CN109154549B - 粒子检测方法和用于实施该粒子检测方法的*** - Google Patents

粒子检测方法和用于实施该粒子检测方法的*** Download PDF

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Abstract

本公开的方面包括用于检测流式细胞仪中的事件的方法。还提供了检测流式细胞仪中的细胞的方法。本公开的其他方面包括用于确定流动池中的污染水平的方法。还提供了例如用于实施以上概述的方法的计算机可读介质和***。

Description

粒子检测方法和用于实施该粒子检测方法的***
交叉引用
本申请要求2015年12月18日提交的美国临时专利申请No.62/269,294的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
多种方法用于细胞分析，包括通过光或荧光显微镜进行视觉和/或自动检查。为了获得关于样品中细胞谱系、成熟阶段、和/或细胞计数的信息，通常实施这些类型的细胞检查和分析。
流式细胞术是用于识别和区分非均质样品中不同细胞类型的方法。在流式细胞仪中，细胞一次一个或几乎一次一个地通过感测区域，其中每个细胞被能量源照射。通常，单波长光源(例如激光器等)被用作能量源，并且多种传感器中的一个或多个传感器基于细胞与施加的能量的相互作用而记录数据。流式细胞术常用于血液学，并在血液疾病(包括血癌)的诊断上已经是成功的。除流式细胞仪外，其他分析方法也用于血液学和表征细胞种群。
流式细胞术上的挑战包括捕获无噪声粒子事件(例如细胞事件)。例如，光学旁瓣、基线漂移、流体漂移和/或电子基线时间常数会产生类似于小细胞事件的不希望的信号。其他负面影响流式细胞术数据质量的因素包括样品之间有核细胞计数的变化，例如，其导致荧光信号的变化，使得细胞事件占据模数转换器(ADC)的非常小的动态范围。另外，流式细胞污染可能阻止流式细胞仪产生有效的临床结果。
发明内容
本公开的方面包括用于检测流式细胞仪中的事件的方法。这样的方法包括使粒子流动通过流式细胞仪的流动池、光学询问流动通过流动池的粒子、提取推定的事件的特征、以及将推定的事件标记时间戳。这样的方法进一步包括确定推定的先前事件和推定的当前事件之间的时间差并且将时间差与阈值持续时间进行比较。如果时间差大于阈值持续时间，则将推定的当前事件存储为当前事件。如果时间差小于阈值持续时间，则将推定的当前事件的峰高度特征和推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较。如果推定的当前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则将推定的当前事件丢弃。如果推定的先前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则丢弃推定的先前事件。如果推定的先前事件的峰高度特征大于阈值峰高度，则将推定的先前事件存储为先前事件。
还提供了检测流式细胞仪中的细胞的方法。这样的方法包括使细胞样品流动通过流式细胞仪的流动池，在第一增益设置下从流动通过流动池的细胞中检测光学信号，并且在第二增益设置下从流动通过流动池的细胞中检测光学信号。第二增益设置与第一增益设置不同。
本公开的其他方面包括用于确定流动池中污染水平的方法。这样的方法包括使包括粒子的样品流动通过流动池，在流动期间收集原始粒子事件数据，计数原始粒子事件数据内的粒子事件数量并且用逆高斯滤波器系数对原始粒子事件数据进行过滤以产生过滤的信号。逆高斯滤波器系数基于预期的功率谱方差。这样的方法还包括确定过滤的信号的能量，并且从确定的过滤的信号的能量中减去清洁流动池基线能量，以确定流动池中的污染水平。
还提供了例如用于实施本公开的方法的计算机可读介质和***。
附图说明
图1的A部分和B部分分别描绘了细胞粒子在被照射的流动池内的行进方式和卷积响应图。
图2描绘了示出理想的“清洁的”高斯响应的图。
图3描绘了示出基线漂移和不希望的细胞事件响应的图。
图4是根据本公开的一个实施方式的用于移除无效细胞事件信号的流程图。
图5描绘了示出由伪象污染血小板计数和浓度的图。
图6描绘了示出使用根据本公开的一个实施方式的方法实现的消除不希望的事件的图。
图7描绘了显示RBC和PLT事件的图。
图8描绘了图7中的图的放大部分。
图9描述了在单次测定过程中从PLT收集增益设置切换到RBC收集增益设置。
图10描绘了示出在整个测定期间在固定增益设置下进行计数的图。
图11描绘了示出在测定期间以动态增益调整进行计数的图。
图12是根据本公开的一个实施方式的用于确定流动池中的污染水平的流程图。
图13描述了理想的高斯脉冲的功率谱。
图14描绘了从流式细胞仪获得的功率谱。
图15描绘了逆高斯滤波器的频率响应。
图16描绘了高度污染的流动池的时域信号，其中基线噪声已从来自ADC的原始数据中去除。
图17描述了高度污染的流动池的频域特性(原始数据的功率谱)。
图18描绘了从高度污染的流动池的原始数据去除相当于清洁流动池的能量之后的原始数据的功率谱。
图19描绘了在污染早期阶段的流动池的时域信号，其中基线噪声已从来自ADC的原始数据中去除。
图20描述了在污染的早期阶段的流动池的频域特性(原始数据的功率谱)。
图21描述了在污染的早期阶段从流动池的原始数据去除相当于清洁流动池的能量之后的原始数据的功率谱。
图22描绘了未被污染的流动池的时域信号，其中基线噪声已从来自ADC的原始数据中去除。
图23描述了未被污染的流动池的频域特性(原始数据的功率谱)。
图24描绘了从未被污染的流动池的原始数据去除相当于清洁流动池的能量之后的原始数据的功率谱。
图25是根据一个实施方式的示例流式细胞仪的示意图，其可用于实施本公开的方法。
具体实施方式
本公开的方面包括用于检测流式细胞仪中的事件的方法。还提供了检测流式细胞仪中的细胞的方法。本公开的其他方面包括用于确定流动池中污染水平的方法。还提供了计算机可读介质和***，例如用于实施上面概述的方法。
在更详细地描述本方法、计算机可读介质和***之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方式，因而当然可以做出改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式，而不意图限制。
在提供一定范围的值的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则到下限的单位的十分之一并且在该范围的上限和下限之间的每个中间值、以及任何另外陈述的值或所陈述范围内的中间值包含在本发明的方法、计算机可读介质和***内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围内，并且也被包括在方法、计算机可读介质和***内，且受限于所陈述范围内的任何特别排除的限制。在所陈述范围包括一个或两个限制的情况下，排除前述所包括的限制中的一个或两个限制的范围也包括在方法、计算机可读介质和***中。
本文呈现的某些范围其数值之前是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及接近或近似于术语“约”后的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似具体列举的数字时，接近的或近似的未列举的数字可以是在其呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等同的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施或测试中也可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述代表性的说明性方法、计算机可读介质和***。
本说明书中引用的所有公开和专利均以引用的方式并入本文，如同每个单独的公开或专利被具体且单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的公开相关的方法和/或材料。任何公开的引用是虽然其公开在本申请日之前，但不应该被解释为承认本发明无权由于先前的发明而早于这些公开。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”、和“所述”包括复数参数，除非上下文另外明确指出。进一步指出，权利要求可以被撰写为排除任何可选元素。这样，该陈述意图作为与引用权利要求的元素相关的使用诸如“唯一”、“仅仅”等排他性术语或使用“负面的”限定的引用基础。
在阅读本公开后对于本领域技术人员将显而易见的是，本文中描述和示出的每个单独实施方式具有分立的部件和特征，其可以容易地与任何其他实施方式的特征相分离或相组合而不背离本方法、计算机可读介质、和***的范围或精神。任何记载的方法都可以按照记载的事件顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来执行。
方法
如上所概述的，本公开的各方面包括用于检测流式细胞仪中的事件的方法。由于诸如光学旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染之类的现象，捕获无噪声的细胞事件变得困难。这些现象产生类似小细胞事件的不希望的信号。这些不希望的信号通常在生成较大的有效信号之前和/或之后生成。这些错误捕获的不希望的信号会污染有效细胞事件(例如，小细胞事件)的特征提取。
如图1的A部分所示，细胞粒子在被照射的流动池内行进。在细胞粒子在被照射的体积内行进的过程中，光检测器捕获激光束分布和细胞粒子的卷积响应。卷积响应如图1的B部分所示。
Figure BDA0001737130870000051
数字数据捕获***可以数字化该细胞事件响应，例如以每秒20兆个样品的速率进行数字化。细胞事件响应的宽度取决于流速和激光束分布的高度。该细胞事件响应生成近似高斯波形，其可以表征为：
Figure BDA0001737130870000061
参数μ是标准分布的平均值，σ是标准偏差(尽管由平均值和标准偏差表征的正态统计分布在性质上是高斯的，但是高斯信号脉冲不是统计的)。该分布的方差(σ2)取决于流动池中的流速。只要流动池中的鞘层压力(以及因此流速)几乎恒定，分布的脉冲宽度(1/e2点处的持续时间)就是几乎恒定的。
在血液学分析过程中，血小板(PLT)是存在较大网织红细胞和白细胞时能检测到的最小的细胞类型。为了准确计数血小板，必须将血小板与不希望的噪声样细胞事件区分开来。光学旁瓣、流体基线漂移等会产生类似于有效的细胞事件响应的不希望的信号。较大的细胞事件的时间接近度负面影响有效的小细胞(例如血小板)事件直方图。本发明人已经发现，可以通过使用添加高分辨率时间戳(其在提取每个细胞事件的特征的同时添加)来检测和去除由光学旁瓣、流体基线漂移等产生的伪象。发明人已经发现，通过针对每个提取的细胞事件使用高分辨率时间戳，可以在较大的细胞事件附近隔离小振幅事件。根据本公开的方法的特征提取使得能够从脉冲宽度确定邻近事件是有效的细胞(例如血小板)事件或是从光学***旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染和/或类似情况产生的信号。
根据某些实施方式，用于检测流式细胞仪中的事件的方法包括使粒子流动通过流式细胞仪的流动池、光学询问流动通过流动池的粒子、提取推定的事件的特征、以及标记推定的事件的时间戳。这样的方法进一步包括确定推定的先前事件和推定的当前事件之间的时间差并且将该时间差与阈值持续时间进行比较。如果时间差大于阈值持续时间，则将推定的当前事件存储为当前事件。如果时间差小于阈值持续时间，则将推定的当前事件的峰高度特征和推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较。如果推定的当前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则将推定的当前事件丢弃。如果推定的先前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则将推定的先前事件丢弃。如果推定的先前事件的峰高度特征大于阈值峰高度，则将推定的先前事件存储为先前事件。
“事件”是指粒子(例如细胞)通过流动池的询问区，如通过光学询问***检测到的。“推定的事件”是指可能由事件产生或不由事件产生的类似于事件的光学信号。本公开的方法使得能够确定推定的事件是否确实是事件，或者推定的事件是否来自类似于有效细胞事件响应但实际上不是有效细胞事件响应的信号，例如来自光学旁瓣、流体基线漂移等的信号。这样，在主题方法的某些方面，事件与从光学***旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染及其组合中选择的信号不同。
流速是鞘层压力、流体粘度和流动池尺寸的函数。在某些方面，使细胞流动通过流动池包括使细胞在9psi或更大(例如9psi、10psi或更大、11psi或更大、12psi或更大、13psi或更大、14psi或更大、15psi或更大等)的鞘层压力下流动。根据某些实施方式，激光器的光束高度为5μm或更大，例如5μm、6μm或更大、7μm或更大、8μm或更大、9μm或更大、10μm或更大、15μm或更大、或20μm或更大。
粒子(例如细胞)与激光束高度卷积以产生事件分布。当鞘层压力约为12psi并且激光束高度约为8μm时，该事件分布除以流速产生约2μs宽的高斯脉冲。理想的(“清洁的”)高斯响应如图2中所描绘的。在理想条件下，主高斯粒子分布附近不存在不希望的信号。然而，实际上，诸如光学旁瓣、流体漂移、基线漂移等的现象在主高斯粒子分布附近产生不希望的信号。作为示例，图3示出了由基线漂移产生的主高斯粒子分布附近的信号。本发明人已经发现，通过根据本公开的方法处理粒子特征提取，确定推定的事件是事件(例如，细胞(例如，血小板)通过流动池)还是非事件是可能的。
根据某些实施方式，阈值持续时间是2.5μs或更少，例如2μs。在某些方面，将推定的当前粒子事件的峰高度特征与推定的先前粒子事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较包括确定推定的当前细胞事件和推定的先前细胞事件的峰高度是否小于阈值峰高度的2倍。
在某些方面，粒子是微粒，诸如其中具有掺入的荧光部分的微粒，或者其表面具有直接或间接附着的荧光部分的微粒。“微粒”是指最大尺寸在0.001μm至1000μm的范围内的粒子(其不是细胞)，诸如0.5μm至100μm，例如0.1μm至20μm。在某些方面，微粒的最大尺寸为20μm或更小，诸如15μm或更小、10μm或更小、5μm或更小、1μm或更小、0.75μm或更小、0.5μm或更小、0.4μm或更小、0.3μm或更小、0.2μm或更小、0.1μm或更小、0.01μm或更小、或者0.001μm或更小。
微粒可具有任何合适的形状，包括但不限于球形、椭球形、棒形、盘形、金字塔形、立方体形、圆柱形、纳米螺旋形、纳米弹簧形、纳米环形、箭形、泪珠形、四角形、棱柱形、或任何其他合适的几何或非几何形状。
微粒可由任何合适的材料制成，包括但不限于胶乳、聚苯乙烯、二氧化硅、磁性材料、顺磁材料、或其任何组合。
根据某些实施方式，粒子是细胞并且事件是细胞事件。细胞可以存在于感兴趣的细胞样品中，包括但不限于血液样品(例如，全血样品或其部分)、脑脊髓液样品、腹膜液样品、心包液样品、胸膜液样品、滑液样品、尿样品、唾液样品、泪液样品、***样品、羊水样品、痰样品等，以及从囊肿、肿瘤等获得的样品。根据某些实施方式，细胞事件是小细胞事件。例如，细胞事件可以是血小板事件，例如，在较大细胞事件的高斯分布(诸如白细胞(WBC)事件的高斯分布)的附近。可以通过本公开的方法确定的其他小细胞事件包括微生物细胞事件。感兴趣的微生物包括细菌、古细菌、原生动物、真菌、藻类等。根据某些实施方式，小细胞事件是细胞碎片事件。
在下面的实验部分的实施例1中提供了用于检测流式细胞仪中的事件的示例方法以及其在获得用于事件(诸如血小板事件)的清洁事件直方图中的用途。
如上所概述的，本公开还提供了用于检测流式细胞仪中的细胞的方法。这样的方法包括使细胞样品(其包括多个细胞)流动通过流式细胞仪的流动池，在第一增益设置下从流动通过流动池的细胞中检测光学信号，并且在第二增益设置下从流动通过流动池的细胞中检测光学信号。第二增益设置与第一增益设置不同。
采用第一和第二增益设置的方法有各种用途。例如，本发明人已经发现，在流式细胞术测定期间改变光电信号的增益使得可以使用模数转换器(ADC)的整个动态范围。这提高了模数转换的信噪比(SNR)和分辨率。可以采用光电信号的最佳增益设置来增加群集中的距离度量并提供更好的区分。
采用至少第一和第二增益设置的本方法的第一特定有用的示例应用是用于检测细胞样品(例如，体液样品)中的细胞，细胞样品表现出样品之间的细胞计数显着变化(例如5至500万)。通常在在将细胞样品注入流动流之前在测定中加入固定量的荧光染料。该固定量基于样品中预期的中间期望细胞事件来选择。如果样品具有比正常有核细胞更大的量，则染料浓度可能不足以染色更多数量的细胞。由此导致的弱染色产生次最佳的荧光学信号，并且细胞事件信号仅占ADC的动态范围的一小部分。通过在初始数据捕获之后改变增益设置(例如，光电二极管和/或光电倍增管的增益设置)，可以设置增益以使得所有光传感器信号占据ADC的全部动态范围。利用这种全ADC分辨率，本发明人已经发现区分多种细胞类型变得更容易。
在数据捕获的初始数据周期内，可以使用默认增益设置来收集光传感器信号。可以在几毫秒内计算出有效使用ADC完整动态范围的最佳增益设置。修改后的增益设置可应用于测定的剩余期间，提供更好的ADC信噪比并充分利用ADC的动态范围。下面的实验部分的实施例2中提供了采用第一和第二增益设置的示例方法。
采用至少第一和第二增益设置的本方法的第二特定有用的示例应用是用于对非均质细胞样品(例如，血液样品)中的不同类型的细胞进行计数，其中不同细胞类型产生不同强度的流式细胞术信号。举例来说，这些方法可用于在第一(较低)增益设置下捕获血小板事件，并且在第二(较高)增益设置下捕获红细胞(RBC)事件，如图9示意性所示。在图9中所示的示例实施方式中，PLT收集在第一增益设置下持续发生一段时间(在该示例中为1.8秒)，然后RBC收集在第二增益设置下随后持续发生一段时间(在该示例中为1.7秒)。以这种方式，可以在第一“模式”(例如，PLT模式)中执行测定，然后切换到第二“模式”(例如，RBC模式)，其中根据增益设置，第一和第二模式不同。可以运行PLT模式以捕获PLT细胞事件的细节，诸如PLT浓度的低端、血小板分布宽度(PDW)和/或平均血小板体积(MPV)。一旦PLT数据被捕获，为了收集RBC细胞事件而最佳地降低增益设置，使得RBC细胞占据ADC的全部动态范围。在捕获红细胞数据时，PLT浓度和细胞计数结果是可用的。当血液样品显示PLT计数有极低端时，增益设置可以被设置回(增加)以捕获更多的PLT细胞事件，这对于统计相关性可能是必需的。
因此，采用至少第一和第二增益设置的方法的方面包括分析在第一增益设置下检测到的光学信号以检测第一细胞类型，并且分析在第二增益设置下检测到的光学信号以检测第二细胞类型。
当实施采用第一和第二增益设置的本方法时，例如，当确定细胞事件信号强度小于最佳强度时(例如，为了考虑比正常细胞浓度高的细胞样品)，第二增益设置可以大于第一增益设置。在某些方面，例如，当确定细胞事件信号强度大于最佳强度时(例如，为了考虑比正常细胞浓度低的细胞样品)，第二增益设置可以小于第一增益设置。
根据某些实施方式，第一和第二增益设置独立地包括光电二极管增益设置、光电倍增管(PMT)增益设置，或这两者。
应当理解，虽然方法包括第一和第二增益设置，但是方法可以采用多个增益设置，如对于多种细胞事件(例如，对应于各种细胞类型等)的最佳收集可能希望的那样。例如，在用于多种细胞事件的最佳收集的测定期间可以使用2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、或10个或更多的不同的增益设置。
在第一增益设置下检测光信号可以与在第二增益设置下检测光信号的持续时间相同。在其他方面，在第一增益设置下检测光信号的持续时间与在第二增益设置下检测光信号的持续时间不同。根据某些实施方式，在第一和第二增益设置下检测光学信号的持续时间独立地选自0.1至10秒(例如0.5至5秒)。
在某些方面，流式细胞计数测定在第一增益设置下运行初始持续时间，然后以改进的(例如最佳)第二增益设置运行该测定的剩余持续时间(其可能比初始持续时间更长)。可以基于在第一增益设置下运行的初始持续期间收集的信号(例如，信号强度)来确定改进的增益设置。
如以上所概述，本公开还提供了用于确定流动池中的污染水平的方法。“流动池中的污染”或“流动池污染”是指流动池内壁上的沉积(例如，细胞碎片、蛋白质、和/或类似物)。当这些沉积发生时，通过流动池的光路变得混浊，扭曲激光束并改变多种散射/荧光信号的强度。
这样的方法包括使样品(其包括粒子)流动通过流动池，在流动期间收集原始粒子事件数据，并且计数原始粒子事件数据内的粒子事件的数量。该方法还包括用逆高斯滤波器系数对原始粒子事件数据进行过滤以产生过滤的信号，其中逆高斯滤波器系数基于预期功率谱方差。该方法进一步包括确定过滤的信号的能量(其与流动池中的污染和原始粒子事件数据中的细胞事件的数量成比例)以及从所确定的过滤的信号的能量中减去清洁流动池基线能量，以确定流动池中的污染水平。根据某些实施方式，在流动期间收集原始粒子事件数据之后，将低于阈值的原始数据值替换为零。在某些方面，从所确定的过滤的信号的能量中减去清洁流动池基线能量而得到的值基于事件的数量来缩放。
方法可用于确定流动池中的污染水平。根据某些实施方式，方法的应用是用于检测流动池污染的早期阶段。方法的一个特征是其允许检测流动池污染，从而免除了在流式细胞仪中运行标准(例如，标准参考粒子(SRP))以检测流动池污染的需要。
受污染的流动池产生多于一个的反射，因此引起粒子(例如细胞)事件响应的涂片(smear)、与粒子事件响应的重叠并增加粒子事件响应的失真。流动池污染产生的附加信号会使原始信号失真，并在细胞事件谱内产生更高频率的分量。本发明人已经发现，可以通过分析频域中的粒子事件响应并评估高频分量的能量来检测流动池污染的早期阶段。
参考上述表征由细胞事件响应产生的高斯波形的公式，参数μ取决于基线波动。基线波动可能源于外部干扰、激光噪声、暗电流和/或***电子器件中的缺陷。基线恢复(BLR)电路将基线保持在DC。可以通过模拟BLR电路或减去数字域中的DC偏移而消除DC偏移从而使参数μ变为零。因为参数μ可以变为零并且对于所有粒子事件的时域分布而言方差是恒定的，所以将该时域信号变换到恒定频域谱是可能的。信号的频域特性对于所有与细胞尺寸有关的细胞事件显示相同的谱。因此可以利用这个特性来避免运行标准参考粒子(SRP)。
通过去除清洁流动池积聚的谱中的能量来促进精确确定由流动池污染导致的高频谱的能量变化。根据本方法，计算逆高斯滤波器或高通频率滤波器，由此为清洁流动池事件逆转功率谱。由于可以以高分辨率(例如，16比特和10MSPS)捕获完整的波形，所以数字过滤在性质上为高斯的能量是可行的。模拟或数字形式的有限脉冲响应(FIR)或无限脉冲响应(IIR)滤波器都可以实现滤出这种能量。
根据某些实施方式，使用数字FIR滤波器来去除清洁流动池产生的能量。FIR滤波器的实现可以按照下面的公式进行：
y[n]＝b0x[n]+b1x[n-1]+…+bNx[n-N]
用于在数字域实现FIR滤波器的公式具有b0、b1、b2、b3……bn系数，它们是根据谱的逆算出的，x(n)是数字化的原始数据信号。y(n)是滤波器的数字输出信号。可以进一步修改系数(b0、b1、b2、b3……bn)以去除清洁细胞事件产生的精确能量。
通过去除信号中的正常(清洁)能量，可以计算信号的多次反射和失真的额外能量。高频分量的能量测量指示流动池中污染的顺序。
根据某些实施方式，计数粒子事件的数量包括从模数转换器提取固定时间间隔的原始数据、确定DC偏移，以及用零替换低于固定阈值的原始数据。在某些方面，阈值是全动态范围的1％至5％，或者阈值是峰值幅度的1/e2。
在某些方面，样品流入流动池内的鞘层流体的流中，并且预期的功率谱方差基于鞘层流体的压力。根据某些实施方案，粒子是细胞。例如，样品可以是血液样品，并且粒子是血细胞。
根据本公开的一个实施方式的用于确定流动池中的污染水平的方法的流程图在图12中提供。在该示例中，固定时间间隔的原始数据从模数转换器(ADC)提取。计算ADC偏移。低于固定阈值(例如，全动态范围的3％或峰值幅度的1/e2)的原始数据被替换为零。计算具有原始数据的细胞事件的数量。然后用预先确定的系数对原始数据进行过滤，然后计算过滤的信号的能量。基于细胞事件的数量去除清洁流动池的基线能量。剩余的能量可以被缩放以确定污染程度。
在下面的实验部分的实施例3中描述了用于确定流动池中污染水平的示例方法。
当流动池开始被污染时，细胞事件的特征计算(例如峰高度、宽度和较高时刻)开始变得无效，这产生错误的报告，例如血液报告。根据现有的方法，除非按预定的时间间隔清洁流动池或者运行涉及标准参考粒子(SRP)的诊断模式，否则不可能检测出错误的血液结果。本公开的方法使得检测流动池污染的早期阶段变得可能，由此能够避免错误的血液结果并且不再需要以涉及昂贵的SRP珠粒的特殊模式来操作流式细胞仪。另外，由于方法能够检测流动池污染的非常早期阶段，因此废弃的样品被最小化。此外，不需要比必需更频繁地清洁(例如漂白)***，由此增加了***中管道的使用寿命。
计算机可读介质和***
如上所概述的，本公开还提供了计算机可读介质和***，例如其可用于实施本公开的方法。
本公开的非瞬时计算机可读介质包括但不限于盘(例如，磁盘或光盘)、固态存储驱动器、卡、带、磁鼓、穿孔卡、条形码和磁墨水字符、以及可以用于存储表示、指令、和/或其它类似物的介质。
在某些方面，提供了可用于实施上文所述的用于检测流式细胞仪中的事件的方法的非瞬时计算机可读介质。根据某些实施方式，这种非瞬时计算机可读介质包括指令，当由计算设备(例如，流式细胞仪的计算设备)执行该指令时使得计算设备从流动通过流动池的粒子提取推定的事件的特征、给推定的事件标记时间戳、确定推定的先前事件与推定的当前事件之间的时间差、以及将时间差与阈值持续时间进行比较。如果时间差大于阈值持续时间，则指令使计算设备将推定的当前事件存储为当前事件。如果时间差小于阈值持续时间，则指令使计算设备将推定的当前事件的峰高度特征和推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较。如果推定的当前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则指令使计算设备丢弃推定的当前事件。如果推定的先前事件的峰高度特征小于阈值峰高度，则指令使计算设备丢弃推定的先前事件。如果推定的先前事件的峰高度特征大于阈值峰高度，则指令使计算设备将推定的先前事件存储为先前事件。在某些方面，事件与选自光学***旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染、及其组合的信号区分开。根据某些实施方式，粒子是细胞，从而事件是细胞事件。感兴趣的细胞事件包括例如小细胞事件。小细胞事件可以是血小板事件、微生物细胞事件、细胞碎片事件、和/或类似事件。
在某些方面，提供了可用于实施用于检测流式细胞仪中的细胞的上述方法的非瞬时计算机可读介质。根据某些实施方式，这样的非瞬时计算机可读介质包括指令，当该指令由计算设备(例如，流式细胞仪的计算设备)执行时使计算设备在第一增益设置下从流动通过流动池的细胞样品的细胞中检测光学信号，将增益设置从第一增益设置改变为第二增益设置，并且在第二增益设置下从流动通过流动池的细胞中检测光学信号。第二增益设置与第一增益设置不同。例如，第二增益设置可以大于第一增益设置(例如，为了考虑具有高细胞浓度的细胞样品，或者为了检测通常表现出较弱信号强度的细胞类型)。在其他方面，第二增益设置小于第一增益设置(例如，为了考虑具有低细胞浓度的细胞样品，或者为了检测通常表现出强信号强度的细胞类型)。第一和第二增益设置可以包括光电二极管增益设置、光电倍增管(PMT)增益设置，或这二者。根据某些实施方式，第一增益设置高于第二增益设置，在第一增益设置下检测血小板并且在第二增益设置下检测红细胞(RBC)。在第一增益设置下检测光学信号可以与在第二增益设置下检测光学信号具有相同或不同的持续时间。在某些方面，在第一和第二增益设置下检测光学信号的持续时间独立地选自0.1至10秒(例如0.5至5秒)。
在某些方面，提供了用于实施用于确定流动池中的污染水平的上述方法的非瞬时计算机可读介质。根据某些实施方式，这样的非瞬时计算机可读介质包括指令，当该指令由计算设备(例如，流式细胞仪的计算设备)执行时使计算设备随着包括粒子的样品流动通过流动池而收集原始粒子数据，计数原始粒子事件数据内的粒子事件的数量，并且用逆高斯滤波器系数对原始粒子事件数据进行过滤以产生过滤的信号。逆高斯滤波器系数基于期望的功率谱方差。指令进一步使计算设备确定经过滤的信号的能量，并且从所确定的过滤的信号的能量中减去清洁流动池基线能量，以确定流动池中的污染水平。在某些方面，计数粒子事件的数量包括从模数转换器提取固定时间间隔的原始数据、确定DC偏移、以及用零替换低于固定阈值的原始数据。根据某些实施方式，阈值是全动态范围的1％到5％，或者阈值是峰值幅度的1/e2。在某些方面，预期的功率谱方差基于鞘层流体的压力。根据某些实施方式，粒子是细胞。例如，细胞可以是血液样品的细胞。
本公开还提供了适于执行本公开的任何方法的***(例如，流式细胞术***，其可以是自动血液学***的子***)。这样的***可以包括任何上述非瞬时计算机可读介质。
在某些方面，本公开的***是流式细胞仪。这样的***包括流动池、定位成激发流动通过流动池的感兴趣的样品(例如，血液样品)的粒子的激发源、以及用于检测从激发的粒子发射的光学信号的一个或多个检测器。图25中示意性地示出了可以包括任何上述非瞬时计算机可读介质并适合于实施本公开的方法的流式细胞仪的示例。流式细胞仪10包括光源12、用于弯曲光束的前镜14和后镜16、包含第一柱面透镜20和第二柱面透镜22的光束扩展器模块18、聚焦透镜24、光束微调器26、流动池28、前向散射透镜30、靶心式检测器32、第一光电倍增管34、第二光电倍增管36、和第三光电倍增管38。靶心式检测器32具有用于0°光散射的内检测器32a和用于7°光散射的外检测器32b。
在某些方面，光源是激光器。然而，可以使用其他光源，例如灯(例如汞、氙)。光源12可以是垂直偏振的空气冷却相干立方体激光器，其可以从加利福尼亚州圣克拉拉的Coherent公司商购获得。可以使用波长范围从350nm到700nm的激光器。激光器的操作条件与目前用于“CELL-DYN”自动血液分析仪的激光器的操作条件基本相似。
与流动池、透镜、聚焦透镜、光束微调机构和激光聚焦透镜有关的其他细节可以在美国专利No.5,631,165(其通过引用并入本文)中找到，特别是在第41栏第32行至第43栏第11行。图2所示的前向光路***包括位于透镜的后焦面中的球面平凸透镜30和双元件光电二极管检测器32。在该配置中，双元件光电二极管检测器32内的每个点映射到来自移动通过流动池28的细胞的光的特定收集角。检测器32可以是能够检测轴向光损失(ALL)和中间角度前向散射(IAS)的靶心式检测器。美国专利No.5,631,165在第43栏第12-52行描述了该检测器的多种替代方案。
第一光电倍增管34(PMT1)测量消偏侧散射(DSS)。取决于所选的荧光染料和所使用的光源，第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧散射(PSS)，并且第三光电倍增管38(PMT3)测量从440nm到680nm的荧光发射。光电倍增管收集广泛波长范围内的荧光信号以增加信号的强度。通过二向色分束器40和42将侧向散射和荧光发射引导至这些光电倍增管，二向色分束器40和42以所需波长高效地执行传输和反射以实现高效检测。美国专利No.5,631,165与在第43栏第53行至第44栏第4行描述了与光电倍增管有关的各种附加细节。
当使用浸没收集***测量荧光时，光电倍增管34、36和38的灵敏度增强。浸没收集***是通过折射率匹配层将第一透镜30光学耦合到流动池28的***，以使得能够在广角上收集光。美国专利No.5,631,165在第44栏第5-31行描述了该光学***的各种附加细节。
聚光器44是一种光学透镜***，其像差校正足以用于高分辨率显微镜中的衍射极限成像。美国专利No.5,631,165在第44栏第32-60行描述了该光学***的各种附加细节。
在美国专利No.5,631,165的第44栏第63行至第45栏第26行中描述了图25中所示的其他部件的功能，所述其他部件即狭缝46、场透镜48、和第二狭缝50。在美国专利No.5,631,165中第44栏第63行至第45栏第26行也描述了***到光电倍增管的光路中以改变所检测光的波长或偏振或者其二者的光学滤波器52或56以及偏振器52或56。适用于本文的光学滤波器包括带通滤波器和长通滤波器。
光电倍增管34、36和38检测侧向散射(圆锥中散射的其轴线与入射激光光束大致垂直的光)或荧光(从细胞发射并与入射激光光束波长不同的光)。
尽管上面引用了美国专利No.5,631,165的选择部分，但是美国专利No.5,631,165通过引用整体并入本文。根据某些实施方式，本公开的流式细胞仪使用雪崩光电二极管(APD)作为光传感器。
以下实施例是以说明而非限制的方式提供的。
实验
实施例1：去除不希望的细胞事件信号以进行事件检测
在该事件检测的实施例中，粒子是细胞，不希望的细胞事件信号被移除以获得清洁的血小板(PLT)细胞直方图。
图4示出了该实施例中使用的方法的流程图。在触发通道上以每秒2千万个样品的分辨率从模数转换器(ADC)采集样品。在样品采集和减去基线恢复(BLR)值之后，提取细胞事件的特征并加上时间戳。如果脉冲宽度大于3μs，则丢弃当前细胞事件。如果脉冲宽度小于3μs，则计算先前和当前事件之间的时间差。如果先前和当前细胞事件之间的时间差大于2μs，则保存当前事件并提取时间戳。如果当前事件的峰高度特征小于阈值的2倍，则丢弃当前事件。如果当前事件的峰高度特征不小于阈值的2倍并且先前事件的峰高度特征小于阈值的2倍，则丢弃先前事件。如果当前事件的峰高度特征不小于阈值的2倍，并且先前事件的峰高度特征不小于阈值的2倍，则将先前事件和时间戳写入列表模式文档。上述过程一直进行到数据收集期结束。
该用于获得清洁血小板(PLT)细胞直方图的示例性方法的用途在图5-8中示出。图5示出了更接近振幅轴上的原点的PLT群的污染。图7示出了PLT群的污染在PSS侧向散射通道中非常明显。在图7中，无效事件以不同颜色清晰示出。这些事件不是PLT细胞事件，而是由光学伪像、APD热效应、流体漂移或电子基线噪声产生的无效事件。图6是该算法的输出，用于实现PLT细胞群的清洁对数正态分布。在该实施例中，以1:250稀释样品，注射速度为2.9μL/s。
实施例2：通过动态调整光学增益来改善对细胞事件的捕获
在该实施例中，数字数据捕获子***跟踪细胞事件计数以及测定的持续时间。在测定中的预定时间处，如果数据捕获***确定某些细胞事件信号(例如，来自细胞事件的前向和散射光)低于预期值，则增加光电信号的可变增益设置。如果数据捕获子***在测定开始时的固定时间量(～300ms)内发现相比于不饱和细胞事件较多的饱和细胞事件，则减少光电信号的可变增益设置。
在没有动态增益调节的情况下的细胞事件图在图10中示出。其中在测定期间使用动态增益调节的细胞事件的图在图11中示出。在图10和图11中，上图和下图分别是PSS/ALL和PSS/DSS。
图10和图11示出了动态增益调节的有益效果，尤其是在体液模式或在其中基于平均细胞计数期望而固定测定的染料量的任何测定中。该方法解决了细胞核中染料渗透变化的问题，尤其是当测定中有核细胞的数量比预期显着更多或更少时。图10示出了当在测定中存在比预期更多的细胞时的效果。由于不是所有的细胞均被染色并且由于细胞群之间的集群距离很小，因此很难区分细胞群。图11示出了这里描述的涉及可变增益调整的方法促进分离散点图中的细胞群集群。图11示出了有核细胞超过预期并且固定量的染料不足以染色所有有核细胞的情况。相反，当有核细胞比预期少得多时，固定量的染料会污染细胞核和血浆，从而使光传感器上的细胞事件响应饱和。饱和信号不会承载用于集群分离的任何附加信息，因此非常希望在测定活跃时动态减少增益。
该方法的另一个优点是将一个测定以两个或更多个预先确定的增益设置分离。图9示出了RBC测定被分成两组以实现更好的PLT细胞群特征的提取。它表明可以以较大的增益设置提取小细胞事件，并且可以以较小的增益设置提取较大细胞事件。以这种方式，可以利用模数转换器电子器件的完整动态范围。
可以在测定运行期间动态地做出决定并且增益可以在几十毫秒内调整和稳定而不会影响数据的完整性。
实施例3：通过分析频域中的细胞事件响应和高频分量的能量来检测早期流动池 污染
理论上理想的高斯脉冲在10MSPS的情况下在2毫秒期间占据1.75MHz带宽。替代使用理论值，通过从具有现有的电子元件的清洁流动池获取实验数据来计算出带宽。实验数据表明，清洁流动池中的感兴趣的带宽约为1.65MHz，因此非常接近理论值。理想的高斯脉冲的功率谱和从清洁流动池获得的实验数据的功率谱分别在图13和图14中示出。
高斯脉冲表示清洁的细胞事件信号。流动池中的污染在细胞事件信号中增加了更多能量。在频域中计算高斯频谱的逆响应以减去表示清洁流动池的细胞事件的能量。细胞事件中的剩余能量与流动池中的污染成正比。谱的有效归一化取决于***本底噪声。当本底噪声足够低(例如，小于全动态范围的1％)时，功率谱可以容易地归一化为细胞振幅。
根据原始数据，基于门控峰来计数细胞事件的数量。一旦峰被识别，原始数据首先被定位到阈值以消除基线噪声。然后，使用逆高斯滤波器仅对细胞事件的原始数据进行过滤。在图15中描绘了逆高斯滤波器的频率响应图。
逆高斯滤波器的输出指示来自流动池污染的任何能量。为了精确测量污染的影响，减去清洁流动池事件的剩余能量。最终值是归因于流动池的多次反射的剩余能量的极好指示。
从高度污染的流动池获得的数据如图16-18所示。图16示出了高度污染的流动池的时域信号，其中基线噪声已经从ADC的原始数据中去除(阶段1)。图17示出了高度污染的流动池(原始数据的功率谱)的频域特性(阶段2)。图18示出了在去除与清洁流动池相当的能量后的原始数据的功率谱。在该实施例中，高能量(-8dB/Hz)表示高水平的污染。
图19-21示出了在污染早期阶段从流动池获得的数据。图19示出了在污染早期阶段流动池的时域信号，其中基线噪声从ADC的原始数据中去除。图20示出了污染早期阶段的流动池的频域特性(原始数据的功率谱)。图21示出了去除与清洁流动池相当的能量之后的原始数据的功率谱。在该实施例中，较低的能量(-24dB/Hz)表示污染的早期阶段。
从未被污染的流动池获得的数据在图22-24中示出。图22示出了未被污染的流动池的时域信号，其中基线噪声从ADC的原始数据去除。图23示出了未被污染的流动池的频域特性(原始数据的功率谱)。图24显示了去除相当于清洁流动池的能量后的原始数据的功率谱。低能量(-32dB/Hz)表明流动池未被污染。
尽管出于清楚理解的目的已经通过举例说明和示例详细描述了本发明，但鉴于本发明的教导，对本领域普通技术人员显而易见的是，可以对本发明做出某些改变和修改，而不脱离所附权利要求的精神或范围。
因此，上文仅仅说明了本发明的原理。应该理解，本领域技术人员将能够设计出多种布置，尽管这样的布置没有在这里明确地描述或示出，但其体现了本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文记载的所有示例和条件性语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和发明人为推进现有技术而贡献的构思，并且应被解释为不限于这些具体描述的示例和条件。此外，本文记载的本发明的原理、方面、和实施方式以及其具体实施例的所有陈述意图涵盖其结构和功能的等同。另外，这样的等同意图包括当前已知的等同和未来所发展的等同，即，发展的任何执行相同功能的元件，而不论结构如何。因此，本发明的范围不意图限于在此示出和描述的示例性实施方式。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。

Claims (23)

1.一种用于检测流式细胞仪中的事件的方法，包括：
使粒子流动通过分析器的流动池；
光学询问流动通过所述流动池的所述粒子；
提取推定的事件的特征；
将推定的事件标记时间戳；
确定推定的先前事件和推定的当前事件之间的时间差；
将所述时间差与阈值持续时间进行比较，其中：
如果所述时间差大于所述阈值持续时间，则将所述推定的当前事件存储为当前事件；并且
如果所述时间差小于所述阈值持续时间，则将所述推定的当前事件的峰高度特征和所述推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较，其中：
如果所述推定的当前事件的所述峰高度特征小于所述阈值峰高度，则丢弃所述推定的当前事件；并且
如果所述推定的先前事件的所述峰高度特征大于所述阈值峰高度，则将所述推定的先前事件存储为先前事件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中事件与选自由以下组成的组中的信号区分开：光学***旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染，以及其组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述粒子是细胞并且事件是细胞事件。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞来自血液样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞事件是小细胞事件。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述小细胞事件是血小板事件。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述小细胞事件是微生物细胞事件或细胞碎片事件。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使粒子流动通过所述流动池包括使所述粒子在9psi或更大的鞘层压力下流动。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中光学询问所述粒子包括使用激光器激发细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述激光器的光束高度为5μm或更大。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述激光器的光束高度为8μm。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述阈值持续时间为2.5μs或更小。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述阈值持续时间为2μs。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中将所述推定的当前事件的峰高度特征和所述推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较包括确定所述推定的当前事件的所述峰高度和推定的先前事件的所述峰高度是否小于阈值峰高度的2倍。
15.一种存储有指令的非瞬时计算机可读介质，当所述指令由计算设备执行时使所述计算设备：
从流动通过流动池的粒子提取推定的事件的特征；
将推定的事件标记时间戳；
确定推定的先前事件和推定的当前事件之间的时间差；
将所述时间差与阈值持续时间进行比较，其中：
如果所述时间差大于所述阈值持续时间，则将所述推定的当前事件存储为当前事件；并且
如果所述时间差小于所述阈值持续时间，则将所述推定的当前事件的峰高度特征和所述推定的先前事件的峰高度特征与阈值峰高度进行比较，其中：
如果所述推定的当前事件的所述峰高度特征小于所述阈值峰高度，则丢弃所述推定的当前事件；并且
如果所述推定的先前事件的峰高度特征大于所述阈值峰高度，则将所述推定的先前事件存储为先前事件。
16.根据权利要求15所述的非瞬时计算机可读介质，其中事件与选自由以下组成的组中的信号区分开：光学***旁瓣、流体漂移、基线漂移、流动池污染，以及其组合。
17.根据权利要求15或16所述的非瞬时计算机可读介质，其中所述粒子是细胞并且事件是细胞事件。
18.根据权利要求17所述的非瞬时计算机可读介质，其中所述细胞事件是小细胞事件。
19.根据权利要求18所述的非瞬时计算机可读介质，其中所述细胞来自血液样品。
20.根据权利要求19所述的非瞬时计算机可读介质，其中所述小细胞事件是血小板事件。
21.根据权利要求19所述的非瞬时计算机可读介质，其中所述小细胞事件是微生物细胞事件或细胞碎片事件。
22.一种流式细胞仪，包括：
流动池；
光学耦合到所述流动池的光学粒子询问***；以及
根据权利要求15-21中的任一项所述的非瞬时计算机可读介质。
23.根据权利要求22所述的流式细胞仪，其中分析仪是血液分析仪并且所述粒子是细胞。
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