CN109136351A

CN109136351A - 一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法

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Publication number: CN109136351A
Application number: CN201710501021.5A
Authority: CN
Inventors: 赵书红; 谢胜松; 韩晓松; 赵长志; 苗义良; 李新云; 倪攀; 刘向东; ***; 徐学文; 马云龙; 高杨; 陈毅龙; 杨高娟
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明提供了一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。具体地，本发明的方法可同时获得目标靶点和非目标靶点的扩增子，通过对扩增子建库和高通量测序可获得多个sgRNA靶点和脱靶位点的基因组切割效率，同时还能获知其Indel突变序列特征，从而快速、简便、全面而准确地评估sgRNA的活性和特异性。

Description

一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。

背景技术

随着多种农业动物，如猪，牛和鸡等的全基因组测序完成，海量基因组信息可供基因功能和分子育种研究。基因功能研究方法有多种，如RNAi技术，转基因和基因敲除技术等。CRISPR/Cas9***介导的基因组定点编辑技术是第三代基因组编辑技术。CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)本身是一种防御***，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒感染。研究人员通过结合单分子成像和大量的生化试验，证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”(protospaceradjacent motif)的短DNA序列来实现的。Cas9只有在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来切割靶DNA。

CRISPR/Cas9技术可实现多种基因组定点修饰，如基因敲除/敲入、单碱基突变、基因修复、条件性基因敲除和激活基因表达等。相比于传统基因修饰技术，它具有许多无可比拟的优点。首先，CRISPR/Cas9***操作简单，核心作用元件为Cas9蛋白，只需设计靶向特定基因的sgRNA，即可修饰目标基因；其次，该***在全基因组上可用的靶向结合位点很多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用的CRISPR/Cas9编辑位点，可以说这一技术能对任一基因进行操作；再次，CRISPR/Cas9***更具有可拓展性，例如可突变或修饰Cas9蛋白，使其不切断DNA双链，而只切开单链。利用paired-gRNA，可大大减低脱靶风险。此外，还可将Cas9蛋白上融合功能元件，激活目标基因表达。最重要的是，CRISPR/Cas9技术可同时实现敲除多个基因，可在大部分动、植物体内进行基因组编辑，而且实验时间周期相对较短，实验费用低廉。尽管CRISPR/Cas9技术存在一定的脱靶风险，但其实验操作简单，无物种限制，特别是对农业大动物开展功能基因组学研究提供了强有力的工具。

目前传统检测sgRNA活性的方法是T7EN1酶切法和克隆测序法，但该方法检测灵敏低，单次实验检测位点数量有限，相对检测成本较高。

因此，本领域迫切需要开发一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法，该方法主要将sgRNA靶点序列提取方法、扩增子高通量测序和数据分析方法进行有机结合，通过实验优化建立一种一步法评估多个sgRNA打靶和脱靶位点的新方法。

本发明第一方面提供了一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；

(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；

(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；

(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；

(vii)用高通量测序仪进行测序；以及

(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性和/或脱靶位点切割效率。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，还包括浓缩步骤，获得含有所述扩增序列的扩增产物浓缩物。

在另一优选例中，所述扩增产物浓缩物中，所述扩增产物的浓度为5-50ng/μL，较佳地，8-45ng/μL，更佳地，10-40ng/μL，更佳地，10-30ng/μL。

在另一优选例中，所述基因组编辑技术包括CRISPR/Cas9。

在另一优选例中，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织选自下组：

(a)在多种sgRNA引导下，进行基因编辑所获得的细胞或组织；

(b)用多种sgRNA同时对多个靶点进行基因编辑所获得的细胞或组织；

(c)用一种sgRNA对多个个体进行基因编辑所获得的细胞或组织；

(d)用一种sgRNA对一个靶点进行基因编辑所获得的细胞或组织。

在另一优选例中，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织是在N种sgRNA引导下进行基因编辑的细胞或组织，其中，N为1-20，较佳地1-10，更佳地2-5。

在另一优选例中，所述方法还包括：

在步骤(viii)中，进一步地获得经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织中的Indel突变序列特征。

在另一优选例中，所述的细胞或组织来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述的细胞包括：体细胞、干细胞、生殖细胞、非***细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞包括：肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的样本选自下组：血液、血浆、体液、尿液、皮肤、毛发、组织、或其组合。

在另一优选例中，所述的组织选自下组：耳朵、尾、粘膜组织、或其组合。

在另一优选例中，所述的PCR扩增包括针对靶位点(on target)的PCR扩增和针对脱靶位点(off target)的PCR扩增。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述扩增序列包括含有靶位点(on targetsite)和脱靶位点(off target site)的扩增序列。

在另一优选例中，所述的靶位点选自下组：基因的编码区、基因的非编码区(3'-UTR、启动子区域、5'-UTR区)、内含子区、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因包括结构基因、调控基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因包括蛋白编码基因、lincRNA基因、miRNA基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶位点选自下组：DMD基因、ANPEP基因、hnRNPK基因、TP53基因、miR-21基因、CRYGC基因、MSTN基因、或其组合。

在另一优选例中，所述扩增序列包括一个或多个(较佳地，1-1000个，更佳地，1-100个)含有靶位点(on target site)和脱靶位点(off target site)的扩增序列。

在另一优选例中，所述待测样本还包括基因组未编辑的细胞或组织。

在另一优选例中，所述基因组未编辑的细胞或组织作为对照样本。

在另一优选例中，所述步骤(viii)中，还包括步骤：将所述待测样本与所述对照样本进行比对，从而获得sgRNA的活性和/或特异性的步骤。

在另一优选例中，所述对照样本含有待测样本中相同的未编辑的基因组DNA样品。

在另一优选例中，所述sgRNA的特征序列具有式I结构：

N_mNGG (I)

式中，

N代表A、T、C、G中任一种碱基；

m为17、18、19、20或21。

在另一优选例中，m为20。

在另一优选例中，所述的sgRNA序列选自下组：SEQ ID NO.:4-16中任一所示的序列。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中，所述接头序列包括P5和P7，其中，所述P5为SEQID NO.:1和3所示的IS1和IS3所形成双链结构：

IS1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:1)

IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3)

所述P7为SEQ ID NO.:2和3所示的IS2和IS3所形成双链结构：

IS2：GTGACT GGAGTTCAG ACGT GTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:2)

IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3)。

在另一优选例中，在步骤(vii)中，用选自下组的高通量测序仪进行测序：Illumina HiSeq 2000、MiSeq、或其组合。

在另一优选例中，步骤(viii)中，利用选自下组的软件分析所述的测序数据：CRISPResso、Cas-Analyzer、或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(ix)：将步骤(viii)中获得的所述检测结果与另一方法测定的参照结果进行比较或验证。

在另一优选例中，所述另一方法选自下组：T7EN1酶切法、克隆测序法或其组合。

本发明第二方面提供了一种用于检测sgRNA的活性和/或特异性的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)靶位点(on target site)引物对，其中所述的靶位点引物对包括位于sgRNA所针对的靶位点上游的第一引物，以及位于所述靶位点下游的第二引物，从而用于扩增含靶位点的PCR扩增产物，即第一扩增产物；

(ii)脱靶位点(off target site)引物对，其中所述的脱靶位点引物对包括位于所述sgRNA的潜在脱靶位点上游的第三引物，以及位于所述脱靶位点下游的第四引物，从而用于扩增含所述脱靶位点的PCR扩增产物，即第二扩增产物；和

(iii)接头序列，所述接头序列用于与所述的第一扩增产物、以及第二扩增产物进行连接，从而形成式II所示的连接产物：

L1－P－L2 (II)；

式中，

L1和L2各自独立地为接头序列；

P为第一扩增产物或第二扩增产物；

"-"表示化学键。

在另一优选例中，所述接头序列包括P5和P7。

其中，所述P5为SEQ ID NO.:1和3所示的IS1和IS3所形成双链结构：

IS1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:1)

IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3)

所述P7为SEQ ID NO.:2和3所示的IS2和IS3所形成双链结构：

IS2：GTGACT GGAGTTCAG ACGT GTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:2)

IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3)。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有：(iv)用于扩增式II连接产物的通用引物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：(v)T4多聚核苷酸激酶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明中基于扩增子高通量测序技术(AmpliconSeq)检测sgRNA活性和特异性的原理图。

图2是本发明一个实施例中扩增子高通量测序技术检测单个sgRNA靶点切割活性。A.T7EN1酶切实验；B.扩增子高通量测序技术实验数据分析；C.突变碱基位置分布图；D.不同Indel突变类型位置分布图；E.删除、***和碱基改变分布图。

图3是本发明一个实施例中扩增子高通量测序技术评估单个sgRNA靶点的Indel突变类型。

图4是本发明一个实施例中扩增子高通量测序技术同时检测多个物种不同sgRNAs的靶点切割活性。

图5是本发明一个实施例中扩增子高通量测序技术检测灵敏度分析。

图6是本发明一个实施例中应用扩增子高通量测序技术评估靶向猪同一个基因多个sgRNA的靶点切割活性；

图7是本发明一个实施例中应用扩增子高通量测序技术评估不同长度sgRNAs的靶点切割活性。

图8是本发明一个实施例中应用扩增子高通量测序技术评估靶向小鼠hnRNPK基因sgRNAs的靶点切割活性。

图9是本发明一个实施例中应用扩增子高通量测序技术评估靶向小鼠hnRNPK基因sgRNAs的脱靶效应。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于扩增子高通量测序技术(AmpliconSeq)对sgRNA活性和特异性进行快速准确检测的方法。本发明方法可一次性的同时扩增获得打靶目标位点和非靶标位点的扩增子，通过该扩增子建库和高通量测序可获得多个sgRNA位点的打靶和脱靶信息，从而可以快速、简便、全面而准确地评估sgRNA的活性和特异性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

实验表明，本发明方法可以快速、简便而准确地检测出具有高活性和高特异性的sgRNA。在本发明的实施例中，基于sgRNA的脱靶效应，检测出具有高特异性(在检测的范围内未发现脱靶)的sgRNA，为开发基因编辑工具提供了极其有效的和快速的测试平台和检测手段。

术语

如本文所用，术语“经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织”、“经基因编辑的细胞或组织”、“经编辑的细胞或组织”可互换使用，指采用基因编辑技术，对基因组中的一个或多个靶位点的核酸序列，进行基因编辑而获得的细胞或组织。优选地，所述术语指采用CRISPR/Cas9基因编辑方法，在sgRNA的引导下进行基因(组)编辑而形成的经编辑的细胞或组织。

基于扩增子高通量测序技术(AmpliconSeq)检测sgRNA活性和特异性的方法

在本发明中，本发明提供了一种基于扩增子高通量测序技术(AmpliconSeq)检测sgRNA活性和特异性的方法，包括步骤：

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；

(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；

(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；

(vii)用高通量测序仪进行测序；以及

(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性(或打靶位点基因组切割效率)、和/或脱靶位点切割效率。

具体地，在一优选实施方式中，所述方法包括步骤：

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化浓缩，获得扩增序列；如果样品数量大于5时建议进行浓缩以减少体积，但如果混合不同扩增产物后浓度较高，达到建库要求则不需要浓缩，建库要求扩增子产物总量为500ng-1500ng，总体积为50μL；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；

(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；

(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；

(vii)用高通量测序仪进行测序；以及

在另一优选实施方式中，所述方法包括步骤：

1)进行基因组编辑细胞或组织样品制备和高质量DNA提取。利用sgRNAcas9程序包中的程序提取靶点区域序列(https://sourceforge.net/projects/sgRNAcas9/)，再利用NCBI Primer Blast软件设计引物，随后利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增sgRNA打靶或脱靶位点，对PCR产物进行纯化和浓缩；

2)利用T4多聚核苷酸激酶修复平末端；

3)两端接头连接：5'末端连接P5，其序列为(IS1和IS3)，3'末端连接P7，其序列为(IS2和IS3)；

4)末端填充补平；

5)Indexing PCR扩增；

6)Illumina HiSeq 2000高通量测序。最后利用CRISPResso(https://github.com/lucapinello/CRISPResso)和Cas-Analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/)软件，分析高通量测序数据即可获得sgRNA活性(或打靶位点基因组切割效率)、脱靶位点基因组切割效率、和/或Indel突变类型等。

本发明的方法可高效地检测sgRNA的活性和特异性。本发明的方法检测sgRNA的活性的范围广(0.5％～100％)，检测灵敏度高(可低至0.5％或更低)。

本发明方法可检测各种不同的待检样品，例如来自人、非人哺乳动物、家禽、植物的样品。

测序和sgRNA活性的分析

在本发明中，可用常规的测序技术和平台进行测序。测序平台不受特别限制，其中第二代测序平台包括(但不限于)：Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、X Ten、X Five、NextSeq500/550、MiSeq、MiSeqDx、MiSeq FGx、MiniSeq；AppliedBiosystems的SOLiD；Roche的454FLX；Thermo Fisher Scientific(Life Technologies)的Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/II；华大基因的BGISEQ1000、BGISEQ500、BGISEQ100；博奥生物集团的BioelectronSeq 4000；中山大学达安基因股份有限公司的DA8600；贝瑞和康的NextSeq CN500；紫鑫药业旗下子公司中科紫鑫的BIGIS；华因康基因HYK-PSTAR-IIA。

第三代单分子测序平台包括(但不限于)：Helicos BioSciences公司的HeliScope***，Pacific Bioscience的SMRT***，Oxford Nanopore Technologies的GridION、MinION。测序类型可为单端(Single End)测序或双端(Paired End)测序，测序长度可为30bp、40bp、50bp、100bp、300bp等大于30bp的任意长度，测序深度可为基因组的0.01、0.02、0.1、1、5、10、30倍等大于0.01的任意倍数。

在本发明中，优选Illumina公司的HiSeq 2000高通量测序平台，最后利用CRISPResso(https://github.com/lucapinello/CRISPResso)和Cas-Analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/)软件，分析高通量测序数据即可获得sgRNA活性(或打靶位点基因组切割效率)、脱靶位点基因组切割效率/和/或Indel突变类型等。

具体的分析流程为：

1)首先利用Trimmomatic软件(http://www.usadellab.org/cms/index.php？page＝trimmomatic)对paired-end高通量测序数据进行处理，去除测序数据中的接头和低质量数据；

2)利用CRISPResso软件评估sgRNA打靶活性；

3)利用Cas-Analyzer软件进一步分析Indel类型。

用于检测sgRNA的活性和/或特异性的试剂盒

在本发明中，还提供了一种用于检测sgRNA的活性和/或特异性的试剂盒，所述试剂盒包括：

L1－P－L2 (II)；

式中，

L1和L2各自独立地为接头序列；

P为第一扩增产物或第二扩增产物；

"-"表示化学键。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次公开了一种基于扩增子高通量测序技术(AmpliconSeq)检测sgRNA活性和特异性的方法。

(2)本发明首次实现一步法评估多个sgRNA的打靶活性和脱靶效应，适用于高通量评估基因组编辑动物sgRNA的脱靶风险。

(3)本发明方法具有检测线性范围广(0.5-100％)、灵敏度高。

(4)可适用的范围广，可以适用于动物、植物等不同样品。

(5)实验准确度高、成本相对低廉。

(6)本发明的方法可一次性同时扩增获得含靶位点和脱靶位点的扩增序列。

(7)本发明的方法非常适合快速准确地检测同时具有非常高sgRNA活性和特异性的sgRNA。

(8)本发明方法不仅可获得多个sgRNA的活性和脱靶切割效率，而且可获得打靶或脱靶位点的Indel突变特征。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非有特别说明，否则实施例所用的材料均为市售产品。

通用方法

基于扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的实验方法

基于CRISPR***的基因组编辑技术目前广泛应用于动物、植物、微生物和病毒等物种，并有望应用于人类疾病治疗以及推动动植物新品种改良。然而，不同sgRNA活性有高低且存在潜在的脱靶副作用。为此，本发明人开发了基于扩增子高通量测序原理检测不同sgRNA活性和脱靶位点的新技术。

如图1所示，该方法的步骤主要包括：

1)进行基因组编辑细胞或组织样品制备和高质量DNA提取；

利用sgRNAcas9程序包中的程序提取靶点区域序列(https://sourceforge.net/ projects/sgRNAcas9/)；再利用NCBI Primer Blast软件设计引物，随后利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增sgRNA打靶或脱靶位点，对PCR产物进行纯化；

2)如果样品数量大于5时建议进行浓缩以减少体积，比如，扩增子样品多于10个，需利用DNA浓缩仪对纯化的不同靶点或脱靶位点的PCR扩增子进行浓缩；如混合10个不同扩增子，每个样品为30微升，混合后总体积为300微升,利用DNA浓缩仪按照操作说明抽真空吸除溶液，再加入30微升的灭菌水溶解DNA干粉；

3)利用T4多聚核苷酸激酶修复平末端；

4)两端接头连接：5'末端连接P5，其序列为(IS1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:1),IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3))，3'末端连接P7，其序列为(IS2：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.:2),IS3：AGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.:3))；

5)末端填充补平；

6)Indexing PCR扩增；

7)Illumina HiSeq 2000高通量测序；

8)最后利用CRISPResso(https://github.com/lucapinello/CRISPResso)和Cas-Analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/)软件，分析高通量测序数据即可获得sgRNA活性或脱靶位点基因组切割效率和Indel序列特征等。

sgRNA和引物序列

表1实验中使用的sgRNA序列

序列(5'-3')	SEQ ID NO.:
		GACACATATCCACGCAGAGAGGG	4
GCAACAGCGTTGTGGGTAGGCGG	5
		ACCCTACCTCACTCCCAACGCGG	6
CAGAGCGATGATGGTGGCCACGG	7
		CTTCAATTACCCTTTCTTGGGGG	8
GAGACCCCTCACAGGTGAGGCGG	9
		GAAAATGTTTCCTGACTCAGAGG	10
CTCATGGCAACACCAGTCGATGG	11
		CCACCCGGATGGAGTTGCAGCGG	12
GTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGG	13
		ACATATCCACGCAGAGAGGG	14
CACATATCCACGCAGAGAGGG	15
		ACACATATCCACGCAGAGAGGG	16。

表2检测sgRNA目标靶点的PCR引物对

实施例1

利用扩增子高通量测序技术检测单个sgRNA的活性

在本实施例中，检测的靶位点为人DMD基因。

为了检验本发明方法是否可用于检测sgRNA的活性，如下进行实验：

i)靶向人DMD的基因组编辑细胞系及其DNA样品制备。

1)利用sgRNAcas9软件(https://sourceforge.net/projects/sgRNAcas9/)，按照该软件操作说明设计靶向人DMD基因的sgRNA,该sgRNA特征序列为“GACACATATCCACGCAGAGAGGG(SEQ ID NO.:4)”。

2)以PX330载体(全称pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，addgene Plasmid#42230)为骨架载体构建DMD-20-sgR表达载体，具体操作步骤为：

a)分别合成上游引物：CACCGACACATATCCACGCAGAGA(SEQ ID NO.:31)和下游引物：AAACTCTCTGCGTGGATATGTGTC(SEQ ID NO.:32)；

b)在PCR仪上进行梯度退火，程序为：95℃10min，65℃60min；

c)利用T4DNA连接酶将退火产物连接进BbsI限制性内切酶酶切后的PX330载体中。

d)质粒转化进大肠杆菌细胞，挑选单克隆并进行菌液PCR鉴定，PCR引物为“U6-F：GCATATACGATACAAGGCTG(SEQ ID NO.:33)和特异下游引物：AAACTCTCTGCGTGGATATGTGTC(SEQ ID NO.:34)，挑选阳性菌液进行Sanger测序鉴定。

e)鉴定成功的菌液扩大培养，并利用Omega无内毒质粒提取试剂盒(Omega)抽提高纯度质粒DNA用于细胞转染实验。

3)复苏HEK293T细胞系，培养条件为：培养箱温度为37℃，二氧化碳浓度为5.0％。按照Lipofectamine 2000的操作说明转染PX330质粒，48h后收集细胞，利用DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。

4)利用sgRNAcas9程序包中的extract_targetSeq.pl程序，按照操作说明提取靶向DMD位点的基因组序列，再利用NCBI Primer Blast软件设计引物并送公司合成，引物设计遵循一般引物设计原则，特别指出的是sgRNA位点居中，引物序列为：

前向引物:TCACCCAATGCCAGTGAGAT(SEQ ID NO.:17)

和反向引物：TATCTCCAGGAGCACAGCCA(SEQ ID NO.:18)。

利用DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR反应条件为：95℃,5min；(95℃,30s；65℃,30s；72℃,50s)28个循环；72℃,5min；15℃,2min。PCR反应完成后，使用PCR纯化试剂盒回收PCR产物，利用2％的普通琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，并利用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪检测回收产物浓度。

ii)利用T4多聚核苷酸激酶修复平末端，具体实验步骤为：

将准备好的样品稀释至终体积为50μL。

按如下体系制备Master MixⅠ

试剂	体积(μL)	终浓度(70-μL)
			H<sub>2</sub>O	7.12
Buffer Tango(10X)	7	1X
			dNTPs(25mM each)	0.28	100μM each
ATP(100mM)	0.7	1mM
			T4polynucleotide kinase(10U/μL)	3.5	0.5U/μL
T4DNA聚合酶(5U/μL)	1.4	0.1U/μL

将各溶液按照以上混合后移取20μL和样品混合均匀。在PCR仪上进行如下程序：25℃15min、12℃5min，后置于冰上或直接进行下步反应。

注意：此步骤应设置空白对照(50μL水)和阳性对照(200-300bp PCR回收产物)，加入酶以后禁止涡旋震荡，按照MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)试剂盒说明书进行操作，最后用20μL EB buffer洗脱。

iii)两端接头连接：5'末端连接P5，其序列为(IS1和IS3),3'末端连接P7，其序列为(IS2和IS3)，具体实验步骤为：

首先制备adapter mix

试剂	体积(μL)	终浓度(100-μL)
			Hybridization mix for adapter P5(200μM):
IS1_adapter_P5.F(500μM)	40	200μM
			IS3_adapter_P5+P7.R(500μM)	40	200μM
Oligo hybridization buffer(10X)	10	1X
			H<sub>2</sub>O	10
Hybridization mix for adapter P7(200μM):
			IS2_adapter_P7.F(500μM)	40	200μM
IS3_adapter_P5+P7.R(500μM)	40	200μM
			Oligo hybridization buffer(10X)	10	1X
H<sub>2</sub>O	10

按照上述体系制备P5/P7接头，在PCR仪进行如下程序：95℃，10s；95℃-12℃每秒降温0.1℃。将P5和P7充分混合均匀，制备好的接头可于-20℃保存。

按照如下体系制备Master MixⅡ

添加20μL Master MixⅡ至上步洗脱液中，使终反应体积为40μL，混匀。在PCR仪上进行如下程序：22℃30min。

试剂	体积(μL)	终浓度(40-μL)
			H<sub>2</sub>O	10
T4DNA ligase buffer(10X)	4	1X
			PEG-4000(50％)	4	5％
adapter mix	1	2.5μM each
			T4DNA ligase(5U/μL)	1	0.125U/μL

按照MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)试剂盒说明书进行操作，最后用20μL EB buffer洗脱。

iv)末端填充补平，具体实验步骤为：

按照如下体系制备Master MixⅢ

添加20μL Master MixⅢ至上步洗脱液中，使终反应体积为40μL，混匀。在PCR仪上进行如下程序：37℃20min。

v)Indexing PCR扩增。

vi)Illumina HiSeq 2000高通量测序仪进行测序。最后利用CRISPResso(https://github.com/lucapinello/CRISPResso)和Cas-Analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/)软件，分析高通量测序数据即可获得sgRNA活性或脱靶位点基因组切割效率和Indel序列特征等。分析流程为：1)首先利用Trimmomatic软件(http://www.usadellab.org/cms/index.php？page＝trimmomatic)对paired-end高通量测序数据进行处理，去除测序数据中的接头和低质量数据；2)利用CRISPResso软件评估sgRNA打靶活性；3)利用Cas-Analyzer软件进一步分析Indel类型。

vii)利用T7EN1实验验证基因组编辑效率，实验流程为：1)将上述回收的PCR产物在PCR仪上退火，退火体系为：

PCR回收产物：	200ng
		NEB buffer 2：	2μL
添加ddH<sub>2</sub>O至：	19.5μL

退火程序为:95℃5min；95℃-85℃，-2℃/s；85℃-25℃，-0.1℃/s；12℃，2min。

2)利用NEB公司的T7EN1核酸酶酶切PCR产物，以未做任何处理的HEK293T细胞为阴性对照，酶切反应体系为：添加0.5μL T7EN1酶至上述退火后产物，混匀。反应条件为：37度，15min。利用2％的普通琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。其中标示sgRNA活性的Indel频率计算方法为：％indel＝{1-[1-(a+b)/(a+b+c)]^1/2}*100。

结果

该实施例中扩增子高通量测序技术检测单个sgRNA的活性结果如图2(A－E)所示。图2A为T7EN1酶切实验结果，图2B为利用CRISPResso软件对扩增子高通量测序技术获得sgRNA活性高通量测序数据分析结果，图2C为突变碱基位置分布图，图2D为不同Indel突变类型位置分布图，图2E为删除、***和碱基改变分布图。

由此可见，利用T7EN1酶切实验检测发现靶向人DMD基因的sgRNA活性的Indel频率为49.5％(图2A)。而通过本发明方法检测的Indel频率为49.1％(图2B)，且测序reads值为142003，表明测序深度大于300x，进一步我们可发现Indel类型主要为缺失(图2B)，主要位于sgRNA靶点前后30-nt碱基范围内。

进一步通过Cas-Analyzer软件可分析具体Indel突变序列碱基特征，结果如图3所示。通过对扩增子高通量测序技术获得sgRNA打靶活性高通量测序数据分析，发现在sgRNA靶标识别位点附近存在小片段的碱基缺失，其中有一条靶向修饰突变的序列测序read值为28383，表明测序深度非常深。

值得一提的是，不同检测方法样品来源一致，比较发现，通过扩增子高通量测序技术检测的sgRNA打靶活性与传统的T7EN1酶切实验结果接近，相对而言，T7EN1酶切实验检测方法效率低，一次检测的样品数量有限，而且酶的用量多，成本较高。

与此相反，采用本发明的扩增子高通量测序技术，原理上一次建库，可平行检测成百上千个靶点，成本相对较低，如本次获得paired-end测序数据量低于1GB，即可评估sgRNA的活性。目前市面上测序成本约为1GB/80元，因此本发明方法检测成本相对低廉。其次，通过软件对扩增子高通量测序技术数据分析，可进一步获得打靶和/或脱靶位点的Indel基因型信息，信息量更丰富，便于后续筛选能影响基因功能的突变细胞或动物个体用于功能研究或育种。

实施例2

利用扩增子高通量测序技术同时检测多个sgRNA的打靶活性

进一步验证了该方法同时检测多个sgRNA打靶活性的能力，开展了如下实验，实验流程与实施例1基本一致，主要不同之处在于构建靶向不同物种不同基因的细胞系或动物模型，具体如下：

i)利用sgRNA软件分别设计了以下sgRNA：

靶向猪ANPEP基因的3个sgRNA，序列分别为：GCAACAGCGTTGTGGGTAGGCGG,ACCCTACCTCACTCCCAACGCGG,CAGAGCGATGATGGTGGCCACGG(SEQ ID NO.:5、6、7)；

靶向小鼠hnRNPK基因的2个sgRNA，序列分别为：CTTCAATTACCCTTTCTTGGGGG(SEQ ID NO.:8),GAGACCCCTCACAGGTGAGGCGG(SEQ ID NO.:9)；

靶向人TP53基因的sgRNA，序列为：GAAAATGTTTCCTGACTCAGAGG(SEQ ID NO.:10)；

靶向miR-21的sgRNA，序列为：CTCATGGCAACACCAGTCGATGG(SEQ ID NO.:11)；

靶向CRYGC基因的的sgRNA，序列为：CCACCCGGATGGAGTTGCAGCGG(SEQ ID NO.:12)，

靶向MSTN基因的sgRNA，序列为：GTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGG(SEQ ID NO.:13)。

依照实施例1的实验流程分别在猪PK15细胞系、人的HEK293T细胞系和构建小鼠hnRNPK基因敲除(KO)动物模型，其中构建小鼠hnRNPK基因KO动物模型实验步骤将在下述实施例4中具体阐述。

ii)利用本发明的扩增子高通量测序技术同时检测上述制备的靶向多个基因的细胞系或动物模型组织DNA样品。同时采用T7EN1实验进行验证。

值得一提的是，扩增子建库测序技术建库时，所需的PCR产物初始量要求为500-2000ng，在检测单个sgRNA活性时只需将500-2000ng PCR产物加入反应提取。而同时检测多个sgRNA活性时，因不同PCR产物浓度不一致，宜将不同实验组的PCR回收产物等量混合后，通过核酸浓缩仪进行浓缩，再补充50μL体积的灭菌水溶解，进而开展下一步的实验。

通过TA克隆和Sanger测序技术检测，对比浓缩与不浓缩的检测结果，发现混合样品浓缩后能进一步显著提高AmpliconSeq检测不同sgRNA活性效率的准确性(注意：是否对混合样品浓缩取决于总样品的浓度，如果产物浓度较高，达到建库要求就不需要浓缩过程，建库要求扩增子产物总量为500ng-1500ng，总体积为50μL)。

本实施例中扩增子高通量测序技术同时检测多个物种不同sgRNAs的打靶活性如图4所示。在本实施例中，同时分别比较了采用普通DNA聚合酶和高保真DNA聚合酶检测效果。

通过CRISPResso软件分析发现，由图4可见，与对照组(Control)相比，采用普通DNA聚合酶检测靶向猪的ANPEP的三条sgRNA活性分别是：6.57％，12.05％和9.41％；而采用高保真DNA聚合酶检测发现分别是：5.94％，14.41％和9.58％。

采用普通DNA聚合酶检测靶向人的四个基因的sgRNA活性分别是：2.14％，12.29％，13.08％和1.2％，而采用高保真DNA聚合酶检测发现分别是：2.53％，11.84％，22.33％和1.4％。

采用普通DNA聚合酶检测靶向小鼠hnRNPK动物模型的sgRNA活性分别是：48.32％和48.39，而采用高保真DNA聚合酶检测发现分别是：99.89％和99.84％。

由此可见，针对人和猪细胞水平，采用普通DNA聚合酶检测sgRNA活性效果接近，而针对基因组编辑小鼠，使用不同保真度的DNA聚合酶结果差异显著，为保证实验结果稳定，优选采用高保真DNA聚合酶检测。

其次，将扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性与T7EN1酶切法比较，结果如图5(A-B)所示。针对靶向人的MSTN和miR-21,利用高保真DNA聚合酶检测sgRNA活性分别是：1.4％和11.84％，可见扩增子高通量测序技术检测灵敏度高于传统T7EN1酶切法。

应用扩增子高通量测序技术评估靶向猪ANPEP的3条sgRNA的打靶活性，发现该方法检测的效果与T7EN1酶切法相似，但本发明方法检测灵敏度更高，可同步检测多个sgRNA靶向修饰打靶或脱靶位点，且能获得打靶或脱靶位点的Indel突变序列信息(图6，A-C)。

实施例3

应用扩增子高通量测序技术评估不同长度sgRNAs的打靶活性

为了检验利用扩增子高通量测序技术评估不同长度sgRNA的打靶活性，利用sgRNAcas9软件设计了靶向人DMD基因同一位点不同长度的sgRNA。

sgRNA序列分别是：

DMD-17-sgR:ACATATCCACGCAGAGAGGG(SEQ ID NO.:14),

DMD-18-sgR:CACATATCCACGCAGAGAGGG(SEQ ID NO.:15),

DMD-19-sgR:ACACATATCCACGCAGAGAGGG(SEQ ID NO.:16),

DMD-20-sgR:GACACATATCCACGCAGAGAGGG(SEQ ID NO.:4),

相应的实验操作流程与实施例2一致，因靶向同一基因同一位点，需分别构建4个扩增子文库。为验证测序方法可靠性，同样采用T7EN1酶切实验验证。

结果如图7(A－B)所示。应用扩增子高通量测序技术评估17,18,19,20-nt长度sgRNAs的打靶活性分别是：21.3％，28.3％，26.9％和15.3％，值得一提的是，对照组(Control)中有背景噪音：0.4％。计算最终切割效率时需扣减背景噪音，因此最终的sgRNA打靶活性分别是：20.9％，27.9％，26.5％和14.9％。而对应T7EN1实验检测活性为：23.4％，43.3％，23.6％和12.3％。由此可见，利用扩增子高通量测序技术sgRNA活性结果更为可靠。

实施例4

应用扩增子高通量测序技术评估基因组编辑小鼠模型中sgRNA活性和脱靶效应

本实施例中，利用扩增子高通量测序技术评估靶向小鼠hnRNPK基因sgRNA体内活性和特异性。

前体sgRNA设计和表达载体构成实验流程与实施例1相同。不同之处在于：

i)利用RNA体外转录试剂盒，按照操作说明分别体外转录sgRNA和Cas9的mRNA，其中，Cas9的mRNA进行5'加帽处理。

ii)收集小鼠的***，与成熟***共孵育，进行体外受精。利用显微注射技术将sgRNA和Cas9的mRNA注射进受精卵中，移植回***母鼠子宫中，约21天后怀孕生产获得3只founder小鼠。剪切一小节鼠尾，利用DNA提取试剂盒提取鼠尾基因组DNA；

iii)利用sgRNAcas9软件设计靶向小鼠hnRNPK基因两个sgRNA的同时，同时预测和提取脱靶位点，其中选择hnRNPK-sgR-1的脱靶位点数量为9个，hnRNPK-sgR-2的脱靶位点数量为16个。

对于hnRNPK-1的脱靶位点，合成了9对潜在的脱靶位点引物(序列未全部示出)。作为代表，表3中示出了SEQ ID NO.:23和24，以及25和26所示的2对脱靶位点引物。

对于hnRNPK-2的脱靶位点，合成了16对潜在的脱靶位点引物(序列未全部示出)。作为代表，表3中示出了SEQ ID NO.:27和28，以及29和30所示的2对脱靶位点引物。

表3检测sgRNA脱靶位点的PCR引物对

PCR反应体系为：

试剂	体积(μL)
		5X GXL buffer	10
dNTP	4
		primer-F	1
primer-R	1
		GXL Enzyme	1
DNA	5
		ddH20	28

反应条件为：94℃5min；98℃10s，60℃15s，68℃1kb/min 30cycles；68℃5min；15℃2min；

iv)后续扩增子建库高通量测序实验流程与实施例1和2相同。

针对小鼠hnRNPK基因外显子3的两端内含子区域共设计了2个sgRNA(附图8A)，基于CRISPR技术构建hnRNPK基因修饰小鼠模型流程图见附图8B,利用T7EN1酶切实验检测出生的3只founder首建鼠。

由图8C可见，编号为founder-1#和founder-3#的小鼠有明显的切割条带，进一步通过TA克隆和Sanger测序鉴定founder-1#和founder-3#的小鼠在sgRNA识别位点，特别是PAM位点附近有碱基缺失，且在随机挑选的克隆测序均检测到，表示获得较高频率的Indel突变(图8D)。

应用扩增子高通量测序技术评估靶向小鼠hnRNPK基因的2个sgRNAs打靶活性，由图8E可见，利用不同保真性的DNA聚合酶检测效果不同，而采用高保真DNA聚合酶检测的效果与利用TA克隆和Sanger测序结果一致，表明利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性，应采用高保真DNA聚合酶进行扩增。其次，同样采用扩增子高通量测序技术，评估了靶向小鼠hnRNPK基因的2个sgRNAs的脱靶效应。由图9可见，未检测到脱靶位点产生，表明设计的2个靶向小鼠hnRNPK基因的sgRNAs特异性高，体内切割无脱靶效应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法

<130> P2017-0782

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatcggaag agc 13

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacacatatc cacgcagaga ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaacagcgt tgtgggtagg cgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accctacctc actcccaacg cgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagagcgatg atggtggcca cgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttcaattac cctttcttgg ggg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagacccctc acaggtgagg cgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaaatgttt cctgactcag agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcatggcaa caccagtcga tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccacccggat ggagttgcag cgg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgagtcca aaatctctcc tgg 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acatatccac gcagagaggg 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cacatatcca cgcagagagg g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acacatatcc acgcagagag gg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcacccaatg ccagtgagat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tatctccagg agcacagcca 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcgcaattca accatctc 18

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccaaccaaca ttttaatcct tt 22

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtaatagggc tttcacca 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctttgaactc tgctttgg 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aggaggcaac caacagaa 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ccccaggttc aacagtct 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acaggaagaa aagcaaag 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaaggttaga gtacgtggc 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctgcttagac tgtctgaccc 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tccctgaaag aggtgctg 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

caggcaggag ggtgaaat 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tccctgttcc cctcaaat 18

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

caccgacaca tatccacgca gaga 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aaactctctg cgtggatatg tgtc 24

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcatatacga tacaaggctg 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaactctctg cgtggatatg tgtc 24

Claims

1.一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；

(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；

(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；

(vii)用高通量测序仪进行测序；以及

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，还包括浓缩步骤，获得含有所述扩增序列的扩增产物浓缩物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织是在N种sgRNA引导下进行基因编辑的细胞或组织，其中，N为1-20，较佳地1-10，更佳地2-5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞或组织来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样本选自下组：血液、血浆、体液、尿液、皮肤、毛发、组织、或其组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，所述扩增序列包括含有靶位点(on target site)和脱靶位点(off target site)的扩增序列。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的靶位点选自下组：DMD基因、ANPEP基因、hnRNPK基因、TP53基因、miR-21基因、CRYGC基因、MSTN基因、或其组合。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(viii)中，还包括步骤：将所述待测样本与所述对照样本进行比对，从而获得sgRNA的活性和/或特异性的步骤。

10.一种用于检测sgRNA的活性和/或特异性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(ii)脱靶位点(off target site)引物对，其中所述的脱靶位点引物对包括位于所述sgRNA的潜在脱靶位点上游的第三引物，以及位于所述脱靶位点下游的第四引物，从而用于扩增含所述脱靶位点的PCR扩增产物，即第二扩增产物；和(iii)接头序列，所述接头序列用于与所述的第一扩增产物、以及第二扩增产物进行连接，从而形成式II所示的连接产物：

L1－P－L2 (II)；

式中，

L1和L2各自独立地为接头序列；

P为第一扩增产物或第二扩增产物；

"-"表示化学键。