CN109122816A - 一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗菌剂及食品添加剂领域，具体涉及一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法及应用。本发明的制备方法具体为：将墨角兰的叶片清洗干净，剪切、烘干，加入无水乙醇浸泡，振摇浸提，得到墨角兰乙醇浸提液；将墨角兰乙醇浸提液，置于脉冲磁场仪中进行脉冲磁场处理，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物；将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，进行处理，得到等离子体处理墨角兰提取物。本发明通过脉冲磁场技术制备墨角兰提取物，提取效率高，有效减少资源浪费；使用等离子体处理墨角兰提取物能够有效抑制食源性病原菌及院内感染病原菌的生长，有效预防细菌性食物中毒，保障食品安全性，延长食品货架期，拓展墨角兰在食品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于抗菌剂及食品添加剂领域，具体涉及一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法及应用。
背景技术
墨角兰(Origanum majorana)，又名马郁草，隶属于唇形科牛至属，原产于地中海地区，分布于土耳其，埃及等地。墨角兰其性温，味微苦，具有补气提神，驱毒健脾，止咳平喘，助消化，消胀气，解痉挛的作用。此外，墨角兰气味芳香，带有甜松和柑橘的香味，是常用的香辛料。茎和叶均含有挥发油，主要成分为百里香酚(Thymol)和香荆芥酚(Carvacrol)。目前常用的墨角兰提取方法主要为水提法及醇提法，如甲醇、乙醇等。然而这些提取方法存在提取效率低、资源浪费严重、安全性弱等缺点。因此，本发明提出采用脉冲磁场技术来提高墨角兰的提取效率，减少资源浪费，增强其安全性。
脉冲磁场技术是一种很有潜力的新型技术。脉冲磁场是一个低频、高场强的窄脉冲磁场，一般为1Hz～1.25Hz左右，磁头表面最高场强可达3000Gs以上，脉冲宽度7ms左右。在医疗领域，脉冲磁场以人体内的血液、体液、细胞介质等作为导体，将磁场强度、脉冲频率、极性的变化作用于机体，且无热效应，不会产生组织炎性渗出，一般磁场作用可达机体内150～200mm。脉冲磁场可以镇静止痛，降低血液粘稠度等，临床应用多年，安全可靠，患者无不适感。在食品领域，脉冲磁场作为非热杀菌技术，能在较低温度下破坏细菌的细胞结构并杀灭食品中的微生物，因此能够保持食品原有的风味、色泽及营养成分。
等离子体是近似电中性的集合体，由离子与电子群构成，并且能够对电场和磁场做出响应。等离子体技术是应用等离子体发生器产生的部分电离等离子体完成一定工业生产目标的手段。研究证明等离子体处理不仅具有电离辐射的能量作用过程，而且还有质量沉淀效应和电荷交换作用。等离子体处理迅速，反应温度低，且环保无污染。2008年表面等离子体光催化也正式被提出，这一系列的证明都展示了表面等离子体在光催化中的良好性能。利用等离子体的高温或其中的活性粒子和辐射来促成某些化学反应，以获取新的物质是较热门的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，如：提取效率低，资源浪费严重，安全性弱等，本发明提供了一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法。
本发明的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)墨角兰乙醇浸提液的制备：
将墨角兰的叶片清洗干净，剪切、烘干，加入无水乙醇浸泡，振摇浸提，得到墨角兰乙醇浸提液；
(2)墨角兰提取物的制备：
将墨角兰乙醇浸提液，置于脉冲磁场仪中进行脉冲磁场处理，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物；
(3)等离子体处理墨角兰提取物：
将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，进行处理，得到等离子体处理墨角兰提取物。
步骤(1)中，所述振摇浸提的温度为25℃，所述振摇浸提的时间为24h；
步骤(2)中，所述脉冲磁场处理时，温度为4～25℃，脉冲强度为1.0～4.0T，脉冲数为10～40；
步骤(3)中，所述处理时，保护气体为氮气，氮气流量为100sccm，或者保护气体为空气；等离子体光谱仪功率为300～600W，处理时间2～6min。
本发明还提供了一种等离子体处理墨角兰提取物的应用，所述等离子体处理墨角兰提取物用于水果蔬菜及肉类的贮藏保鲜。
与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：
(1)本发明中通过脉冲磁场技术制备墨角兰提取物，与现有的水提法及醇提法相比较，具有提取效率高，能够有效减少资源浪费，增加墨角兰提取物安全性等优点。利用脉冲磁场的作用温和，处理时间短，破胞高效性以及无副作用等特点，本发明用来加快墨角兰成分的提取过程，获得更有效、更安全的墨角兰提取物。
(2)本发明中经过等离子体处理的墨角兰提取物对食源性病原菌及院内感染病原菌具有更高效、更显著的抗菌效果。具体体现在其具有更小的最小抑菌浓度(0.0625％～0.25％)及最小杀菌浓度(0.125％～0.25％)。未经等离子体处理的墨角兰提取物的最小抑菌浓度为0.25％～0.5％，最小杀菌浓度为0.25％～1.0％。
(3)本发明制备的等离子体处理墨角兰提取物在水果蔬菜及肉类的贮藏保鲜中具有良好的抑菌效果，如黄瓜、牛肉中的应用。如实施例4中，将等离子体处理墨角兰提取物应用在牛肉中，与墨角兰提取物相比，等离子体处理墨角兰提取物处理后的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的菌体数量下降明显。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率分别达到76.55％和85.19％。
(4)本发明将墨角兰提取物与等离子体技术相结合，提高墨角兰提取物的抗菌活性，拓展其在食品中的应用。所获得的等离子体处理墨角兰提取物能够有效抑制食源性病原菌及院内感染病原菌的生长，有效预防细菌性食物中毒，保障食品安全性，延长食品货架期。
附图说明
图1为本发明的等离子体处理墨角兰提取物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌效果；
图2为本发明的等离子体处理墨角兰提取物对黄瓜中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果；
图3为本发明的等离子体处理墨角兰提取物对牛肉中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
具体实施方式
通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。
实施例1：
实验材料：
(1)墨角兰乙醇浸提液的制备：
称取10g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用40mL无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h，得到墨角兰乙醇浸提液。
(2)墨角兰提取物的制备：
将墨角兰乙醇浸提液置于脉冲磁场仪中，温度为4℃，脉冲强度为1.0T，脉冲数为10；随后将墨角兰乙醇浸提液过滤，并将滤液于旋转蒸发仪中浓缩，得到墨角兰提取物，提取率为61.38％。
(3)等离子体处理墨角兰提取物：
将墨角兰提取物置于小烧杯中，随后将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，进行处理，氮气为保护气体，氮气流量100sccm，等离子体功率为300W，处理时间2min，得到等离子体处理墨角兰提取物。
本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的42.19％提升到61.38％，获得了更全面、更深入的提取；将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，通过等离子体处理，提高抗菌活性。
实施例2：
(1)墨角兰乙醇浸提液的制备：
称取10g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用40mL无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h，得到墨角兰乙醇浸提液。
(2)墨角兰提取物的制备：
将墨角兰乙醇浸提液置于脉冲磁场仪中，温度为12℃，脉冲强度为2.0T，脉冲数为30；随后将墨角兰乙醇浸提液过滤，并将滤液于旋转蒸发仪中浓缩，得到墨角兰提取物，提取率为75.26％。
(3)等离子体处理墨角兰提取物：
将墨角兰提取物置于小烧杯中，随后将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，进行处理，氮气为保护气体，氮气流量100sccm，等离子体功率为500W，处理时间4min，得到等离子体处理墨角兰提取物。
本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的42.19％提升到75.26％，获得了更全面、更深入的提取；将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，通过等离子体处理，提高抗菌活性。
实施例3：
(1)墨角兰乙醇浸提液的制备：
称取10g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用40mL无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h，得到墨角兰乙醇浸提液。
(2)墨角兰提取物的制备：
将墨角兰乙醇浸提液置于脉冲磁场仪中，温度为25℃，脉冲强度为4.0T，脉冲数为40；随后将墨角兰乙醇浸提液过滤，并将滤液于旋转蒸发仪中浓缩，得到墨角兰提取物，提取率为96.61％。
(3)等离子体处理墨角兰提取物：
将墨角兰提取物置于小烧杯中，随后将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，以空气为保护气体进行处理，等离子体功率为600W，处理时间6min，得到等离子体处理墨角兰提取物。
本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的42.19％提升到96.61％，获得了更全面、更深入的提取；将墨角兰提取物置于等离子体仪中，通过等离子体处理，提高抗菌活性。
实施例4：
(一)等离子体处理墨角兰提取物对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌效果及杀菌效果(1)实验菌株(菌种名为斜体)
a.食源性病原菌：
大肠杆菌：Escherichia coli IFO；
金黄色葡萄球菌：Staphyloccocus aureus；
肠炎沙门氏菌：Salmonella Enteritidis；
枯草芽孢杆菌：Bacillus cereus；
枯草杆菌：Bacillus subtilis；
单核细胞增生李斯特菌：Listeria monocytogenes；
肉毒梭状芽孢杆菌：Clostridium botulinum。
b.院内感染病原菌：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus)。
(2)实验方法
向无菌营养肉汤(NB)培养液中分别添加等离子体处理墨角兰提取物和墨角兰提取物，使其质量分数分别为0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％，1.0％(w/v)。用微量移液器加入培养至对数期的菌液，初始浓度为105-6CFU/mL。接种的培养液置于37℃培养箱中培养24～48h，其中单核细胞增生李斯特菌置于25℃培养箱中培养48h。
最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)指在特定环境下孵育后，用肉眼辨别不出细菌繁殖的最小浓度。将大于等于最小抑菌浓度的培养液分别用接种环蘸取一环，在无菌NA培养基上划线，同样置于37℃及25℃培养箱中培养24～48h。在营养琼脂(NA)培养基上完全看不到菌落生长的浓度定为最小杀菌浓度(Minimum BactericidalConcentration，MBC)。
(3)实验结果
本发明样品为等离子体处理墨角兰提取物，是一种新型的抗菌剂。为了判断等离子体处理墨角兰提取物的抗菌性能，将墨角兰提取物作为对照组，对食源性病原菌及院内感染病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度进行了实验。由表1可知，墨角兰提取物对各病原菌的最小抑菌浓度为0.25％～0.5％，最小杀菌浓度为0.25％～1.0％；而等离子体处理墨角兰提取物对各病原菌的最小抑菌浓度为0.0625％～0.25％，最小杀菌浓度为0.125％～0.25％。因此，等离子体处理墨角兰提取物比墨角兰提取物具有更显著的抑菌及杀菌效果，说明等离子体处理能够提高墨角兰提取物的抗菌活性。
表1等离子体处理墨角兰提取物对食源性病菌及院内感染病原菌的抑菌效果及杀菌效果
(二)等离子体处理墨角兰提取物的抗菌实验
(1)实验菌株(菌种名为斜体)
大肠杆菌：Escherichia coli；
金黄色葡萄球菌：Staphyloccocus aureus；
(2)实验方法
采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为模式菌种，测定等离子体处理墨角兰提取物的抗菌性能。
将磷酸缓冲液(PBS)溶液等体积分装试管，高压灭菌备用。将等离子体处理墨角兰提取物和墨角兰提取物以最终质量分数为0.50％(w/v)的浓度添加到试管中，并接入培养至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初始浓度为105CFU/mL，以不添加样品的试管为空白对照组，混合均匀，放置在37℃的摇床培养。在0h，24h，48h时，取出试管，逐级稀释涂布于NA培养基上，测定残存菌数。测定方法按照GB 4789.2—2010食品卫生微生物学检测菌落总数进行。
(3)实验结果
从图1可以看出，在48h时，经过墨角兰提取物处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的残存菌数分别下降了59.15％，67.11％；同时，等离子体处理墨角兰提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好杀菌效果，残存菌数分别下降了91.83％，99.999％。由此可知，等离子体处理墨角兰提取物具有更为显著的杀菌效果，在食品行业中将会有更广泛的用途。
(三)等离子体处理墨角兰提取物在黄瓜中的应用
(1)实验菌株(菌种名为斜体)
大肠杆菌：Escherichia coli；
金黄色葡萄球菌：Staphyloccocus aureus；
(2)实验方法
采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为模式菌种，测定等离子体处理墨角兰提取物在黄瓜中的应用。
购买新鲜黄瓜，洗净，切丁。将黄瓜与磷酸缓冲液(PBS)以质量比1：9混合，转移至无菌均质袋，均质5min，过滤，吸取上清液，即得质量分数10％(w/w)的黄瓜培养液，等体积分装试管，高压灭菌后备用。将等离子体处理墨角兰提取物和墨角兰提取物以最终质量分数为0.50％(w/v)的浓度添加到试管中，并接入培养至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初始浓度为103CFU/mL，以不添加样品的试管为空白对照组，混合均匀，放置在37℃的摇床培养。在0h，24h，48h，72h，96h时，取出试管，逐级稀释涂布于NA培养基上，测定残存菌数。测定方法按照GB 4789.2—2010食品卫生微生物学检测菌落总数进行。
(3)实验结果
从图2可以看出，在黄瓜培养液中，空白实验组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌迅速繁殖，总菌落数由3.20Log CFU/mL增加至7.91Log CFU/mL。在墨角兰提取物处理组，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长受到了一定程度的抑制，没有出现快速增长繁殖的现象。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数分别为4.25Log CFU/mL和3.45Log CFU/mL。同样地，在等离子体处理墨角兰提取物组，细菌的生长繁殖得到了进一步的抑制。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数分别为1.1Log CFU/mL和0.72Log CFU/mL，杀菌率达到85.53％和90.79％。因此，等离子体处理墨角兰提取物在黄瓜中具有更为显著的杀菌效果，有助于保障食品安全，延长食品货架期。
(四)等离子体处理墨角兰提取物在牛肉中的应用
(1)实验菌株(菌种名为斜体)
大肠杆菌：Escherichia coli；
金黄色葡萄球菌：Staphyloccocus aureus；
(2)实验方法
采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为模式菌种，测定等离子体处理墨角兰提取物在牛肉中的应用。
购买新鲜牛肉，洗净。将牛肉与磷酸缓冲液(PBS)以质量比1：9混合，转移至无菌均质袋，均质5min，过滤，吸取上清液，即得质量分数10％(w/w)的牛肉培养液，等体积分装试管，高压灭菌后备用。将等离子体处理墨角兰提取物和墨角兰提取物以最终质量分数为0.50％(w/v)的浓度添加到试管中，并接入培养至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初始浓度为103CFU/mL，以不添加抗菌剂的试管为空白对照组，混合均匀，放置在37℃的摇床培养。在0h，24h，48h，72h，96h时，取出试管，逐级稀释涂布于NA培养基上，测定残存菌数。测定方法按照GB 4789.2—2010食品卫生微生物学检测菌落总数进行。
(3)实验结果
从图3可以看出，在牛肉培养液中，空白实验组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌迅速繁殖，总菌落数由3.24Log CFU/mL增加至8.15Log CFU/mL。在墨角兰提取物处理组，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长速度减慢。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数分别为4.59Log CFU/mL和4.23Log CFU/mL。同样地，在等离子体处理墨角兰提取物组，细菌的生长繁殖得到了进一步的抑制。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数分别为1.94Log CFU/mL和1.23Log CFU/mL，杀菌率达到76.55％和85.19％。因此，等离子体处理墨角兰提取物在牛肉中具有更为显著的杀菌效果，能够有效预防细菌性食物中毒，保障食品安全性，延长食品货架期。
Claims (10)
1.一种等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）墨角兰乙醇浸提液的制备：
将墨角兰的叶片清洗干净，剪切、烘干，加入无水乙醇浸泡，振摇浸提，得到墨角兰乙醇浸提液；
（2）墨角兰提取物的制备：
将墨角兰乙醇浸提液，置于脉冲磁场仪中进行脉冲磁场处理，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物；
（3）等离子体处理墨角兰提取物：
将墨角兰提取物置于等离子体光谱仪中，进行处理，得到等离子体处理墨角兰提取物。
2. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述振摇浸提的温度为25 ℃，所述振摇浸提的时间为24 h。
3. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脉冲磁场处理时，温度为4~25 ℃。
4. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脉冲磁场处理时，脉冲强度为1.0~4.0 T。
5.根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脉冲磁场处理时，脉冲数为10~40。
6. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述处理时，保护气体为氮气，氮气流量为100 sccm。
7.根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述处理时，保护气体为空气。
8. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述处理时，等离子体光谱仪功率为300~600 W。
9. 根据权利要求1所述的等离子体处理的墨角兰提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述处理时间为2~6 min。
10.如权利要求1-9任意一项所述的方法制备的等离子体处理的墨角兰提取物用于水果蔬菜及肉类的贮藏保鲜。
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