.) Karst.），隶属于担子菌纲多孔菌属，是滇黔藏地区独有的名贵野生菌类，富含丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、粗纤维、酚类化合物以及多种矿物质微量元素，具有很高的食补价值和药理活性。祖国医学认为，黑虎掌菌性平味甘，有舒筋活血之功效，同时能降低胆固醇，益气补气、追风散寒、治风破血、和胃通便、降血压、解食物之毒、治头痛头昏等作用。然而，目前对黑虎掌菌的研究主要侧重于化学成分分析、多糖提取、菌株液体发酵培养条件优化、体外抑菌和体内抗肿瘤活性的研究，关于黑虎掌菌抗疲劳与抗氧化方面还未见报道，缺乏对其全面而***的认识。
黑松露又称块菌（Tuber melanosporum）是一种生长于地下的稀有真贵野生食用真菌，具有极高的营养保健价值。由于其生长条件苛刻，每年全世界产量非常稀少，故价格相当昂贵，堪比黄金，被称为餐桌上的“黑色钻石”。目前国内对于黑松露的研究尚少，主要是关于种属分类和资源分布等，对黑松露多糖的生理活性研究也仅停留在抗氧化上，而其他活性鲜有报道。大量研究证明，黑松露含有18种氨基酸（包括人体不能合成的必需氨基酸）、丰富的蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸及矿物质微量元素，人类食用黑松露已有2000多年的历史，除了在美味佳肴中扮演重要角色外，目前市场上已纷纷推出以黑松露为主要成分的产品，如巧克力，面包，饮品，压片糖果、面膜等。
迄今为止，尚未发现有关以黑虎掌菌、黑松露菌单一成分或由黑虎掌菌和黑松露菌相互配伍，以其协同作用用于抗疲劳、抗氧化及补肾壮阳获得理想治疗效果的相关文献报道。因此，开发一种同时具有抗疲劳、抗氧化和补肾壮阳作用的功能性保健食品具有良好的市场前景，本发明提供的组合物具有不可替代的优势和巨大的开发潜力。
发明内容
本发明公开了一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物，在提高运动耐力、缓解疲劳、抗氧化和补肾壮阳方面具有明显之功效。
本发明进一步公开了一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的制备方法，适用于工业化生产。
本发明提供了一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物，其由如下重量份的原料组成：黑虎掌菌粉30-85份，黑松露菌粉25-55份。
优选的，所述一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物，其由如下重量份的原料组成：黑虎掌菌粉45-65份，黑松露菌粉35-45份。
更优选的，所述一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物，其由如下重量份的原料组成：黑虎掌菌粉60份，黑松露菌粉40份。
本发明提供了所述一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的制备方法，由以下步骤制备而成：
（1）按比例称取上述原料，加水煎煮1-3次，每次1-3小时，每次加入水的质量为组合物质量的8-12倍，得到煎煮液；
（2）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，即得。
本发明还提供了所述一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物在制备抗疲劳和壮阳制剂中的用途。
所述抗疲劳和壮阳制剂可以为散剂、口服液、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂或膏剂等。
本发明所述的抗疲劳和壮阳制剂还可以加入药学上可接受的常规辅料。
本发明具有以下有益效果；
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物、其制备方法及应用，该组合物具有提高运动耐力、缓解疲劳、抗氧化和补肾壮阳之功效，经动物实验及临床实践证实具有良好的抗疲劳和壮阳作用。本发明根据中医配伍理论和中西医相结合理论配制成复方制剂，以黑虎掌和黑松露为主要原料，两者协同发挥显著的功能学活性，且大大降低了原料成本，有利于工业化生产。因此，从制剂配方，制备方法及其应用范围来看，均为国内外首次报道。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例和对比例中所使用的黑虎掌菌为购于云南楚雄泓利达食品有限公司的黑虎掌菌子实体。经粉碎机粉碎后的菌粉，为棕黄色粉末。
实施例和对比例中所使用的黑松露菌为购于云南楚雄泓利达食品有限公司的黑松露菌子实体。经粉碎机粉碎后的菌粉，为深棕色粉末。
实施例 1 ：
本实施例一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的原料组成为：
黑虎掌菌粉60g，黑松露菌粉40g。
该组合物的制备方法，包括以下步骤：
1、将黑虎掌菌和黑松露菌干燥后，经粉碎机粉碎，过80目筛，分别得到黑虎掌菌粉和黑松露菌粉。
2、取选定重量份的黑虎掌菌粉和黑松露菌粉，混合均匀，得到实施例1的一种具有抗疲劳作用和壮阳功能的组合物。
实施例2 ：
将实施例1制得的一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物制备成散剂，方法如下：
（1）取实施例1的一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物30g，加水煎煮2次，每次2小时，每次加入水的质量为组合物质量的10倍，得到煎煮液；
（2）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，得到实施例2的一种具有抗疲劳和壮阳功能的散剂。
实施例 3 ：
将实施例1制得的一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物制备成散剂，方法如下：
将实施例1的一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物与实施例2制得的一种具有抗疲劳和壮阳功能的散剂按质量比1:1混合均匀，得到实施例3的一种具有抗疲劳和壮阳功能的散剂。
实施例 4 ：
按如下方法制备一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的片剂：
（1）将30g黑虎掌菌和55g黑松露菌干燥后，经粉碎机粉碎，过80目筛，分别得到黑虎掌菌粉和黑松露菌粉的组合物；
（2）取步骤（1）得到的组合物50g，加水煎煮2次，每次2小时，每次加入水的质量为组合物质量的10倍，得到煎煮液；
（3）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末；
（4）向步骤（3）得到的粉末中加入片剂常用辅料，混合均匀，按片剂常规工艺制成各种片剂。
实施例 5：
按如下方法制备一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的颗粒剂：
（1）将40g黑虎掌菌和40g黑松露菌干燥后，经粉碎机粉碎，过80目筛，分别得到黑虎掌菌粉和黑松露菌粉的组合物；
（2）取步骤（1）得到的组合物70g，加水煎煮2次，每次2小时，每次加入水的质量为组合物质量的10倍，得到煎煮液；
（3）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末；
（4）向步骤（3）得到的粉末中加入颗粒剂常用辅料，混合均匀，按颗粒剂常规工艺制成颗粒剂。
实施例 6：
按如下方法制备一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的丸剂：
（1）将50g黑虎掌菌和30g黑松露菌干燥后，经粉碎机粉碎，过80目筛，分别得到黑虎掌菌粉和黑松露菌粉的组合物；
（2）取步骤（1）得到的组合物70g，加水煎煮2次，每次2小时，每次加入水的质量为组合物质量的10倍，得到煎煮液；
（3）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末；
（4）向步骤（3）得到的粉末中加入丸剂常用辅料，混合均匀，按丸剂常规工艺制成各种丸剂。
实施例 7：
按如下方法制备一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的胶囊剂：
（1）将55g黑虎掌菌和35g黑松露菌干燥后，经粉碎机粉碎，过80目筛，分别得到黑虎掌菌粉和黑松露菌粉的组合物；
（2）取步骤（1）得到的组合物80g，加水煎煮2次，每次2小时，每次加入水的质量为组合物质量的10倍，得到煎煮液；
（3）将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末；
（4）向步骤（3）得到的粉末中加入胶囊剂常用辅料，混合均匀，按胶囊剂常规工艺制成胶囊。
对比例1
黑虎掌菌粉，经粉碎机粉碎，过80目筛。
对比例2
黑松露菌粉，经粉碎机粉碎，过80目筛。
测试例1：
1实验动物、试剂和仪器
1.1实验动物：SPF级健康昆明品系雄性小鼠，体重18-22 g，购于吉林大学实验动物中心(许可证号：SCXK (吉林) 2017-0003)。使用12/12小时光照/黑暗周期（早上8点至晚上8点的光照）将小鼠饲养在受控环境中（温度23±1℃，湿度50±10%），饮食自由。
1.2主要试剂：尿素氮（BUN）、乳酸（LA）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）、肌糖原和肝糖原测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；孕酮（PROG）、睾酮（T）和***（E2）ELISA测定试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；0.9%生理盐水购于吉林科伦康乃尔制药有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于Merck Millipore, Billerica, MA。
1.3主要仪器：酶标仪，SYNERGY4，美国博腾；96孔板，NEST；漩涡混合器，OL-901，江苏海门市麒麟医用仪器厂；电热鼓风干燥箱，101A-1E，上海实验仪器厂有限公司；恒温水浴锅，GSY-II，北京医疗设备厂；高速离心机，Mini Spin，德国Eppendorf；动物跑步机，FT-200，成都泰盟科技有限公司；自主活动记录仪，ZZ-6，成都泰盟科技有限公司；疲劳转棒仪，ZB-200，成都泰盟科技有限公司。
2实验方法
2.1分组与给药
SPF级健康昆明种雄性小鼠70只，体重18-22g，按照国家标准锯齿类动物干燥饲料适应性喂养5天后，将小鼠随机均分为7组，每组10只：即为正常对照组、阳性对照组（人参皂干粉，其中人参皂甙含量为80%，购于西安万方生物科技有限公司）0.05 g/kg、实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1和对比例2，用前用0.5%的羧甲基纤维素钠制备成0.1 g/mL的悬浊液。在每天9:00-10:00时间段之间进行灌胃给药，灌胃体积为0.2 mL/20g，正常对照组灌以等体积溶剂，连续灌胃14天。参考***《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中缓解体力疲劳功能检验方法，实验结束后进行各项抗疲劳指标的测定。
2.2 自主活动测试
将各组灌胃后小鼠置于安静阴凉处，静置30分钟，放入自主活动箱中，盖上避光板，使小鼠适应2 min后，记录小鼠5分钟内的站立次数和行动次数，平行3次。
2.3 疲劳转棒测试
末次灌胃给药30分钟后，将各组小鼠分别放在转棒仪上（15转/分钟），使其肌肉处于静力紧张状态。各组小鼠进行实验前，进行适当训练，当小鼠在转棒上跌落3次后，开始记录小鼠由于肌肉疲劳从转棒上跌下的时间，平行3次。
2.4 耐力跑测试
末次灌胃给药30分钟后，将小鼠置于FT-200动物跑步机中，放置好动物后，对小鼠进行训练，使其了解逃离带电区域后，将仪器转速设为20转/分钟，电流调到最高，记录小鼠被电击5次的时间，以此作为力竭时间。
2.5 负重游泳测试
按剂量设计连续灌胃给药14天，于末次灌胃给药30分钟后，将小鼠置于水中游泳，水深30 cm，水温25±1.0 ℃，鼠尾根部负荷10%体重的铅粒，记录小鼠自游泳开始至力竭，作为小鼠的力竭游泳时间。以小鼠头部沉水后超过8 s无法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作为力竭判断标准。
2.6小鼠游泳后即刻血清中BUN、LA和LDH含量测定
连续给药14天，末次灌胃小鼠受试物30分钟后，在温度为25±0.5 ℃的水中进行不负重定时游泳30分钟。取出小鼠擦干，立即眼眶静脉丛取血0.8 mL，离心制备血清后置于-80℃冰箱保存。依照各自试剂盒说明书的测定方法进行检测。
2.7 小鼠游泳后即刻血清中SOD、GSH-Px和ROS含量测定
连续给药14天，末次灌胃小鼠受试物30分钟后，在温度为25±0.5 ℃的水中进行不负重定时游泳30分钟。取出小鼠擦干，立即眼眶静脉丛取血0.8 mL，离心制备血清后置于-80℃冰箱保存。依照各自试剂盒说明书的测定方法进行检测。
2.8 小鼠游泳后肌糖原、肝糖原含量测定
立即摘取小鼠肝脏和后肢肌肉，剔除***和多余脂肪，冻存-80℃冰箱，备用。依照各自试剂盒说明书的测定方法进行检测。
2.9统计方法：SPSS16.0对数据进行处理，采用单因素方差分析，P < 0.05判断为差异具有显著性，P < 0.01判断为差异具有极显著性。
3实验结果
3.1 自主活动实验
如表3.1所示，与正常对照组相比，实施例1、2、3、阳性对照组及对比例1和对比例2组对小鼠的行动次数和站立次数均不具有显著性影响，说明该组合物或制剂对小鼠的中枢神经***没有影响，不会造成损伤。
表3.1对小鼠自主活动的影响
| 组别 | 动物数/只 | 行动次数 | 站立次数 | P值 |
| 正常对照组 | 10 | 10.6±3.7 | 57.8±17.9 | |
| 阳性对照组 | 10 | 11.1±5.1 | 60.9±19.0 | >0.05 |
| 实施例1 | 10 | 10.0±3.3 | 59.2±14.8 | >0.05 |
| 实施例2 | 10 | 10.4±5.9 | 60.2±15.3 | >0.05 |
| 实施例3 | 10 | 10.2±3.3 | 56.1±18.8 | >0.05 |
| 对比例1 | 10 | 10.3±4.8 | 57.3±17.3 | >0.05 |
| 对比例2 | 10 | 11.6±5.3 | 56.9±15.8 | >0.05 |
注：P > 0.05代表不具有显著性
3.2 疲劳转棒实验
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，转棒时间长短可以反映动物运动疲劳的程度。如表3.2所示，实施例1、2、3及阳性对照组均可以显著延长小鼠的转棒时间，分别是正常对照组小鼠的1.2倍（P < 0.05），1.9倍（P < 0.01），1.7倍（P < 0.05）和1.1倍（P < 0.05），对比例1和对比例2组对小鼠的转棒时间影响不显著，未显示出统计学意义。相较于实施例1、2和3组，对比例1和对比例2组转棒时间均显著低于本发明的组合物（P< 0.05）。
表3.2对小鼠疲劳转棒时间的影响
| 组别 | 动物数/只 | 转棒时间/s | P值 |
| 正常对照组 | 10 | 284.6±18.1 | |
| 阳性对照组 | 10 | 322.9±14.7 | <0.05 |
| 实施例1 | 10 | 348.7±20.9 | <0.05 |
| 实施例2 | 10 | 530.4±27.5 | <0.01 |
| 实施例3 | 10 | 474.7±17.2 | <0.05 |
| 对比例1 | 10 | 318.3±15.8 | >0.05 |
| 对比例2 | 10 | 290.3±22.1 | >0.05 |
注：P > 0.05代表不具有显著性，P < 0.05代表具有显著性，P < 0.01代表极显著
3.3 耐力跑实验
如表3.3显示，实施例1、2、3及阳性对照组均能显著提高小鼠的跑步时间，与正常对照组相比，跑步时间分别提高了14.8%（P < 0.05），24.1%（P < 0.01），30.0%（P < 0.01）和35.4%（P < 0.01）。相较于本发明实施例1~3组，对比例1和对比例2组延长小鼠的跑步时间明显低于本发明的组合物（P < 0.05），并且本发明实施例1~3组的耐力跑时间显著高于对比例1和2组单独作用之和。其中，实施例3组效果最佳。
表3.3对小鼠耐力跑时间的影响
| 组别 | 动物数/只 | 跑步时间/min | P值 |
| 正常对照组 | 10 | 23.7±4.8 | |
| 阳性对照组 | 10 | 32.1±6.4 | <0.01 |
| 实施例1 | 10 | 27.2±4.2 | <0.05 |
| 实施例2 | 10 | 29.4±4.9 | <0.01 |
| 实施例3 | 10 | 30.8±7.5 | <0.01 |
| 对比例1 | 10 | 25.3±7.1 | >0.05 |
| 对比例2 | 10 | 24.9±6.2 | >0.05 |
注：P > 0.05代表不具有显著性，P < 0.05代表具有显著性，P < 0.01代表极显著
3.4负重游泳实验
如表3.4，结果显示实施例1~3组及阳性对照组均能显著的延长小鼠负重游泳时间，较正常对照组相比，游泳时间分别提高了17.2%（P < 0.05）、20.7%（P < 0.05）、41.0%（P< 0.01）和35.5%（P < 0.01），尽管对比例1和2组小鼠的力竭时间有所增加，但明显低于本发明实施例1~3组，且实施例3组影响极显著（P < 0.01），比对比例1和对比例2组单独作用之和提高了34.0%（P < 0.01）。
表3.4对小鼠力竭游泳时间的影响
| 组别 | 动物数/只 | 力竭时间/s | P值 |
| 正常对照组 | 10 | 358.6±80.1 | |
| 阳性对照组 | 10 | 485.8±63.9 | <0.01 |
| 实施例1 | 10 | 420.3±56.3 | <0.05 |
| 实施例2 | 10 | 432.7±54.1 | <0.05 |
| 实施例3 | 10 | 505.7±70.8 | <0.01 |
| 对比例1 | 10 | 382.1±66.3 | >0.05 |
| 对比例2 | 10 | 370.2±55.6 | >0.05 |
注：P > 0.05代表不具有显著性，P < 0.05代表具有显著性，P < 0.01代表极显著
3.5组合物或制剂对游泳后小鼠血清中BUN、LD及LDH的影响
机体BUN含量随运动负荷的增加而增加，机体对负荷适应能力越差，BUN的增加就越明显。如表3.5所示，与正常对照组相比，实施例1、实施例2和对比例1能够显著的降低小鼠游泳后血清中BUN含量，分别降低了23.7%（P < 0.05）、28.8%（P < 0.01）和18.7%（P <0.05），实施例3和阳性对照组效果最为显著，比正常对照组降低了30.9%（P < 0.001）和33.8%（P < 0.001）；LA清除代谢速度越快，有氧代谢能力越高，有利于疲劳的迅速消除。与正常对照组相比，实施例1、实施例2和实施例3能够显著降低小鼠游泳后血清中LA含量，分别降低了17.6% (P < 0.05)、14.7% (P < 0.05)和18.4%（P < 0.01），对比例1和2未表现出统计学意义；LDH能够减少运动后LA在肌肉中的堆积。运动后LA的消除依赖于LDH的催化作用，LDH活性升高，可以加速肌肉中过多LA转变为丙酮酸，从而延缓疲劳的产生。与正常对照组相比，实施例2、实施例3和阳性对照组能够显著的提高小鼠游泳后血清中LDH的含量，分别提高4.7%（P < 0.05）、6.7%（P < 0.05）和7.0%（P < 0.05），对比例1和2影响不显著（P >0.05），其中，实施例2和3对小鼠血清中LDH活性的影响更为明显。
表3.5对小鼠血清中BUN、LA及LDH含量的影响
注：与正常对照组相比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001
3.6组合物或制剂对游泳后小鼠血清中SOD、GSH-Px和ROS含量的影响
SOD是生物体内对抗氧自由基最重要的抗氧化酶，是衡量机体抗氧化能力的重要指标，能够防止机体由氧化应激所造成的损害，在机体的氧化与抗氧化平衡中起着至关重要的作用。GSH-Px能够促进H2O2的分解，保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰及损害。如表3.6所示，实施例1~3组及阳性对照组均能显著提高游泳后小鼠血清中SOD水平，与正常对照组相比，分别提高了25.6%（P < 0.05）、28.6%（P < 0.01）、32.1%（P < 0.01）和20.0%（P < 0.05）；实施例2、实施例3和阳性对照组显著提高了游泳后小鼠血清中GSH-Px含量，与正常对照组相比，分别提高了28.9%（P < 0.05）、33.7%（P < 0.01）和35.9%（P <0.01）；实施例1、2、3、阳性对照组及对比例1可以显著降低游泳后小鼠血清中ROS水平。综合上述实验发现，实施例1~3组的抗氧化活性优于对比例1和对比例2组，其中实施例3组的影响更为显著，效果最佳，表明本发明组合物或制剂在黑虎掌菌和黑松露菌科学配伍作用下能够显著提高游泳后小鼠的抗氧化能力，其协同作用大于两种原料单独作用之和。
表3.6对小鼠血清SOD、GSH-Px和ROS水平的影响
注：与正常对照组相比较，*P < 0.05，**P < 0.01
3.7组合物或制剂对游泳后小鼠肌糖原、肝糖原水平的影响
肌糖原的储备量和运动时的耐力呈正相关，肌糖原储备越多，能量供应越充足，耐力就越好；肝糖原的储备对于维持运动时的血糖水平有着重要意义，可以作为评价机体的抗疲劳指标。如表3.7所示，与正常对照组相比，实施例1~3组均能提高游泳后小鼠肌糖原和肝糖原水平，且效果优于对比例1和对比例2组单独作用之和，其中实施例3分别提高了55.7%（P < 0.01）和24.3%（P < 0.05）。
表3.7对小鼠肌糖原和肝糖原水平的影响
注：与正常对照组相比较，*P < 0.05，**P < 0.01
3.8组合物或制剂对游泳后小鼠血清中PROG、T和E2水平的影响
表3.8对小鼠血清中三种性激素水平的影响
注：与正常对照组相比较，*P < 0.05，**P < 0.01
睾酮能促使生***连续分化，刺激***的生成与成熟，并促进生殖器官发育、蛋白质合成及骨骼的生长。如表3.8所示，与正常对照组小鼠相比，实施例1~3提高了雄性小鼠血清中PROG和T水平，其中实施例3效果最显著（P < 0.05），并且实施例1~3组的提升效果明显优于对比例1和对比例2组，提示本发明组合物或制剂能够通过刺激雄性激素的分泌与合成，间接促进性器官的生长发育。血清中的T含量会随着年龄的逐渐衰老而减少，本发明组合物或制剂，特别是实施例3的这种作用将有助于延缓性器官的衰老，从而起到抗老化和生精壮阳之功效。
实验例1
将上述实施例1~3得到的组合物或制剂进行毒理学研究。
1急性毒性试验（采用MTD法）
1.1实验动物；SPF级昆明种小鼠，40只，体重18-22g，雌雄各半，购自吉林大学实验动物中心（许可证号：SCXK（吉）2017-0001）。实验动物使用遵照实验动物使用条例进行，动物饲养保证12h/12h光暗循环，温度为23±1℃，湿度50±10%，自由饮食、饮水。
1.2药品与试剂：取实施例1、2、3所制备的组合物或制剂，实验前用0.5%羧甲基纤维素钠溶解至0.2 g/mL药物浓度。
1.3方法与结果：每次灌胃量为0.6 ml/只，采用一天内每间隔6小时给予受试物一次，共灌胃两次，灌胃前小鼠禁食（不禁水）16 h，经口灌胃给予受试物3天，给药后连续观察14天。小鼠给药后14天内常规饲养未发生死亡和异常现象。证明本发明得到的实施例1~3的组合物或制剂无毒副作用，可安全使用。
2长期毒性试验
2.1实验动物：Wistar大鼠，120只，体重180-220g，雌雄各半，购自吉林大学实验动物中心（许可证号：SCXK（吉）2016-0003）。
2.2药品与试剂：取实施例3所制备的制剂，实验时用0.5%羧甲基纤维素钠溶解。
2.3分组及给药方法：实验动物按性别体重随机分为4组，每组30只。1组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠，0.2 ml/100g；2、3、4组灌胃给予受试药物，剂量分别为：25 mg/100g、50 mg/100g、100 mg/100g，即每100 g体重给予25 mg、50 mg或100 mg的生药量，各组浓度分别配置成0.2 ml/100g的灌胃剂量。以上各组连续服用6个月后安乐死。
2.4指标检测
2.4.1一般状况检测：体重、饮食、情绪、活动能量。
2.4.2血清生化检测：红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白计数、血清蛋白、胆固醇和血糖等。
2.4.3病理学检查：心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、胸腺、性腺等。
2.5实验结果表明，大鼠连续服用6个月实施例3制剂后，体重、饮食、情绪、活动能量等一般状况良好，各主要脏器及血清指标未见异常，证明实施例3制剂对机体无明显长期毒性作用。
实验例2
将本发明组合物或制剂进行临床人体试验
1.样品与分组
1.1样品：将实施例1的组合物、对比例1、对比例2和实施例2~3的散剂分别进行压片，各制得片剂1200片，另取淀粉制成的安慰剂1200片。将黑虎掌菌粉和黑松露菌粉按处方比例混合均匀，加入0.25%比例的硬脂酸镁混合均匀压制成1200片，即得片剂。
1.2方法：所有志愿者随机分为6组，每组12人，其中3个组分别服用上述3个实施例的样品片剂，2个组分别服用对比例1和对比例2样品的片剂，0.6 g/片，一次1片，一日3次。另有一组12人，口服等量的安慰剂。连续服用四周。
2.试验方法
2.1运动器材：动感单车
2.2运动试验：受试者在服用样品前、服用四周后，进行动感单车耐力试验测定，蹬踏时间设置为5min，蹬踏负荷量为5档，测定蹬踏运动前后的血乳酸值。并在服用终了时检测血尿酸的情况。
3.实验结果
3.1受试者分布情况
表1受试者年龄和性别分析
| 组别 | 人数 | 男 | 女 | 平均年龄 |
| 实施例1 | 12 | 6 | 6 | 30.2±1.9 |
| 实施例2 | 12 | 4 | 8 | 33.6±2.6 |
| 实施例3 | 12 | 5 | 7 | 32.5±2.2 |
| 对比例1 | 12 | 6 | 6 | 31.2±2.6 |
| 对比例2 | 12 | 5 | 7 | 32.3±2.0 |
| 安慰剂组 | 12 | 7 | 5 | 33.8±1.9 |
结果表明，3个实施例组、2个对比例组与安慰剂组组间性别分布及男女年龄无明显差异。
3.2服用四周后血尿酸值情况
表2受试者服用四周后血尿酸值(μmol/L)
| 组别 | 男性 | 女性 |
| 实施例1 | 364.0±79.5 | 220.8±54.2 |
| 实施例2 | 373.8±82.3 | 256.1±58.7 |
| 实施例3 | 377.2±68.6 | 237.5±66.0 |
| 对比例1 | 380.6±59.6 | 251.5±45.2 |
| 对比例2 | 379.5±62.8 | 232.8±39.7 |
| 安慰剂组 | 385.8±90.0 | 248.4±56.9 |
结果表明，服用不同制备工艺下3个实施例组、2个对比例组与安慰剂组相比，四周后血尿酸值无明显差异，表明本发明组合物或制剂不会引起体内尿酸代谢失调。
3.3受试者蹬踏运动前后测定血乳酸的差值，作为运动负荷后血乳酸的升高值。
表3受试者血乳酸升高改变情况(mmol/L)
| 组别 | 实验前血乳酸升高值 | 实验后血乳酸升高值 | 血乳酸升高改变值 |
| 实施例1 | 7.5±2.6 | 7.1±1.9 | -0.4±1.1 |
| 实施例2 | 7.9±1.8 | 7.6±2.4 | -0.3±1.8 |
| 实施例3 | 8.0±2.2 | 7.4±1.9 | -0.6±1.2 |
| 对比例1 | 7.7±1.6 | 7.6±1.8 | -0.1±1.5 |
| 对比例2 | 7.5±1.5 | 7.6±2.1 | 0.1±0.8 |
| 安慰剂组 | 7.6±3.0 | 7.7±2.8 | 0.1±0.9 |
实验结果显示，与安慰剂组相比，服用不同配方的本发明组合物可以显著降低受试者运动后血乳酸值的升高，增加机体的抗疲劳能力，其中实施例1~3组降低受试者运动后血乳酸值的程度明显高于对比例1和对比例2 组(P < 0.05)，且实施例3效果最佳。
动物耐力学实验以及生理生化指标结果显示，本发明组合物或制剂能够显著延长小鼠的耐力跑时间、转棒时间及负重游泳时间，提高游泳后小鼠血清中SOD、GSH-Px和LDH含量，降低血清中BUN、LA及ROS水平，增加肝糖原和肌糖原的储备量，提示本发明组合物或制剂具有调节机体能量代谢和较好的抗氧化能力。根据***颁布的中国《保健食品检验与评价技术规范》2003年版的规定，若一项以上含一项耐力运动实验（负重游泳和爬杆）和二项以上含二项生化标为阳性（血乳酸、血清尿素氮、肌糖原肝糖原等）为具有抗疲劳作用的判定标准。同时，临床人体试验结果显示，本发明组合物或制剂能够显著降低运动后人体血乳酸水平。此外，还能显著促进雄性小鼠血清中T和PROG的分泌，间接改善男性性功能缺陷。本发明的公开将是男性性功能不全患者寻找安全、有效的治疗药物的一种新的选择。综上所述，本发明组合物或制剂经黑虎掌菌和黑松露菌科学配伍组方后实现了运动耐力提升、缓解疲劳、抗氧化，延缓衰老，壮阳补肾之功效，其表现出的协同作用，不仅药效活性显优，还大大降低了原料成本，有利于工业化生产，特别适合疲劳人群及肾阳亏虚和早衰的男性服用。
Claims (2)
1.一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物，其特征在于由如下重量份的原料组成：
黑虎掌菌粉45-65份，黑松露菌粉35-45份。
2.如权利要求1所述的具有抗疲劳和壮阳功能的组合物的制备方法，按比例称取上述原料，加水煎煮1-3次，每次1-3小时，每次加入水的质量为组合物质量的8-12倍，得到煎煮液；将煎煮液合并，过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，混合粉按照常规的药物制备工艺制成药物制剂。
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|---|---|---|---|
| CN201811167554.5A CN109157548B (zh) | 2018-10-08 | 2018-10-08 | 一种具有抗疲劳和壮阳功能的组合物及制备方法 |
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