CN109136242B - 一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用 - Google Patents

一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示；还涉及上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用；还涉及一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒及方法。本发明首次克隆了柑橘的2个自交不亲和花柱基因，提供了验证柑橘自交不亲和花柱基因的一种有效手段，根据杂交后代基因型的分离比即可确定候选基因是否参与自交不亲和反应。该方法耗时短，只需要采集杂交后代幼嫩叶片即可，方便快捷。

Description

一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用
技术领域
本发明涉及柑橘柚植物的分子生物学标记应用领域，更特别地，涉及一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用，以及一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒及方法。
背景技术
自交不亲和性指植物的雌雄两性器官机能正常，但进行自花授粉或使用与花柱相同基因型的花粉授粉时，不能受精或结实的现象。自交不亲和在物种进化上具有重要作用，它促进异交，抑制自交，从而增加物种多样性。但另一方面，具有自交不亲和性状的物种，其栽培过程皆需要配置合适的授粉树，这对于生产过程则是一大弊端。柑橘作为世界第一大类水果之一，具有巨大的产业经济价值巨大。柑橘的栽培种主要包括人们熟知的柚类，橙类，桔类等。其中柑橘柚类(Citrus grandis)具有广泛的自交不亲和现象，其中以传统的沙田柚为代表，其主要种植地区在广西桂林。由于沙田柚具有严重的自交不亲和现象，当地人们皆采用人工授粉的方式进行授粉，其工作量巨大，且耗时久。
有研究显示，自交不亲和多数是由一个S位点的复等位基因控制。该位点有不同的S单体型，至少包含两个多态性基因，雌性决定因子和雄性决定因子。这两个基因都具有典型的组织特异性表达特点，即雌性因子只在花柱中表达，雄性因子只在花粉及花粉管中表达。
发明内容
我们在研究过程中发现柑橘柚类植物的自交不亲和基于S-RNase介导的配子体自交不亲和机制，通过一种由花柱基因编码的核糖核酸酶来决定其自交不亲和性，并鉴定了该基因的两个等位基因。
基于以上研究，我们提供了一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQID NO:3所示。本发明首次克隆了柑橘的2个自交不亲和花柱基因(CgRNS1和CgRNS2)，这两个基因在花柱中特异表达，且具有典型的自交不亲和基因特征。高等电点，N端含有疏水信号肽区域。序列结构上，都只含有一个内含子，5个保守结构域，以及2个高变区。因此，根据保守结构域设计合适的简并引物，有望克隆出更多的柑橘S基因。这为柑橘自交不亲和的研究奠定了重要的基础。
本发明还提供了上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用。
本发明还提供了一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒，包括CgRNS1的检测试剂和CgRNS2的检测试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒为基于PCR的试剂盒。
在一个优选实施方案中，CgRNS1的检测试剂中包括CgRNS1的检测引物对，序列如SEQ ID NO:5和6所示。
在一个优选实施方案中，CgRNS2的检测试剂中包括CgRNS2的检测引物对，序列如SEQ ID NO:7和8所示。
本发明还提供了一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的方法，包括鉴定所述柑橘柚植株中决定自交不亲和性的基因的步骤。
在一个优选实施方案，所述方法包括以下步骤：
步骤1：从所述柑橘柚植株上采集带有全套遗传物质的组织；
步骤2：从所述组织中提取基因组作为模板，使用CgRNS1的检测引物对和CgRNS2的检测引物对分别进行扩增；
步骤3：根据扩增产物的结果判定所述柑橘柚植株是否可接受基因型为CgRNS1或CgRNS2的雄配子，当扩增结果显示CgRNS1阳性时，则不能接受基因型为CgRNS1的雄配子，当扩增结果显示CgRNS2阳性时，则不能接受基因型CgRNS2的雄配子。在一个优选实施方案中，步骤1中所述带有全套遗传物质的组织为叶片组织。
在一个优选实施方案中，步骤2中，CgRNS1的检测引物对序列如SEQ ID NO:5和6所示，CgRNS2的检测引物对序列如SEQ ID NO:7和8所示。
本发明提供了验证柑橘自交不亲和花柱基因的一种有效手段，根据杂交后代基因型的分离比即可确定候选基因是否参与自交不亲和反应。该方法耗时短，只需要采集杂交后代幼嫩叶片即可，方便快捷。本发明构建的3个柚类杂交群体后代，有利于自交不亲和基因型的分离以及鉴定。
本发明基于CgRNS1和CgRNS2序列设计了特异性扩增引物，该引物可稳定的检测CgRNS1和CgRNS2在物种中的纯在与否，这为柚类S基因型的鉴定提供了坚实的基础。
附图说明
图1为CgRNS1与CgRNS2基因的内含子/外显子结构图；
图2为CgRNS1与CgRNS2基因序列比对图。实心圆表示保守的半胱氨酸，实心三角形表示保守的组氨酸。直线区域表示信号肽序列；
图3为CgRNS1和CgRNS2在沙田柚的7种组织中的荧光定量表达统计图；
图4为9个沙田柚(ST)×酸柚(SU)杂交群体后代，以及42个沙田柚(ST)×HB柚(HB)杂交群体后代CgRNS1和CgRNS2PCR扩增片段电泳照片；
图5为118个HB柚(HB)×沙田柚(ST)杂交群体后代CgRNS1和CgRNS2PCR扩增片段电泳照片；
图6为沙田柚与HB柚正交反交后子代基因型分离示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.沙田柚花粉以及花柱差异表达谱构建
采取广西桂林沙田柚的叶片以及开花前一天的6个不同花器官组织材料(包括花药，花丝，花柱，子房，花柄，以及花瓣)。用液氮速冻，-80℃保存待用。所有组织材料的RNA参照Liu等人(Liu Y,Liu Q.Efficient isolation of RNA from fruit peel and pulp ofripening navel orange(Citrus sinensis Osbeck)[D].Journal of HuazhongAgricultural University.2006)的方法进行提取，并将提取质量合格的花柱以及花粉RNA送入深圳华大公司进行建库测序，每个样品3个生物学重复。
以本课题组构建的沙田柚10G的转录组数据作为参考序列(Liang M.,Yang X,LiH,Su S,Yi H,Chai L,Deng X.De novo transcriptome assembly of pummelo andmolecular marker development[J].Plos One,2015(10),e0120615)，对测序得到的cleardata进行比对，最终获得花柱中3241个基因相对于花粉下调，3456个基因上调。在这3456个花柱上调基因中存在2个被注释为核糖核酸酶基因，CL6572.Contig1_Cg和Unigene25359_Cg。因为这是柚类中首次鉴定到的核糖核酸酶基因，因此将其命名为CgRNS1(C.grandisRibonuclease 1)和CgRNS2(C.grandis Ribonuclease 2)。
2.CgRNS1和CgRNS2的序列分析及空间结构分析
根据转录组获得的序列信息设计全长扩增引物，分别以沙田柚叶片DNA以及花柱cDNA为模板进行扩增。扩增引物分别为：
CgRNS1-F：5’--ATGAACATTACTTTCTTCCTCTA--3’(SEQ ID NO:9)
CgRNS1-R：5’--TTAAGGCGGGGGAAAGGTA--3’(SEQ ID NO:10)
CgRNS2-F：5’--ATGAAGGCGACTAACCTCTTTC--3’(SEQ ID NO:11)
CgRNS2-R：5’--CTACTCATCGGTCGGCTCG--3’(SEQ ID NO:12)
扩增获得的产物经回收、载体构建、测序获得序列，CgRNS1的DNA序列如SEQ IDNO:1所示，其CDS序列如SEQ ID NO:2所示。CgRNS2的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，其CDS序列如SEQ ID NO:4所示。
通过ExPASy网站的ProtParam工具对候选基因编码的蛋白大小及等电点进行预测。CgRNS1的CDS序列全长669bp，编码一个25.9kDa大小的蛋白，等电点预测为9.51；CgRNS2与CgRNS1极其相似，CDS序列全长为699bp，蛋白预测大小为26.5kDa，等电点预测为9.35。使用SignalP 4.1对基因的信号肽区域进行预测。CgRNS1与CgRNS2的蛋白序列N端前21个氨基酸都为疏水性信号肽区域。使用GSDS绘制基因的内含子/外显子结构图，如图1所示，CgRNS1与CgRNS2都有且仅有一个内含子，且内含子的位置都在序列的300bp左右。
使用clustalx软件将CgRNS1与CgRNS2序列比对，比对结果使用Genedoc进行绘图，如图2所示，2个候选基因都含有保守结构域C1-C5，且两个高变区HVa，HVb。此外，2个核糖核酸酶都具有两个保守的组氨酸活性位点，6个半胱氨酸位点。
提取沙田叶片、花药、花丝、花柱、子房、花柄以及花瓣的RNA，并严格参照诺唯赞公司的HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)进行样品反转录。20μl反转录体系包含1000ng RNA，反转录后的加入40μl无菌水进行稀释。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析采用384板在ABI 7900HT Fast仪器运行，每个样品三个机械重复。10μl的体系包括：5μl 2x SYBR Green PCR Master Mix，0.2μl荧光定量正引物，0.2μl荧光定量反引物，0.5μlDNA模板，并用水补足至10μl。qRT-PCR程序为：先50℃2min，95℃1min；再95℃15s，60℃1min，40个循环。荧光定量正反引物如下：
qCgRNS1-F：5’--AAGGCCATCAGATTTCGTTC--3’(SEQ ID NO:13)
qCgRNS1-R：5’--CAGTGCTCATCCATTTCCATAC--3’(SEQ ID NO:14)
qCgRNS2-F：5’--TTCATCCTACATGGGCTCTG--3’(SEQ ID NO:15)
qCgRNS2-R：5’--TATCTCGCTTCAGCGATTTTAG--3’(SEQ ID NO:16)
如图3所示，CgRNS1与CgRNS2都具有花柱特异性表达，CgRNS1在花柱中的表达量是花药中的70倍左右；CgRNS2在花柱中的表达量是花药中的400倍左右。根据以上分析结合我们的其他研究推测，CgRNS1与CgRNS2可能是自交不亲和花柱基因。
3.CgRNS1和CgRNS2功能验证
为了选取合适的S基因型的柚子进行杂交授粉，我们根据获得的CgRNS1与CgRNS2序列设计特异性扩增引物，对多个柚子品种DNA进行扩增。
特异性扩增引物序列：
S1-F：5’--TTTATTTCCTGCATTTCCTCGG--3’(SEQ ID NO:5)
S1-R：5’--ACTCCTTCCATTTGGATATATTCC--3’(SEQ ID NO:6)
S2-F：5’--CTCTTGAGGCTGATTTGATG--3’(SEQ ID NO:7)
S2-R：5’--CGGGGAACTTGATATTGTCT--3’(SEQ ID NO:8)
根据扩增结果获得该品种含有CgRNS1和CgRNS2的情况，最终挑选出只含有CgRNS2的酸柚和HB柚，作为杂交群体构建。构建的杂交群体组合包括：沙田柚(母本)×酸柚(父本)，沙田柚(母本)×HB柚(父本)，HB柚(母本)×沙田柚(父本)。每个授粉组合选取50朵花，为保证坐果率，每个小枝上最多保留两朵花。待开花前一天，对柚子花朵进行人工去雄，授以相应的花粉，然后套袋，5天后，摘袋。
待果实成熟，将后代种子播种，采取后代幼嫩叶片进行DNA提取，再次使用CgRNS1和CgRNS2特异扩增引物进行后代基因型的鉴定。
如果根据孟德尔遗传定律，CgRNS1和CgRNS2作为一对等位基因，理论上，沙田柚(母本)×酸柚(父本)，沙田柚(母本)×HB柚(父本)后代中CgRNS1和CgRNS2的分离比应该为1：2，且沙田柚与HB柚的正交反交群体的基因分离比一致。
然而，沙田柚(母本)×酸柚(父本)、沙田柚(母本)×HB柚(父本)的子代的扩增结果如图4所示，在49个沙田柚X酸柚杂交群体后代都表现为非CgRNS1则CgRNS2，CgRNS1:CgRNS2＝21：28(≈1：1.3)；42个沙田柚X HB柚杂交群体后代也是非CgRNS1则CgRNS2，CgRNS1:CgRNS2＝21：21(＝1：1)；而118个HB柚×沙田柚杂交群体后代都能检测出CgRNS1，并且CgRNS1与CgRNS2的检出率比CgRNS1:CgRNS2＝118：54(≈2.2：1)(图6)。
以上结果显示，CgRNS1与CgRNS2这两个等位基因之间分离重组不符合孟德尔定律。我们推测，由于柚类具有自交不亲和的特点，即与花柱相同基因型的花粉是无法完成双受精过程。沙田柚中扩增出CgRNS1和CgRNS2，将沙田柚S基因型为S1S2。由于酸柚以及HB柚都含有沙田柚的S2等位基因(假定基因型为S2Sn，Sn为未知等位基因)，那么酸柚和HB柚中含有S2等位基因的花粉无法完成双受精，因此，以酸柚和HB柚的花粉授粉，子代CgRNS1和CgRNS2的分离比应该为1：1，沙田柚与HB柚的正交反交群体的基因分离比不一致，CgRNS1和CgRNS2的分离比应该为2：1(图5)，这与上述统计结果基本一致。可见，CgRNS1和CgRNS2是决定柑橘柚类植物自交不亲和性的等位基因。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用
<130> TSBD181-044
<141> 2018-10-08
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 788
<212> DNA
<213> Citrus grandis
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<400> 9
atgaacatta ctttcttcct cta 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttaaggcggg ggaaaggta 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaaggcga ctaacctctt tc 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctactcatcg gtcggctcg 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaggccatca gatttcgttc 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagtgctcat ccatttccat ac 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcatcctac atgggctctg 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatctcgctt cagcgatttt ag 22

Claims (10)

1.一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，其特征在于，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示。
2.权利要求1所述的基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用。
3.一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒，其特征在于，包括CgRNS1的检测试剂和CgRNS2的检测试剂，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于PCR的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，CgRNS1的检测试剂中包括CgRNS1的检测引物对，序列如SEQ ID NO:5和6所示。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，CgRNS2的检测试剂中包括CgRNS2的检测引物对，序列如SEQ ID NO:7和8所示。
7.一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的方法，其特征在于，包括鉴定所述柑橘柚植株中决定自交不亲和性的基因的步骤，所述决定自交不亲和性的基因为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：从所述柑橘柚植株上采集带有全套遗传物质的组织；
步骤2：从所述组织中提取基因组作为模板，使用CgRNS1的检测引物对和CgRNS2的检测引物对分别进行扩增；
步骤3：根据扩增产物的结果判定所述柑橘柚植株是否可接受基因型为CgRNS1或CgRNS2的雄配子，当扩增结果显示CgRNS1阳性时，则不能接受基因型为CgRNS1的雄配子，当扩增结果显示CgRNS2阳性时，则不能接受基因型为CgRNS2的雄配子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1中所述带有全套遗传物质的组织为叶片组织。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤2中， CgRNS1的检测引物对序列如SEQ ID NO:5和6所示，CgRNS2的检测引物对序列如SEQ ID NO:7和8所示。
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