CN109121418A - 同源重组因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及影响或调节同源重组的因子、监测这些因子的方法、这些因子筛选调节同源重组的试剂的用途以及激活或调节同源重组的方法。

Description

同源重组因子
发明领域
本发明涉及影响或调节同源重组的因子、监测这些因子的方法、这些因子筛选调节同源重组的试剂的用途以及调节同源重组的方法。
发明背景
乳腺和卵巢肿瘤抑制因子BRCA1、PALB2和BRCA2通过同源重组(HR)促进DNA双链断裂(DSB)修复[8-10]。BRCA1在该过程中至少在两个不连续步骤中起作用。首先，其促进DNA末端切除[11,12]，这是HR中的起始步骤，涉及断裂的溶核加工以产生同源性搜索和链侵入所必需的单链(ss)DNA[1]。其次，BRCA1与PALB2相互作用[13-15]以引导BRCA2[13]和RAD51[16,17]募集到DSB位点。BRCA1在染色质上DSB位点侧翼的积累在G1细胞中被显著抑制[18]，使人想起细胞周期的该阶段中同源重组的有效抑制。G1中BRCA1募集的抑制依赖于53BP1和RIF1蛋白[18,19]，它们是两种末端切除抑制剂[18-22]。BRCA1还涉及通过与PALB2相互作用促进BRCA2的募集[13-15]。
具有受损的通过HR修复双链DNA断裂的能力的肿瘤，包括具有BRCA1和BRCA2缺陷的肿瘤，已经显示对聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂高度敏感。还提出了将PARP抑制剂用于治疗其他疾患，例如中风、心肌梗塞、炎性肠病、头部创伤和神经退行性疾病。泛素特异性肽酶11(USP11)的抑制已经显示使细胞对PARP抑制剂超敏感，并且已经提出肿瘤中的USP11状态或其他HR-蛋白的状态可提供用于使用PARP抑制剂的生物标志物(Wiltshire等,JBC285(19),14565-14571,2010)。
鉴定和评估影响或调节同源重组修复蛋白的因子以及鉴定对于G1细胞中抑制HR必需和充分的事件是期望的。此外，鉴定和评估影响或调节USP11的因子可有助于选择和检测PARP抑制剂治疗，特别是选择逆转或延迟PARP抑制剂抗性出现的治疗。
发明概述
本发明人已经发现细胞周期严格控制BRCA1与PALB2-BRCA2的相互作用，以便将BRCA2功能约束到S/G2期。PALB2上的BRCA1相互作用位点是由与cullin 3(CUL3)-RBX1复合的KEAP1(PALB2相互作用蛋白[6])组成的E3泛素连接酶靶向[7]。PALB2泛素化抑制其与BRCA1的相互作用，并被去泛素化酶USP11抵消，去泛素化酶USP11本身在细胞周期控制下。BRCA1-PALB2相互作用的恢复与DNA末端切除的激活的组合足以在G1期细胞中诱导HR，如通过RAD51募集、期外DNA合成和基于CRISPR/Cas9的基因靶向测定的。阻止G1中的HR的机制至少由与多步骤阻断BRCA2募集到DNA损伤位点联系的DNA末端切除的抑制组成，其涉及抑制BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装。利用限定因子诱导G1细胞中的HR的能力可用于非***细胞或在G1期休眠的细胞中的基因靶向应用。发现还为与聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂组合的靶向USP11提供了基础。
本发明人还发现USP11由细胞周期-CULLIN4-RING-连接酶(CRL4)调节，并且DCAF10充当USP11 E3连接酶的衔接子。
本发明提供了用于通过测定BRCA1和PALB2的相互作用来监测样品中的USP11活性的方法。
本发明提供了用于通过测定BRCA1、PALB2和BRCA2的相互作用来监测样品中的USP11活性的方法。
本发明提供了用于通过测定USP11和PALB2的相互作用来监测样品中的USP11活性的方法。
本发明提供了用于通过测定DCAF10来监测样品中的USP11活性的方法。
本发明提供了用于通过测定以下的复合物来监测样品中的USP11活性或表达的方法：(a)BRCA1和PALB2；(b)BRCA1、PALB2和BRCA2；(c)USP11和PALB2；和/或(d)USP11和DCAF10。
一方面，本发明提供了用于监测样品中USP11的活性或表达的方法，其包括(i)在所述样品中分离以下的复合物：(a)BRCA1和PALB2；(b)BRCA1、PALB2和BRCA2；(c)USP11和PALB2；和/或(d)USP11和DCAF10；(ii)测量所述复合物的水平；以及(iii)检测与对照相比所述复合物的活性或表达的增加或减少，作为USP11的活性或表达的指示。
一方面，本发明提供了用于监测样品中USP11的活性或表达的方法，其包括(i)通过免疫纯化在所述样品中分离以下的复合物：(a)BRCA1和PALB2；(b)BRCA1、PALB2和BRCA2；(c)USP11和PALB2；和/或(d)USP11和DCAF10；(ii)测量所述复合物的水平；以及(iii)检测与对照相比所述复合物的活性或表达的增加或减少，作为USP11的活性或表达的指示。
一方面，本发明提供了用于监测样品中USP11的活性或表达的方法，其包括(i)在所述样品中分离以下的复合物：(a)BRCA1和PALB2；(b)BRCA1、PALB2和BRCA2；(c)USP11和PALB2；和/或(d)USP11和DCAF10；(ii)由分离的复合物制备肽或肽片段；以及(iii)使所述肽或肽片段经受质谱，从而监测USP11的活性或表达。
本发明提供了通过测定PALB2的泛素化，特别是PALB2的N-末端的泛素化来监测样品中USP11的活性或表达的方法。
一方面，本发明提供了通过测定PALB2的泛素化来监测样品中USP11的活性或表达的方法，包括测量样品中与CRL3-KEAP1 E3连接酶结合的聚泛素的量，以及检测与对照相比与CRL3-KEAP1 E3连接酶结合的聚泛素的增加或减少，作为USP11的活性或表达的指示。
另一方面，本发明提供了通过测定PALB2的泛素化来监测样品中USP11的活性或表达的方法，其包括测量CRL3-KEAP1 E3连接酶的活性，以及检测与对照相比CRL3-KEAP1 E3连接酶活性的增加或减少，作为USP11的活性或表达的指示。
本发明的方法可以在存在或不存在测试化合物或试剂的情况下进行，并且在不存在测试化合物或试剂的情况下，检测出与对照相比USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF复合物、CRL3-KEAP1复合物、CRL3-KEAP1-PALB2复合物和KEAP1-PALB2复合物中的一种或多种的活性或表达的增加或减少表明，所述测试化合物或试剂可用作治疗剂，或用于调节同源重组。
一方面，本发明提供了通过使用本发明方法确定试剂对USP11活性或表达的影响来鉴定或评价试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性出现的能力的方法。
一方面，本发明涉及通过确定试剂对KEAP1、CRL3-KEAP1、KEAP1-PALB2或CRL3-KEAP1的影响来鉴定或评价试剂使细胞对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性出现的能力的方法。
一方面，本发明提供了检测抗癌剂的方法，其包括进行测试测定，包括使永生化细胞与测试化合物接触，以及使用本发明方法测定USP11活性或表达。
本发明还提供了用于鉴定或评价试剂调节同源重组的能力的方法，其包括确定测试化合物或试剂对以下中的一种或多种的影响：USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1复合物和CRL3-KEAP1-PALB2复合物。
本发明提供了筛选用于治疗与HR缺陷相关的疾病(即，HR疾病)的治疗剂的方法，其包括鉴定破坏或调节以下中的一种或多种的试剂：USP11、PALB2、PALB2泛素化、DCAF10、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1或CRL3-KEAP1-PALB2复合物。
本发明的筛选方法还可以包括：对鉴定的试剂或其另外的类似物在动物中的效力和毒性进行治疗特性图谱表征；任选地配制包含被鉴定为具有可接受的治疗特性的一种或多种试剂的药物组合物；以及任选地向受试者或个体施用所述试剂。
本发明提供在个体中治疗HR疾病的方法，其包括根据本发明的方法鉴定调节HR的试剂，以及向个体施用所述试剂。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中使细胞对PARP抑制剂敏感的方法，其包括根据本发明的方法鉴定使细胞对PARP抑制剂敏感的试剂，以及向个体施用所述试剂。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性出现的方法，其包括根据本发明的方法鉴定逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性出现的试剂，以及向个体施用所述试剂。
在一些实施方案中，本发明提供在个体中治疗癌症的方法，其包括鉴定根据本发明的方法鉴定的抗癌剂，以及向个体施用所述试剂。
本发明还提供了用于在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法测定来自所述受试者的样品中的以下一种或多种：USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、USP11-DCAF10复合物、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物和CRL3-KEAP1-PALB2复合物。一方面，提供了用于在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法测定来自所述受试者的样品中的USP11活性或表达。一方面，提供了用于在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法测定来自所述受试者的样品中的PALB2活性或表达。
一方面，如果与对照相比以下中的一种或多种减少，则将受试者分类为对PARP抑制剂具有响应：USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、USP11-DCAF10、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化。一方面，如果与对照相比以下中的一种或多种增加，则将受试者分类为对PARP抑制剂具有响应：USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、USP11-DCAF10、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化。
预测对PARP抑制剂的响应性的方法还可以包括向个体施用PARP抑制剂。
本发明提供了用于治疗需要用PARP抑制剂治疗的患者的方法，其包括(a)请求提供分析结果的测试以确定患者是否对PARP抑制剂敏感或具有响应：通过检测来自受试者的样品中的USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、USP11-DCAF10、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2中的一种或多种并与对照进行比较，来确定患者是否对PARP抑制剂敏感或具有响应；以及(b)如果患者对PARP抑制剂敏感或具有响应，则向患者施用所述PARP抑制剂。在本发明的该方法的一方面，患者患有乳腺癌。在本发明的该方法的一方面，患者患有卵巢癌。
一方面，本发明提供了用于治疗需要用PARP抑制剂治疗的患者的方法，其包括(a)请求提供分析结果的测试以确定患者是否对PARP抑制剂敏感：通过检测来自受试者的样品中的USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1和/或CRL3并与对照进行比较，来确定患者是否对PARP抑制剂敏感；以及(b)如果患者对PARP抑制剂敏感，则向患者施用所述PARP抑制剂。在本发明的该方法的一方面，患者患有乳腺癌。在本发明的该方法的一方面，患者患有卵巢癌。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一个中的方法，其包括使用本发明的方法测定来自受试者的样品中的以下物质：USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、USP11-DCAF复合物、KEAP1、CRL3-KEAP1和/或CRL3-KEAP1-PALB2复合物。
本发明还提供了用于基于患者根据PARP响应性、特别是USP11活性的选择来确定疾病特别是癌症的合适治疗方案的药物遗传学方法以及治疗患者的方法。
本发明的方法，特别是用于测定USP11活性或CRL3-KEAP1活性的方法可用作在基于动物模型的新治疗方法和化合物的筛选方法中的读出。一方面，本发明的方法用于预测潜在的新治疗在动物模型中对疾病状态的效力。
本发明提供了用于激活或调节(例如，促进)细胞中的同源重组的方法，其包括：
(a)促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生；
(b)激活或刺激BRCA1募集到DNA双链断裂(DSB)位点；
(c)使所述细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触；
(d)抑制或除去KEAP1或CRL3-KEAP1；
(e)抑制USP11的降解或促进USP11活性；和/或
(f)抑制或除去DCAF10。
本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期的细胞中的同源重组的方法，其包括在细胞中施用BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物，或者刺激BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装。
本发明还提供了用于激活或调节细胞中、特别是细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的同源重组的方法，其包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。
本发明还提供了用于激活或调节细胞中、特别是细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的同源重组的方法，其包括向细胞施用BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物或使细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。
在本发明的各方面，BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装通过施用促进或刺激这种组装的试剂或者使用本发明的方法鉴定的促进或刺激这种组装的试剂来促进或刺激。在一个实施方案中，试剂是USP11或USP11的激动剂。在一个实施方案中，试剂是CRL-KEAP1的抑制剂。在一个实施方案中，试剂是KEAP1的抑制剂。在一个实施方案中，试剂是PALB2突变体。在一个实施方案中，试剂是破坏其与KEAP1的相互作用的PALB2突变体。在一个实施方案中，试剂是包含其Lys20、Lys25和Lys30残基的突变的PALB2。
用于激活或调节细胞中的同源重组的方法可以在其中激活了单链DNA(ssDNA)产生途径的细胞中进行。一方面，通过DNA末端切除激活细胞中的ssDNA产生途径。
本发明还提供了用于激活或调节细胞中、特别是细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的同源重组的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。在一个实施方案中，通过施用调节HR的试剂来促进或刺激复合物的组装。在一个实施方案中，试剂是使用本发明的方法鉴定的调节HR的试剂。在一个实施方案中，试剂是USP11或USP11的激动剂。在一个实施方案中，试剂是CRL-KEAP1的抑制剂。在一个实施方案中，试剂是KEAP1的抑制剂。在一个实施方案中，试剂是PALB2突变体。在一个实施方案中，试剂是DCAF10的抑制剂。在一个实施方案中，试剂是CULLIN4-RING连接酶的抑制剂。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括使细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触。
一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制KEAP1或CRL3-KEAP1或者施用KEAP1或CRL3-KEAP1的抑制剂的步骤。一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括阻断USP11降解或者促进或刺激USP11活性的步骤。在一个实施方案中，所述方法包括施用USP11或其激动剂。一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制CRL-KEAP1或者施用KEAP1或CRL3-KEAP1抑制剂并且阻断USP11降解或者促进或刺激USP1活性的步骤。
本发明还提供了用于修复G1或G0细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括(a)抑制KEAP1或CRL3-KEAP1；(b)阻断USP11的降解或者促进或刺激USP11活性；(c)施用USP11或其激动剂；(d)施用KEAP1或CRL3-KEAP1的抑制剂；(e)施用DCAF10的抑制剂；和/或(e)抑制CRL-KEAP1并且阻断USP11的降解。
用于激活或调节细胞中的同源重组的方法还可以包括激活或促进单链DNA(ssDNA)产生途径。一方面，通过DNA末端切除激活ssDNA产生途径。
用于激活或调节细胞中的同源重组的方法还可以包括基因编辑***。一方面，基因编辑步骤包括使细胞与核酸酶接触。在本发明的各方面，基因编辑***可以校正基因组修饰。
本发明还提供了用于抑制细胞中、特别是G1细胞中的同源重组的方法，其包括抑制细胞中的BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装。在一个实施方案中，通过施用KEAP1或CRL3-KEAP1或其激动剂来抑制该相互作用。在一个实施方案中，通过施用USP11拮抗剂/抑制剂(例如米托蒽醌)来抑制该相互作用。在一个实施方案中，通过施用使用本发明的方法鉴定的抑制或阻止HR的试剂来抑制该相互作用。
本发明还提供了用于执行本发明方法的试剂盒。
本发明还提供了一种***，其包括：用于测定获自受试者的样品中USP11活性的水平、复合物或生物标志物水平的测定；用于处理结果的处理器；用于将结果与数据库进行比较的计算机编码指令；以及用于提供比较结果的用户显示。数据库可以包含USP11活性或生物标志物水平的参考值。
本发明还考虑了在本发明的方法、试剂盒和***在基因组修饰或编辑中的用途。
一方面，本发明还考虑了本发明的方法、组合物、试剂盒和***在基因组修饰或编辑中的用途，条件是所述用途不是通过手术或疗法治疗人或动物体的方法，以及条件是所述用途不是用于修饰人类的种系遗传同一性的方法。基因组修饰可以包括修饰细胞中的靶多核苷酸序列、修饰细胞中多核苷酸序列的表达、产生包含突变的疾病基因的模型细胞或敲除基因。本发明的用途还可包括通过***外源模板多核苷酸修复或编辑切割的靶多核苷酸，其中所述修复或编辑导致靶多核苷酸的一个或多个核苷酸突变，包括***、缺失或取代。
从下面的详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，尽管指出了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体示例仅以说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将是明显的。
附图描述
现在将参照附图描述本发明，其中：
图1.G1中BRCA1-PALB2相互作用的抑制是CRL3-KEAP1依赖性的。a，用于γ-H2AX、BRCA1和BRCA2免疫荧光处理的经辐照(2Gy)的G1-同步化的U2OS细胞的显微照片。DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；IR，电离辐射；WT，野生型。b，a和图5d中所示实验的定量。ASN，异步***细胞。WT，野生型(平均值±标准偏差(s.d.)，N＝3)。c，PALB2从自模拟-或X辐照-的S期或G1期同步化的293T细胞制备的提取物中免疫沉淀(IP)。进行正常免疫球蛋白(Ig)G免疫沉淀作为对照。细胞周期蛋白A染色确定细胞周期同步化。左侧数字表示kDa。凝胶来源数据见图5。d，图7a所示实验的定量。在处理用于显微术之前，辐照(20Gy)用指定的GFP-PALB2载体和短干扰(si)RNA转染的53BP1ΔU2OS细胞。(平均值±s.d.，N＝3)。e，从由所指定基因型的同步化和辐照的293T细胞制备的提取物中的正常IgG和PALB2免疫沉淀。左侧数字表示kDa。
图2.PALB2的泛素化阻止BRCA1-PALB2相互作用。a，PALB2 N末端和突变体的序列。[SEQ ID NO:1-3]b，源自表达指定的GFP-PALB2蛋白的G1-或S-期同步化的293T细胞的提取物的GFP免疫沉淀(IP)。c，CRL3-KEAP1对指定的HA标记的PALB2蛋白的体外泛素化。d，与MBP或MBP-BRCA1-CC一起孵育的泛素化HA-PALB2(1-103)的下拉测定。I，输入；FT，流过；PD，下拉。星号表示能够BRCA1结合的HA-PALB2的片段。b-d，左侧数字表示kDa。
图3.USP11妨碍CRL3-KEAP1的活性。a，源自用GFP-USP11构建体转染的指定基因型的喜树碱(CPT)处理的293T细胞的提取物的正常IgG或PALB2免疫沉淀(IP)。EV，空载体；CS，C318S；WT，野生型。b，用奥拉帕尼(olaparib)处理的指定基因型的293T细胞的克隆形成存活测定(平均值±s.d.，N≥3)。c，源自指定基因型的CPT处理的293T细胞的提取物的正常IgG或PALB2免疫沉淀。d，包含泛素化HA标记的PALB2(1-103)和增加浓度的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-USP11或其C270S(CS)突变体的去泛素化反应的免疫印迹。USP2用作对照。DUB，去泛素化酶。e，辐照(20Gy剂量)细胞周期同步化的U2OS细胞，并进行处理用于免疫印迹。IR，电离辐射。f，来自用指定siRNA转染的经辐照的U2OS细胞的提取物的免疫印迹。CTRL，对照。g，用指定siRNA转染的G1同步化和经辐照(20Gy)的53BP1ΔU2OS细胞的荧光显微照片。指出了具有多于5个γ-H2AX-共定位BRCA2聚集点的细胞的百分比(平均值±s.d.，N＝3)。比例尺，5μm。a、c、d、f，左或右侧数字表示kDa。
图4.G1期中HR的重新激活。a，用非靶向(CTRL)或KEAP1siRNA和表达野生型CtIP或T847E(TE)突变体的载体共转染的野生型(WT)和53BP1ΔU2OS细胞的定量，所述细胞在G1中同步化，经辐照(2Gy)并进行了用于γ-H2AX和RAD51免疫荧光的处理(平均值±s.d.，N＝3)。b，来自a的代表性的显微照片。IR，电离辐射。c，基因靶向测定的示意图。d，异步***(ASN)和G1停滞的U2OS细胞中的LMNA基因座处的基因靶向效率(平均值±s.d.，N＝3)。HR，同源重组；sgRNA，单引导RNA(single guide RNA)。e，用指定的siRNA或PALB2-KR表达载体转染的G1停滞的细胞中的LMNA基因座处的基因靶向(平均值±s.d.，N＝3)。f，同源重组的细胞周期调节的模型。
图5.G1 53BP1Δ细胞中DSB位点处PALB2-BRCA2积累的抑制。a，使用的人53BP1基因组织和sgRNA的靶向位点的示意图。框表示外显子(E：黄色，编码序列；棕色，非翻译区(UTR))。指出了通过CRISPR/Cas9引入的***缺失及其各自的频率。b，在处理用于53BP1荧光显微术之前，将野生型(WT)以及53BP1Δ和U2OS细胞进行模拟-或X-辐照(10Gy)。DAPI用于对DNA染色并追踪细胞核的轮廓。c，处理野生型(WT)和53BP1ΔU2OS细胞用于53BP1免疫印迹。微管蛋白用作上样对照。d，对在双胸苷阻断和释放之后在G1中同步化的或者异步***(ASN)的野生型(WT)和53BP1ΔU2OS细胞进行辐照(2Gy)和处理用于γ-H2AX、PALB2、BRCA2和BRCA1免疫荧光。关于G1中BRCA1和BRCA2染色的显微照片见图1a。e，在从双胸苷阻断释放之后在G1中同步化的野生型(WT)和3BP1ΔU2OS细胞进行辐照(20Gy)和处理用于γ-H2AX、BRCA1和BRCA2免疫荧光。左侧是G1停滞细胞的代表性显微照片，右侧显示完整实验的定量(平均值±s.d.，N＝3)。
图6.BRCA1-PALB2相互作用是细胞周期调节的。a，LacO/LacR染色质靶向***的示意图。b，用指定的mCherry-LacR和GFP融合物转染U2OS 256细胞。在lacO阵列-定位的mCherry焦点的位点处测量GFP荧光。每个圆代表一个分析的细胞，且条位于正中部。将细胞也用细胞周期蛋白A抗体染色以确定细胞周期位置(N＝3)。IR，电离辐射。c，用指定的mCherry-LacR和GFP融合物转染的U2OS 256细胞的代表性显微照片；数据在d中定量。d，用指定的mCherry-LacR和GFP融合物转染的U2OS 256细胞的定量以将BRCA1或PALB2系到lacO阵列(N＝3)。e，PALB2架构及其主要相互作用蛋白质的示意图。f，用指定的GFP-PALB2突变体和mCherry-LacR-BRCA1-CC转染的U2OS 256细胞的定量。细胞也用细胞周期蛋白A抗体染色以确定细胞周期位置(N＝3)。
图7.G1中BRCA1-PALB2相互作用的抑制依赖于CRL3-KEAP1。a，图1d所示实验的代表性照片。b，如图5a所述使用的人KEAP1基因组织和sgRNA的靶向位点的示意图。指出了通过CRISPR/Cas9引入的***缺失及其各自的频率。c，PALB2从由经辐照的293T细胞制备的提取物中免疫沉淀(IP)。进行正常IgG的IP作为对照。d，将具有指定基因型的293T细胞用指定的HA-KEAP1构建体转染、在G1或S期中同步化并辐照。处理细胞用于PALB2免疫沉淀(IP)。EV，空载体；WT，野生型。e，用指定的GFP-PALB2突变体和mCherry-LacR-BRCA1转染的U2OS256细胞的定量。细胞也用细胞周期蛋白A抗体染色以确定细胞周期位置(N＝3)。f，用GFP-PALB2和mCherry-LacR-BRCA1-CC(野生型或K1406R突变体)转染的U2OS 256细胞的定量。细胞也用细胞周期蛋白A抗体染色以确定细胞周期位置。该图表明，BRCA1的PALB2相互作用基序中的唯一赖氨酸不参与PALB2-BRCA1相互作用的细胞周期调节。e、f，每个圆代表分析的细胞，且条位于正中部(N＝3)。
图8.PALB2被CRL3-KEAP1泛素化。a，用指定的siRNA转染表达多西环素(DOX)诱导性His6-Ub的HEK293Flp-In T-REX细胞。处理细胞用于Ni-NTA下拉(IP)。b，处理用靶向USP11的siRNA和Flag-PALB2表达载体转染的293T细胞用于Flag免疫沉淀，然后进行质谱(MS)。示出了鉴定的胰蛋白酶二甘氨酸(diG)-PALB2肽的代表性MS/MS谱(K16，顶部；K43，底部)，c，lacO/LacR染色质靶向***和泛素化PALB2的体内定量的示意图。d，用指定的mCherry-LacR-PALB2载体转染的U2OS 256的代表性显微照片。处理细胞用于FK2免疫荧光。EV，空载体。比例尺，5μm。e，用指定的mCherry-LacR-PALB2载体转染的U2OS 256细胞的定量。处理细胞用于定量LacO焦点处的FK2荧光。每个圆表示分析的细胞，且条位于正中部(N＝3)。细胞也用细胞周期蛋白A抗体染色以确定细胞周期位置。通过Kruskall-Wallis检验确定统计学显著性(***P<0.001；**P<0.01)。
图9.PALB2和同源重组的KEAP1和USP11依赖性调节的分析。a，通过二氯丙酮连接进行残基20(PALB2-KC20-Ub)和45(PALB2-KC45-Ub)处HA-PALB2(1-103)的位点特异性化学泛素化。将得到的泛素化PALB2多肽及其修饰的对应物经受用MBP与BRCA1的卷曲螺旋结构域融合物(MBP-BRCA1-CC)的下拉。I，输入；PD，下拉。星号表示非特异性带。b，将野生型和KEAP1Δ293T细胞用环己酰亚胺(CHX)处理指定时间，然后处理用于NRF2和KEAP1免疫印迹。还测定肌动蛋白水平作为上样对照。c，USP11从由用或未用喜树碱(CPT；200nM)处理的293T细胞制备的提取物中免疫沉淀(IP)。进行正常IgG的免疫沉淀作为对照。d，用指定的siRNA转染U2OS DR-GFP细胞。转染后24小时，在具有或不具有I-SceI表达载体的情况下，用指定的siRNA抗性USP11表达载体(WT，野生型；CS，C318S和CA，C318A催化死亡突变体)或空载体(EV)进一步转染细胞。质粒转染后48小时测定每种条件的GFP阳性细胞的百分比，并将其归一化至I-SceI加非靶向(siCTRL)条件(平均值±s.d.，N＝3)。e，用于产生USP11Δ和USP11Δ/KEAP1Δ293T细胞的人USP11(顶部)和KEAP1(底部)基因组织和sgRNA的靶向位点(如图5a所示)的示意图。指出了通过CRISPR/Cas9引入的***缺失及其各自的频率。首先产生USP11敲除物，随后其用于制备USP11Δ/KEAP1Δ双突变体。f，PALB2从由用指定的siRNA转染并且利用或不用CPT(200nM)处理的293T细胞制备的提取物中免疫沉淀。进行正常IgG的免疫沉淀作为对照。
图10.USP11拮抗KEAP1对PALB2的作用。a，用指定的siRNA转染U2OS DR-GFP细胞或不转染(-)。转染后24小时，用I-SceI表达载体(圆)转染细胞。对于每种条件下，在质粒转染后48小时测定GFP阳性细胞的百分比，并将其归一化至I-SceI加非靶向(CTRL)条件(平均值±范围，N＝3)。b，将亲本293T细胞(野生型(WT))或USP11Δ衍生物用指定的GFP-PALB2构建体转染，用CPT处理并处理用于GFP免疫沉淀(IP)。c，用空载体(EV)或指定的PALB2表达载体转染亲本293T细胞(野生型)或USP11Δ衍生物。然后通过克隆形成存活测定(平均值±s.d.，N＝3)确定细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼的敏感性。
图11.USP11蛋白稳定性的表征。a,用环己酰亚胺(CHX)处理在G1或S/G2中同步化的U2OS细胞，并在指定的时间点处理以监测USP11稳定性。b，PALB2从由在G1或S期中同步化并用IR(20Gy)处理或未处理的293T细胞制备的提取物中免疫沉淀(IP)。c，将U2OS细胞以2或20Gy的剂量辐照，并在IR后的指定时间处处理用于USP11免疫印迹。肌动蛋白用作上样对照。d，将模拟处理或者与ATM抑制剂KU55933(ATMi)、ATR抑制剂VE-821(ATRi)或DNA-PKcs抑制剂NU7441(DNAPKi)一起孵育的U2OS细胞辐照(20Gy)，并且处理用于USP11和肌动蛋白(上样对照)免疫印迹。e，与d类似的实验，只是细胞暴露于紫外线(UV)辐射(50mJ/cm-2)。f，将模拟处理或与蛋白酶体抑制剂MG132孵育的U2OS细胞辐照(20Gy)，并处理USP11和肌动蛋白(上样对照)免疫印迹。g，将模拟处理或与Cullin抑制剂MLN4924一起孵育的U2OS细胞辐照(20Gy)，并且处理用于USP11和肌动蛋白(上样对照)免疫印迹。
图12.G1中RAD51上样和期外DNA合成的重新激活。a，将53BP1ΔU2OS细胞用指定的siRNA转染，通过从双胸苷阻断释放而在G1或S/G2中同步化并且辐照(20Gy)，之后处理用于荧光显微术。DAPI用于追踪核边界，且细胞周期蛋白A染色用于确定细胞周期位置。具有多于5个γ-H2AX-共定位PALB2聚集点的细胞的百分比表示为平均值±s.d.，N＝3。比例尺，5μm。b，用指定的siRNA转染并表达野生型CtIP的经辐照的G1同步化的野生型(WT)和53BP1ΔU2OS细胞的代表性显微照片。c，用指定的siRNA转染并表达CtIP(T847E)的经辐照的G1同步化野生型U2OS细胞的代表性显微照片。d，U2OS 53BP1Δ细胞在G1中同步化，补充BrdU，辐照(2Gy)并处理用于γ-H2AX和BrdU免疫荧光。指出了具有多于5个γ-H2AX-共定位BrdU聚集点的细胞的百分比(平均值±s.d.，N＝3)。e，用CRISPR-mClover***靶向的U2OS细胞的显微照片，显示了核纤层蛋白A的典型的核周表达模式。f，用mClover***靶向的U2OS细胞的显微照片，显示了亚核PML聚集点的表达模式特征。g，图4d所示的基因靶向(LMNA)实验的时间线。h，图4e和图13所示的基因靶向(LMNA或PML)实验的时间线。
图13.G1中同源重组的分析。a，用增加量的供体模板转染并且具有(灰色)或不具有(白色)sgRNA转染的异步***的U2OS细胞中LMNA基因座处基因靶向效率的定量。通过流式细胞术检测基因靶向事件(平均值±s.d.，N≥3)。b，用指定的siRNA转染的异步***细胞中LMNA基因座处基因靶向效率的定量。通过流式细胞术检测基因靶向事件(平均值±s.d.，N＝3)。c，在表达CtIP(T847E)突变体并用指定的siRNA或PALB2-KR表达构建体共转染的G1停滞的53BP1ΔU2OS细胞中，通过流式细胞术测量的PML基因座处的基因靶向效率(平均值±s.d.，N＝3)。d，用KEAP1 siRNA转染并表达CtIP(T847E)突变体的G1停滞的亲本(野生型(WT))和53BP1ΔU2OS细胞中，通过流式细胞术测量的LMNA基因座处的基因靶向效率(平均值±s.d.，N＝3)。e，用指定的siRNA转染并表达野生型或CtIP(T847E)突变体的G1停滞的亲本(野生型(WT))和53BP1ΔU2OS细胞中，通过流式细胞术测量的LMNA基因座处的基因靶向效率(平均值±s.d.，N＝3)。
图14鉴定DCAF10作为响应于DNA损伤的USP11稳定性的调节物。一个。a，siRNA筛选，其中用靶向已知和预测的DCAF以及其他CUL4相互作用蛋白的siRNA转染U2OS细胞。用IR(20Gy)或UV(50J/m-2)辐照细胞，使其恢复3小时，然后处理用于USP11免疫荧光。经作图的每个点对应于辐照后留下的USP11的百分比。红色点对应于siRNA非靶向对照(CTRL)和靶向USP11，而红点对应于核心CRL4因子，包括CUL4本身。b，将U2OS细胞用指定的siRNA转染，然后以20Gy的剂量辐照，并在电离辐射后的指定时间处理用于USP11免疫印迹。肌动蛋白用作上样对照。
图15.验证DCAF10作为USP11的调节物。a，DCAF10与USP11相互作用。Flag-USP11从由293Flp-IN/T-Rex细胞制备的提取物中免疫沉淀(IP)。用DCAF10和DCAF15抗体探测细胞。b，处理指定基因型的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的全细胞提取物用于USP11免疫印迹。微管蛋白被用作上样对照。c.用指定的siRNA或表达载体转染U2OS DR-GFP细胞。转染后24小时，用I-SceI表达载体转染细胞。在质粒转染后48小时测定每种条件的GFP阳性细胞的百分比，并将其归一化至I-SceI加非靶向(CTRL)+空载体(EV)条件。
图16.KEAP1抑制可以激活G1细胞中的HR。用指定的siRNA和表达R1 KEAP1抑制剂或其FN3骨架对照的载体转染的G1停滞细胞中LMNA基因座处的基因靶向(平均值±s.d.，N＝3)。
发明详述
除非另有说明，否则所公开的试剂的制备和使用以及本文采用的方法的实践使用如本领域技术人员所知分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中的常规技术。这些技术在文献中得到充分的公开。[参见，例如，Sambrook等.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989以及第三版,2001；Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,1987以及定期更新；the series Methods inEnzymology,Academic Press,San Diego；Wolffe,Chromatin Structure and Function,第三版,Academic Press,San Diego,1998；Methods in Enzymology,第304卷,"Chromatin"(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑),Academic Press,San Diego,1999；以及Methods in Molecular Biology,第119卷,"Chromatin Protocols"(P.B.Becker编辑)Humana Press,Totowa,1999]。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下定义补充了本领域中的那些，并针对本申请，而不用于任何相关或不相关的情况。虽然在本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了特定的材料和方法。
如本文和所附权利要求中所使用的，未用数量词限定的名词包括复数参考，除非上下文另有明确规定。如本文所使用的，“包括/包含(comprising)”(以及包括的任何形式，例如“包括/包含(comprise)”和“包括/包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包含的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及包括的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，不排除额外的未列举的元素或方法步骤。
“基因编辑***”是用于靶向和编辑基因组的***，包括但不限于TALEN(转录激活物样效应核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases))***、CRISPR(成簇规律性间隔短回文重复(Clustered Regulatory Interspaced Short PalindromicRepeats))***和锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases)(ZFN)***(参见Nemudryi A.A.等,Acta Naturae.2014年7月至9月；6(3):19–40对TALEN和CRISPR***的综述；Gaj T.等,Trends Biotechnol.2013年7月；31(7):397–405对TALEN、CRISPR和ZFN***的综述；美国公开专利申请No.20110145940描述了TALEN***；以及Bibikova M.,等,Genetics.2002；161(3):1169–1175；Townsend J.A.,等,Nature 2009；459(7245):442–445；Zhang F.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2010；107(26):12028–12033；Torikai H.,等；Blood.2012；119(24):5697–5705；Provasi E.,等,J..Nat.Med.2012；18(5):807–8151，和Lombardo A.,等,Nat.Methods.2011；8(10):861–869，描述了ZFN***)。
“CRISPR***”通常是指涉及成簇规律性间隔短回文重复(CRISPR)相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件。CRISPR***可以包括但不限于编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配偶序列、引导序列或其他序列和来自CRISPR基因座的转录物。CRISPR***的一个或多个元件可源自I型、II型或III型CRISPR***。CRISPR***促进靶序列位点处CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白质复合的引导序列)的形成。“靶序列”或“靶多核苷酸”是指与设计的引导序列充分互补的序列，使得靶序列与促进CRISPR复合物形成的引导序列杂交。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸，并且它可以位于细胞核、细胞质或细胞器，例如线粒体或叶绿体中。在内源性CRISPR***的情况下，内源CRISPR***中CRISPR复合物的形成导致靶序列中在或附近(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对以内)的一条或两条链裂解。
CRISPR***描述在以下中：美国专利No.8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418和8,895,308；美国专利公开US 2014-0310830、US 2014-0287938、US 2014-0273234、US2014-0273232、US 2014-0273231、US 2014-0256046、US 2014-0248702)、US 2014-0242700、US 2014-0242699、US 2014-0242664、US2014-0234972、US 2014-0227787、US 2014-0189896、US 2014-0186958、US 2014-0186919、US 2014-0186843、US 2014-0179770和US 2014-0179006、US 2014-0170753和US20150232883；欧洲专利申请EP 2771468(EP13818570.7)、EP 2764103(EP13824232.6)和EP2784162(EP14170383.5)；以及PCT专利公开WO2014/093661(PCT/US2013/074743)、WO2014/093694(PCT/US2013/074790)、WO2014/093595(PCT/US2013/074611)、WO2014/093718(PCT/US2013/074825)、WO2014/093709(PCT/US2013/074812)、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO2014/093635(PCT/US2013/074691)、WO2014/093655(PCT/US2013/074736)、WO2014/093712(PCT/US2013/074819)、WO2014/093701(PCT/US2013/074800)、WO2014/018423(PCT/US2013/051418)和WO2014/093622(PCT/US2013/074667)。CRISPR-Cas***的一般信息还描述在以下出版物中：Cong,L.,等,Science,2月15日；339(6121):819-23(2013)；Jiang W.,等,Nat Biotechnol 3月；31(3):233-9(2013)；Wang H.,等,Cell 5月9日；153(4):910-8(2013)；Konermann S,等,Nature.2013年8月22日；500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.Epub 2013年8月23日；Ran,F A.,等,Cell 8月28日.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013)；Hsu,P.,等,Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013)；Ran,F A.,等,Nature Protocols 11月；8(11):2281-308.(2013)；Shalem,O.,等,Science 12月12日.(2013).[先于印刷的电子出版物]；Nishimasu,H.,等,Cell 2月27日.(2014).156(5):935-49；Wu X.,等,Nat Biotechnol.(2014)4月20日.doi:10.1038/nbt.2889；Platt等,Cell 159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014；Hsu等Cell 157,1262-1278(2014年6月5日)(2014)；Wang等,Science.2014年1月3日；343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981；Doench等,Nature Biotechnology 2014年9月3日在线公开；doi:10.1038/nbt.3026；Storrs,The Scientist,Article No.39239,2014年3月1日；以及Swiech等,Nature Biotechnology；2014年10月19日在线公开；doi:10.1038/nbt.3055)。多种程序可用于设计引导序列，例如由德国癌症研究中心(GermanCancer Research Center)开发的MIT’s CRISPR Design[http://crispr.mit.edu]和E-CRISP[www.e-crisp.org/E-CRISP]。CRISPR***还包括由以下开发或可获自以下的***：Editas Medicine(Cambridge,MA)、Caribou Biosciences(Berkeley,CA)、CRIPSRTherapeutics(Basel,Switzerland)、Addgene(Cambridge,MA)和Intellia Therapeutics(Cambridge,MA)。
“DNA末端切除”通常是指DNA双链断裂的5'末端链的核裂解降解，导致形成3'-封端的单链DNA。真核生物中的DNA末端切除包括两个阶段：由哺乳动物中的Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)复合物催化的缓慢的初始阶段，以及由外切核酸酶Exo1或解旋酶布鲁姆综合征蛋白(Bloom Syndrome Protein，BLM)催化的第二和更快的阶段。DNA末端切除以细胞周期激活步骤开始，其包括辅助蛋白CtIP(也称为视网膜母细胞瘤结合蛋白8)的磷酸化。可以通过抑制TP53BP1(53BP1)或RIF以刺激或激活BRCA1募集到DNA双链断裂或者阻断53BP1或RIF募集到DNA双链断裂位点来激活参与DNA末端切除的途径。一方面，可以通过抑制53BP1(或RIF)表达和/或活性以及表达模拟组成型磷酸化的CtIP的突变形式(例如CtIP-Thr879Glu)来激活DNA末端切除。一方面，使用53BP1的抑制剂和模拟组成型磷酸化的CtIP的突变形式，特别是CtIP-Thr879Glu来重构或激活DNA末端切除。一方面，可以使用以下纯化的人蛋白质重构或激活DNA末端切除：布鲁姆解旋酶(Bloom helicase)(BLM)；DNA2解旋酶/核酸酶；外切核酸酶1(EXO1)；包含MRE11、RAD50和NBS1的复合物(MRN)；和复制蛋白A(RPA)(参见Nimonkar A.V.等,Genes&Development 25:350-362,2011；Huertas,P,Nat Struct MolBiol,17(10:11-16,doi:10.1038/nsmb.1710,2010；Jimeno S.,等,Nucl.Acids Res doe:101093/nar/gkui384,2015对于DNA末端切除的描述)。
“同源重组”和“HR”是指其中交换相似或相同核苷酸序列的DNA链的一种类型的遗传重组。细胞可以使用HR来通过以下一般步骤修复DNA双链断裂(DSB)。当DSB被核酸酶和解旋酶切除时HR开始，产生3'单链DNA(ssDNA)突出端，RAD51重组酶在其上组装成核蛋白丝。这种结构可以侵入同源双链体DNA，其用作修复DNA合成的模板。所得到的中间体可以被代谢以产生非交叉产物，从而恢复受损的DNA分子，如其在双链断裂之前存在的一样(SanFilippo等,Annu.Rev.Biochem.2008.77:229–57)。该术语还包括使用单链供体寡核苷酸(ssODN)的重组，特别是使用需要切除并且可被53BP1抑制剂激活的单链供体寡核苷酸(ssODN)的重组。
“HR疾病”是指被认为或诊断为可能与HR缺陷相关或特征为HR缺陷的病症的任何病症、疾病、疾患、综合征或者表现或症状的组合。示例性疾病包括例如癌症；心血管疾病，包括心力衰竭、高血压和动脉粥样硬化；呼吸***疾病；肾病；胃肠疾病，包括炎性肠病，例如克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎；肝、胆囊和胆管疾病，包括肝炎和肝硬化；血液病、代谢疾病、内分泌和生殖疾病，包括糖尿病；骨和骨矿物质代谢疾病；免疫***疾病，包括自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、红斑狼疮和其他自身免疫疾病；肌肉骨骼和***疾病，包括关节炎、软骨发育不良感染性疾病；和神经***疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)和帕金森病(Parkinson’sdisease)。
本发明的方法可用于监测或治疗由介导同源重组的基因中的缺陷引起的疾病，所述基因例如BRCA1、BRCA2、PALB2、PARP-1、USP11、RAD51和/或DCAF10。
本发明的实施方案提供用于监测或治疗各种癌症，包括但不限于癌、黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤、骨肉瘤、神经肿瘤以及器官如乳腺、卵巢和***的癌症。
在实施方案中，本发明提供监测或治疗具有BRCA-1缺陷、BRCA-2缺陷、双重BRCA-1/BRCA-2缺陷的癌症和范可尼贫血(Fanconi anemia)。在本发明的实施方案中，癌症是乳腺癌，特别是浸润性导管癌和浸润性小叶癌。在本发明的实施方案中，癌症是卵巢癌，特别是上皮卵巢肿瘤、生殖细胞卵巢肿瘤和性索间质瘤。
用于激活或调节同源重组的本发明的方法可用于遗传修饰与遗传病症相关的多核苷酸。在一些实施方案中，遗传病症是单基因病症。在一些实施方案中，遗传病症是多基因病症。在一些实施方案中，遗传病症与一个或多个SNP相关。在本发明的具体实施方案中，基因组修饰校正点突变。
遗传病症以及与遗传病症相关的多核苷酸序列的实例可以在万维网上找到(参见例如，美国国家生物技术信息中心，美国国家医学图书馆(National Center forBiotechnology Information,National Library of Medicine)(Bethesda,MA)或麦库斯克-内森斯遗传医学研究所，约翰霍普金斯大学(McKusick-Nathans Institute ofGenetic Medicine,Johns Hopkins University)(Baltimore,Md))，列在公开的专利和申请中(参见例如，美国公开申请No.2015/0247150)以及出版物中(参见例如，Turitz CoxD.B.等,Nature Medicine 21,121-131,2015；和O’Connor T.P.和R.G.Crystal,NatureReviews/Genetics第7卷,2006年4月,第261-276页，包括补充信息，以及其中引用的出版物)。
一方面，遗传病症是肌肉遗传病症。一方面，遗传病症是1型肌强直性营养不良。一方面，遗传病症是2型肌强直性营养不良。一方面，遗传病症是杜氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)。一方面，遗传病症是贝克肌营养不良(Becker musculardystrophy)。
一方面，遗传病症是肝脏的遗传病症，例如α-1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病(Wilson Disease)、遗传性血色素沉着症、I型酪氨酸血症、IV型糖原贮积病、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬素缺乏症、胆固醇酯贮积病和遗传性果糖不耐症。
一方面，遗传病症是α-1抗胰蛋白酶缺乏症，其为由编码丝氨酸蛋白酶抑制剂AAT的SERPINA1基因中的突变导致的常染色体隐性(共显性)疾病。
一方面，遗传病症是威尔逊病，其取决于编码ATP7B Cu转位酶的基因的突变，所述蛋白主要由肝细胞表达、调节肝脏中的铜含量。
一方面，遗传病症是肺遗传病症。
一方面，遗传病症是囊性纤维化，由囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)蛋白的突变导致的常染色体隐性疾病，所述蛋白是跨膜蛋白的ATP结合盒超家族成员。
在本发明的其他方面，遗传病症可以是血友病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、卡纳万病(Canavan disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、X连锁严重联合免疫缺陷症、家族性淀粉样变性多发性神经病、地中海贫血、泰萨氏病(Tay-Sachs disease)、晚期婴儿蜡样脂质褐质沉积病(late infantile ceroid lipofuscinosis)、黏多糖病、尼曼-皮克病(Niemann–Pickdisease)、软骨发育不良、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、弗雷德里克共济失调(Fredriechataxia)、肌萎缩性侧索硬化、单基因高胆固醇血症和其他单基因疾病。
在本发明的各方面中，遗传病症是镰状细胞性贫血，并且本发明的方法包括用其旁系同源HBD通过基因转化来校正突变的HBB血红蛋白基因。
“有效量”是指有效实现特定生物学结果的如本文所述的化合物或组合物的量。这样的结果包括但不限于如通过本领域合适的任何方法确定的本文公开的疾病或疾患的治疗。
“PARP抑制剂”是指核酶聚(腺苷5'-二磷酸-核糖)聚合酶[“聚(ADP-核糖)聚合酶”或“PARP”)的抑制剂，其还被称为ADPRT(NAD:蛋白质(ADP-核糖基转移酶(聚合))和PARS(聚(ADP-核糖)合成酶)。PARP抑制剂已经在以下中描述：Banasik等,"Specific Inhibitorsof Poly(ADP-Ribose)Synthetase and Mono(ADP-Ribosyl)-Transferase",J.Biol.Chem.,267:3,1569-75(1992)，以及Banasik等,"Inhibitors and Activators ofADP-Ribosylation Reactions",Molec.Cell.Biochem.,138,185-97(1994)。PARP抑制剂已经公开和描述在以下专利和专利申请中：WO 00/42040；WO 00/39070；WO 00/39104；WO 99/11623；WO 99/11628；WO 99/11622；WO 99/59975；WO 99/11644；WO 99/11945；WO 99/11649；和WO 99/59973；美国专利No.8,894,989，美国专利No.8,946,221；8,778,966；8,669,249；8,623,884；8,592,416；8,546,368；8,541,417；8,541,403；8,420,650；8,362,030；8,236,802；8,217,070；8,188,103；8,188,084；8,183,250；8,173,682；8,129,382；8,088,760；8,080,557；8,071,623；8,058,275；8,012,976；8,008,491；7,999,117；7,956,064；7,875,621；7,820,668；7,750,008；7,732,491；7,728,026；7,652,014；7,601,719；7,462,724；7,087,637；7,041,675；6,977,298；6,924,284；6,737,421；6,635,642；6,495,541；6,444,676；6,395,749；6,380,211；6,380,193；6,346,536；6,197,785；5,756,510；和Re.36,397。
在本发明的各方面中，PARP抑制剂是奥拉帕尼(Olaparib)(AstraZeneca)。在本发明的各方面中，PARP抑制剂是维利帕尼(Veliparib)(AbbVie Inc,Chicago,IL)。在本发明的各方面中，PARP抑制剂是瑞卡帕布(Rucaparib)(Clovis Oncology,Inc.,Boulder,CO)。在本发明的各方面中，PARP抑制剂是INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Corp,Lexington,MA)。在本发明的各方面中，PARP抑制剂是MK-4827(尼拉帕尼(niraparib))(Tesaro,Waltham,MA,还参见Montoni等,Frontiers in Pharmacology,[4],Article 18,第1-7页)。在本发明的各方面中，PARP抑制剂是talazoparib(Medivation,Inc,SanFrancisco CA)。
“样品”是源自任何生物来源的样品，例如组织、提取物或细胞培养物，包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞系、细胞裂解物和生理液体，诸如，例如，血液或其亚群(例如白细胞、红细胞)、血浆、血清、唾液、眼晶状体液、脑脊液、汗液、尿液、粪便、泪液、支气管灌洗液、拭子、乳汁、腹水、***抽吸物、针抽吸物、滑液、腹膜液、灌洗液等。样品可获自动物，优选哺乳动物，最优选人。样品可以来自单个个体或在分析之前汇集。样品可以在使用前进行处理，例如从血液制备血浆，稀释粘稠流体等。处理样品的方法可以包括过滤、蒸馏、提取、离心、浓缩、干扰成分的灭活、加入试剂等。
在本发明方法的实施方案中，样品是哺乳动物组织样品。在另一个实施方案中，样品是细胞裂解物。在另一个实施方案中，样品是细胞。在另一个实施方案中，样品是人生理液体。在一个具体实施方案中，样品是人血清。在另一个实施方案中，样品是白细胞或红细胞。
术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换指代温血动物如哺乳动物。特别地，术语是指人。受试者、个人或患者可罹患或疑似患有或易感于于如本文所述的疾病。该术语还包括饲养用于食物、作为宠物或用于研究的动物，包括马、牛、羊、家禽、鱼、猪、猫、狗和动物园动物山羊、猿(例如大猩猩或黑猩猩)和啮齿动物如大鼠和老鼠。
USP11、PALB2、BRCA1、BRCA2、KEAP1、53BP1、DCAF10、RBX1、CUL3和CtIP的NCBI登录号在表1中，且USP11、PALB2、BRCA1、BRCA2、KEAP1、53BP1、DCAF10、RBX1、CUL3和CtIP的人序列在序列表中。
筛选和监测测定
本发明提供了用于通过测定BRCA1和PALB2的相互作用、BRCA1、PALB2和BRCA2的相互作用、USP11和DCAF10的相互作用和/或USP11和PALB2的相互作用来监测USP11的活性或表达的方法。本领域技术人员已知的常规方法可用于测定样品中的蛋白质相互作用。例如，可以使用亲和技术如基于免疫的纯化(例如免疫亲和色谱)分离BRCA1-PALB2、BRCA1-PALB2-BRCA2、USP11-DCAF10或USP11-PALB2复合物，可以使用常规方法(例如凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱)由分离的复合物制备肽，以及可以对肽或肽片段进行质谱(例如，定量质谱，如选择的反应监测质谱(sMRM)、非高分辨率数据依赖性分析(SWATH)、高分辨率多反应监测(MRMHR)或基于MS1的定量)。
本发明还提供了用于通过测定PALB2的N-末端的泛素化来监测USP11的活性的方法。本领域技术人员已知的常规方法可用于测定样品中的泛素化。例如，可以通过测量PALB2的变化(例如，重量，参见美国专利No.6,413,725)、与CRL3-KEAP1 E3连接酶结合的聚泛素的量(参见例如EP 1268847)和/或CRL3-KEAP1 E3连接酶的活性(参见例如美国公开No.2013/0116152)来测定泛素化或PALB2。还可以使用质谱技术，例如选择的反应监测质谱(sMRM)、非高分辨率数据依赖性分析(SWATH)、高分辨率多反应监测(MRMHR)或基于MS1的定量)来监测在蛋白酶消化后来自PALB2N的肽上的泛素残余物。在更具体的实例中，对应于泛素化PALB2的胰蛋白酶消化物的同位素标记的合成肽，尤其是对应于Lys14、Ly16、Lys20、Lys25、Lys30、Lys43或Lys45上的泛素化的那些的制备物可用作内标物以定量PALB2泛素化的程度。
一方面，本发明提供了用于测定样品中PALB2多肽的泛素化的方法，所述方法包括用蛋白酶消化样品中的泛素化PALB2多肽，从而产生多种测试肽；通过质谱测定测试肽的泛素和赖氨酸残基之间的至少一个异肽键的存在以确定泛素化位点的数目，从而确定样品中PALB2多肽的泛素化的数量。在一个实施方案中，测试肽来自PALB2N末端。在一个实施方案中，赖氨酸残基对应于Lys14、Lys16、Lys20、Lys25、Lys30、Lys43或Lys45。所述方法可以利用对应于PALB2的不同肽子序列的肽内标物，以在定量测定中提供对照。一方面，产生对应于PALB2的不同的合成肽内标物并进行差异标记。
邻近连接测定(Proximity ligation assays，PLA)也可以用于通过使用基于DNA的检测来测定BRCA1和PALB2和/或PALB2-相互作用蛋白(例如BRCA2)之间的相互作用来测定USP11的活性。例如，将针对相互作用的结合配偶体(例如PALB2和BRCA1)的一抗加入到细胞裂解物中。称为PLA探针或邻近探针(proximity probe)的第二组抗体识别第一组一抗。PLA探针含有当密切邻近时组装成测定特异性DNA分子的DNA链。然后可以使用这种DNA分子并且使用例如荧光探针检测。[参见，例如，Soderberg O.等,Nat.Methods.,2006年12月；3(12):995-1000；Jarvius M.等,Mol.Cell.Proteomics,2007年9月；6(9):1500-9)]。
一方面，本发明提供了用于测定样品中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的方法，其包括：使样品与相互作用中的每一结合配偶体的一抗接触；使样品与包含与相应一抗结合的二抗的邻近探针接触，其中每个邻近探针具有与其缀合的寡核苷酸；其中当所述邻近探针的寡核苷酸彼此充分邻近时，所述邻近探针的寡核苷酸相互作用形成环形产物，将其通过滚环复制进行扩增，产生扩增产物；以及测量扩增产物，从而测定或测量相互作用。
监测PALB2(或相关蛋白如BRCA2)与BRCA1原位共定位的测定也可提供监测USP11活性的方法(参见本文实施例)。例如，DNA损伤位点处的PALB2定位(由BRCA1或其他标记如γ-H2AX标记)依赖于USP11活性。在这样的测定中，将细胞固定、透化，然后与检测PALB2、BRCA2或其相关蛋白(例如BRCA1)的抗体一起孵育。添加标记的二抗能够使在称为聚集点的亚核结构中的DNA损伤位点处的蛋白质积累的原位可视化。添加基因毒性损伤(如电离辐射或其他致染色体断裂的处理)会增加“聚集点”的数量，并且可以被包括以增加测定的动态范围。
应当理解，邻近连接测定和原位共定位测定可用于测定本文公开的任何相互作用。
本发明的方法可以在存在或不存在测试化合物或试剂的情况下进行，并且在不存在测试化合物或试剂的情况下，检测出与对照相比，USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1复合物、CRL3-KEAP1-PALB2复合物和KEAP1-PALB2复合物中的一种或多种的活性或表达的增加或减少表明，测试化合物或试剂可用作治疗剂，或用于调节同源重组。
一方面，本发明提供了通过使用本发明方法确定试剂对USP11活性的影响来鉴定或评价试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力的方法。一方面，对USP11的负面影响表明该试剂是PARP抑制剂的细胞敏化剂，或可以逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现。一方面，对USP11的正面影响表明该试剂是PARP抑制剂的较差的细胞敏化剂。一方面，通过在与获自对照的这样的水平相比时USP11活性水平的降低来确定试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力。一方面，通过在与获自对照的这样的水平相比时USP11活性水平的升高来确定试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力。
本发明还涉及通过确定试剂对KEAP1、CRL3-KEAP1或KEAP1-PALB2的影响来鉴定或评价试剂使细胞对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力的方法。一方面，对KEAP1的负面影响(KEAP1或CRL3-KEAP1活性的丧失)表明该试剂是PARP抑制剂的较差的细胞敏化剂。一方面，对KEAP1或CRL3-KEAP1活性的正面影响表明该试剂是PARP抑制剂的细胞敏化剂，或可以逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现。一方面，通过在与获自对照的这样的水平相比时KEAP1、CRL3-KEAP1、KEAP1-PALB2或CRL3-KEAP1活性或表达的水平的升高来确定试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力。一方面，通过在与获自对照的这样的水平相比时KEAP1、CRL3-KEAP1、KEAP1-PALB2或CRL3-KEAP1活性或表达的水平的降低来确定试剂使对PARP抑制剂敏感或者逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的能力。
本发明还考虑了检测抗癌剂的方法，其包括进行测试测定，包括使永生化细胞与测试化合物接触并且使用本发明方法测量USP11活性或CRL3-KEAP1，并与在不存在测试化合物的情况下的对照测试测定进行比较。一方面，通过测量细胞中的USP11、PALB2、DCAF10、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1和/或CRL3-KEAP1-PALB2复合物来测定USP11活性。一方面，检测出与对照相比试剂对USP11活性或表达的负面影响指示潜在的抗癌剂或PARP抑制剂敏化剂。一方面，检测出与对照相比试剂对BRCA1-PALB2-BRCA2复合物和/或PALB2-USP11复合物活性或表达的负面影响指示潜在的抗癌剂或PARP抑制剂敏化剂。一方面，检测出与对照相比试剂对KEAP1、CRL3-KEAP1和/或CRL3-KEAP1-PALB2复合物活性或表达的正面影响指示潜在的抗癌剂或PARP抑制剂敏化剂。一方面，在与获自对照的这样的水平相比时USP11活性水平的降低指示所述试剂具有抗癌活性或者是PARP抑制剂敏化剂。
本发明提供了鉴定或评价试剂调节同源重组的能力的方法，其包括确定测试化合物或试剂对以下一种或多种的影响：USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1复合物和CRL3-KEAP1-PALB2复合物。一方面，本发明提供了鉴定或评价试剂调节细胞中的同源重组的能力的方法，其包括：(i)在存在或不存在所述试剂的情况下，在样品中测定细胞中的USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1和/或CRL3-KEAP1-PALB2复合物；以及(ii)检测与对照相比样品中USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1复合物和/或CRL3-KEAP1-PALB2复合物的增加或减少，作为试剂调节同源重组的能力的指示。
本发明提供筛选用于治疗与HR缺陷相关的疾病(即HR疾病)的治疗剂的方法，其包括鉴定破坏或调节以下中的一种或多种的试剂：USP11、PALB2、PALB2泛素化、DCAF10、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、KEAP1、USP11-DCAF10复合物、CRL3-KEAP1或CRL3-KEAP1-PALB2复合物。一方面，检测出与对照相比试剂对USP11、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物和/或PALB2-USP11复合物活性或表达的正面影响指示用于治疗HR疾病的潜在治疗剂。一方面，检测出与对照相比试剂对DCFA10、KEAP1、CRL3-KEAP1或CRL3-KEAP1-PALB2复合物活性或表达的负面影响指示用于治疗HR疾病的潜在治疗剂。
用于本发明方法的测试化合物可以呈分离形式或在混合物中的任何产物。测试化合物可以通过结构或功能来限定，或者可以是未限定的。未限定的测试化合物的实例包括但不限于组织样品、生物流体、细胞上清液、植物制备物等。测试化合物可以是肽，例如可溶性肽，包括Ig-尾融合肽、随机肽文库的成员和由D-和/或L-构型氨基酸制成的组合化学来源的分子文库、碳水化合物、核酸、反义分子、磷酸肽(包括随机或部分简并的定向磷酸肽文库的成员)、抗体[例如，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合、单链抗体，片段(例如Fab、F(ab)2和Fab表达文库片段及其表位结合片段)]、小有机或无机分子或化合物文库。测试化合物可以是内源性生理化合物或天然或合成化合物。
在实施方案中，用于鉴定试剂、特别是抗癌剂的本发明的方法包括平行地接触多于一种测试化合物。在一些实施方案中，所述方法包括平行地接触2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、1000、至少2、至少5、至少10、至少50、至少100或至少1000种测试化合物。在一些实施方案中，测定了化合物和完整组合文库的高通量筛选。用于执行高通量筛选的方法是本领域公知的。这些方法也可以是自动化的，使得机器人可以执行实验。
在实施方案中，用于鉴定试剂、特别是抗癌剂的本发明的方法包括在测试化合物的存在下接触细胞的步骤。然后可以观察细胞以确定测试化合物是否影响USP11活性、DCAF10、PALB2、PALB2的泛素化、KEAP1、CRL-KEAP1活性、BRCA1和PALB2的相互作用、USP11和PALB2的相互作用、USP11和DCAF10的相互作用，和/或BRCA1、PALB2和BRCA2的相互作用。可以进行阳性和阴性对照，其中分别将已知量的测试化合物和无化合物加入到测定中。本领域技术人员可以选择并进行适当的对照。
测试化合物的活性可能是未知的，并且本发明的方法可用于鉴定表现出所选性质的化合物(例如PARP抑制剂敏化剂)。在一些实施方案中，测试化合物的活性或活性类型是已知或预期的，并且本发明的方法可用于进一步表征或优化活性(例如特异性，效力等)。
本发明的方法还可以包括在测试化合物的存在下测定PARP活性。可以通过使用本领域普通技术人员的常规方法测量聚(ADP-核糖)聚合物(PAR)的变化以及测量NAD水平和/或ATP水平来测定PARP活性。在一些实施方案中，在测试化合物存在下，NAD的水平被耗竭。在一些实施方案中，在测试化合物存在下，ATP的水平被耗竭。在一些实施方案中，在测试化合物存在下，NAD的水平升高。在一些实施方案中，在测试化合物存在下，ATP的水平增加。
本发明的方法可以包括确定在施用测试化合物后细胞是否经历坏死的步骤。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来分析细胞的物理特性以确定细胞是否经历坏死。例如，可以通过测量细胞器肿胀、质膜分解、细胞内液泡形成和核降解而不凝结来确定坏死。
本发明的筛选方法还可以包括对所鉴定的试剂或其其他类似物在动物中的效力和毒性进行治疗图谱表征；任选地配制包含一种或多种被鉴定为具有可接受的治疗特性的试剂的药物组合物；以及任选地向受试者或个体施用所述试剂。
一方面，可以使用合适的动物模型在体内评价使用本发明的方法鉴定的试剂和组合物的治疗活性。因此，本发明的筛选方法还可以包括进行包括向合适的动物模型施用所述试剂的体内研究。
本发明还提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明方法测定来自受试者的样品中的以下一种或多种：USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物和CRL3-KEAP1-PALB2复合物或PALB2泛素化。与对照相比，USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物和CRL3-KEAP1-PALB2复合物或PALB2泛素化中的一种或多种的显著不同的水平指示对于PARP抑制剂的响应性(例如灵敏度)。
一方面，本发明提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法检测来自所述受试者的样品中的USP11、BRCA1、BRCA2、PALB2和KEAP1。在一个实施方案中，与对照相比USP11、BRCA1、BRCA2、PALB2和KEAP1的显著不同的水平指示对于PARP抑制剂的响应性(例如灵敏度)。
一方面，本发明提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法使用本发明的方法检测来自所述受试者的样品中的USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB、KEAP1和CRL3。在一个实施方案中，与对照相比，USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB、KEAP1和CRL3的显著不同的水平指示对于PARP抑制剂的响应性(例如灵敏度)。
一方面，如果与对照相比，USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化中的一种或多种减少，则将受试者归类为对PARP抑制剂响应。一方面，如果与对照相比，USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化中的一种或多种增加，则将受试者归类为对PARP抑制剂响应。在一个实施方案中，与对照相比USP11活性的显著不同的水平(例如较低水平)指示对PARP抑制剂的敏感性。
一方面，本发明提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自所述受试者的样品中USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3和CRL3-KEAP1活性或表达或者PALB2泛素化中的一种或多种以及与对照进行比较以确定所述受试者是否对PARP抑制剂具有响应(例如敏感)。
一方面，本发明提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自所述受试者的样品中USP11、BRCA1、BRCA2、PALB2和KEAP1活性或表达以及与对照进行比较以确定所述受试者是否对PARP抑制剂具有响应(例如敏感)。
一方面，本发明提供了在受试者中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自所述受试者的样品中USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1和CRL3活性以及与对照进行比较以确定所述受试者是否对PARP抑制剂具有响应(例如敏感)。
一方面，本发明提供了在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括使用本发明的方法测定来自所述个体的样品中的USP11活性或表达。在一个实施方案中，与对照相比USP11活性或表达的显著不同的水平(例如较低水平)指示对PARP抑制剂的敏感性。
一方面，本发明提供了在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自所述个体的样品中的KEAP1以及与对照进行比较以确定所述受试者是否对PARP抑制剂敏感。在一个实施方案中，与对照相比KEAP1的显著不同的水平(例如较高水平)指示对PARP抑制剂的敏感性。
本发明还提供了在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自所述个体的样品中的CRL3-KEAP1活性以及与对照进行比较以确定所述受试者是否对PARP抑制剂敏感。在一个实施方案中，与对照相比CRL3-KEAP1的显著不同的水平(例如较高水平)指示对PARP抑制剂的敏感性。
本发明还提供了在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自个体的样品中的PALB2泛素化，并与对照进行比较以确定个体是否对PARP抑制剂敏感。在一个实施方案中，与对照相比PALB2泛素化的显著不同的水平指示对PARP抑制剂的敏感性。
本发明还提供了在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括检测来自个体的样品中的BRCA1、PALB2和BRCA2的复合物，并与对照进行比较以确定个体是否对PARP抑制剂具有响应(例如敏感)。在一个实施方案中，BRCA1、PALB2和BRCA2的复合物的显著不同的水平(例如，不存在或低水平)指示对PARP抑制剂的敏感性。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括使用本发明的方法测定来自个体的样品中的USP11、DCAF10、PALB2、PALB2泛素化、BRCA1-PALB2-BRCA2复合物、PALB2-USP11复合物、USP11-DCAF复合物、KEAP1、CRL3-KEAP1或CRL3-KEAP1-PALB2复合物。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括使用本发明的方法测定来自所述个体的样品中的USP11活性。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括测定来自所述个体的样品中的CRL3-KEAP活性。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括检测或定量来自所述个体的样品中的USP11、BRCA1、BRCA2、PALB2和KEAP1。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括检测或定量来自所述个体的样品中的USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2和KEAP1。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括检测或定量来自所述个体的样品中的BRCA1-PALB2-BRCA2复合物。
本发明还提供了用于在PARP抑制剂的临床试验中将个体分配到多个类别中的一种的方法，其包括检测或定量来自所述个体的样品中的PALB2泛素化。
一方面，基于与对照相比USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化中的一种或多种的减少，将个体分配到用于PARP抑制剂的临床试验的类别中。一方面，基于与对照相比USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3、CRL3-KEAP1、BRCA1-PALB2和BRCA1-PALB2-BRCA2活性或表达或者PALB2泛素化中的一种或多种的增加，将个体分配到用于PARP抑制剂的临床试验的类别中。
可以使用本领域技术人员已知的各种常规方法来检测或测定样品中的生物标志物USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1、CRL3和/或其复合物。存在于样品中的生物标志物水平可以通过任何合适的测定来确定，其可以包括使用包括以下或由以下组成的任一种：免疫测定、光谱、质谱、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、显微术、RNA印迹、等电聚焦、SDS-PAGE、PCR、定量RT-PCR、凝胶电泳、DNA微阵列和抗体微阵列或其组合。
本发明还提供了一种***，其包括：用于测定获自受试者的样品中USP11活性的水平、复合物或生物标志物水平的测定；用于处理结果的处理器；用于将结果与数据库进行比较的计算机编码指令；以及用于提供比较结果的用户显示。数据库可以包含USP11活性或生物标志物水平的参考值。
治疗方法
用于预测或表征对PARP抑制剂的响应性的本发明方法还可以包括向个体或受试者施用PARP抑制剂。一方面，本发明涉及用PARP抑制剂治疗受试者的方法，其包括：
a)使用本发明的方法测定来自受试者的样品的对一种或多种PARP抑制剂的响应性或敏感性；
b)鉴定受试者有效响应或敏感的PARP抑制剂；以及
c)向受试者施用所述PARP抑制剂。
一方面，本发明提供了用于治疗需要用PARP抑制剂治疗的患者的方法，其包括(a)请求提供分析结果的测试以确定患者是否对PARP抑制剂敏感或具有响应：通过检测来自受试者的样品中的USP11、DCAF10、BRCA1、BRCA2、PALB2、KEAP1和/或CRL3并与对照进行比较，以确定患者是否对PARP抑制剂敏感；以及(b)如果患者对PARP抑制剂敏感，则向患者施用所述PARP抑制剂。在本发明的该方法的一方面，患者患有乳腺癌。在本发明的该方法的一方面，患者患有卵巢癌。在本发明的一方面，所述测试使用本文公开的方法检测USP11表达或活性。
本发明还提供了用于治疗受试者的癌症的方法，其包括：(i)使用本发明的方法选择对PARP抑制剂具有响应的受试者，以及(ii)向所述受试者施用有效量的PARP抑制剂以治疗癌症。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，癌症是卵巢癌。
使用本发明的方法鉴定的试剂具有许多治疗应用，涉及例如癌症、局部缺血再灌注损伤、炎性疾病、退行性疾病、保护免受细胞毒性化合物的不良影响，以及增强细胞毒性癌症治疗。使用本发明方法鉴定的试剂可用于通过减少癌细胞的凋亡、限制肿瘤生长、减少转移和延长带有肿瘤的受试者的存活来增强放射和化学疗法。在本发明的各方面中，所述试剂可用于治疗白血病、结肠癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌和***。
在本发明的其他方面，所述试剂可用于治疗但不限于逆转录病毒感染、关节炎、痛风、炎性肠病、CNS炎症、多发性硬化、变应性脑炎、败血症、败血性休克、出血性休克、肺纤维化、葡萄膜炎、糖尿病、帕金森病、心肌梗塞、中风、其他神经创伤、器官移植、眼睛再灌注、肾再灌注、肠道再灌注、骨骼肌再灌注、对乙酰氨基酚过量后的肝毒性、心脏和肾多柔比星和铂基抗肿瘤药物的毒性，以及硫芥继发的皮肤损伤。
在一些实施方案中，本发明提供了用于使个体对PARP抑制剂的治疗敏感的方法，其包括根据本发明的方法鉴定使细胞对PARP抑制剂敏感的试剂，以及向所述个体施用所述试剂。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗用PARP抑制剂治疗的个体的方法，其包括向所述个体施用使用本发明的方法鉴定的使细胞对PARP抑制剂敏感的试剂。
在一些实施方案中，本发明提供了在个体中用于逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的方法，其包括根据本发明的方法鉴定逆转对PARP抑制剂的抗性或延迟对PARP抑制剂的抗性的出现的试剂，以及向个体施用所述试剂。
在一些实施方案中，本发明提供在个体中治疗癌症的方法，其包括根据本发明的方法鉴定抗癌剂，以及向个体施用所述试剂。
在另一个实施方案中，本发明提供在需要此类治疗的哺乳动物中治疗白血病、结肠癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌或***的方法，其包括向哺乳动物施用治疗上可接受量的使用本发明的方法鉴定的试剂或其治疗上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供在需要此类治疗的哺乳动物中增强细胞毒性癌症疗法的方法，其包括向哺乳动物施用治疗上可接受量的使用本发明方法鉴定的增强细胞毒性癌症疗法的试剂或其治疗上可接受的盐。
一方面，本发明提供了在个体中治疗与HR缺陷相关的疾病(即，HR疾病)的方法，其包括根据本发明的方法鉴定调节HR的试剂以及向个体施用所述试剂。
在另一个实施方案中，本发明提供使用本发明的方法鉴定的试剂在制备用于治疗需要这种治疗的哺乳动物中的HR疾病的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供使用本发明方法鉴定的试剂在制备用于抑制需要这种治疗的哺乳动物中的肿瘤生长的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供使用本发明的方法鉴定的试剂在制备用于治疗需要此类治疗的哺乳动物中的癌症的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供使用本发明的方法鉴定的试剂在制备用于治疗需要此类治疗的哺乳动物中的白血病、结肠癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌或***的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的方法鉴定的试剂在制备用于加强需要此类治疗的哺乳动物中的细胞毒性癌症疗法的药物中的用途，其包括向哺乳动物施用治疗上可接受量的所述试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含与治疗上可接受的载体组合的使用本发明的方法鉴定的试剂或其治疗上可接受的盐。药物组合物可以通过用于制备可向受试者施用的药学上可接受的组合物的本身已知的方法制备，使得将有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物组合。合适的载体描述于例如Remington's PharmaceuticalSciences(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA 1985)中。在此基础上，组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂缔合的活性剂的溶液，并且包含在具有合适的pH和与生理液体等渗的缓冲溶液中。
药物组合物表示为单独地或与其他治疗剂或其他治疗形式结合的治疗剂。本发明的组合物可以与其他治疗剂或疗法(例如PARP抑制剂)同时、分开或依次施用。
同源重组方法
本发明提供了用于激活或调节细胞中的同源重组的方法，其包括：
(a)促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生；
(b)促进或刺激BRCA1募集到DNA双链断裂(DSB)位点；
(c)使细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触；
(d)抑制KEAP1或CRL3-KEAP1；
(e)抑制USP11的降解或促进USP11活性；和/或
(f)抑制DCAF10。
一方面，细胞处于细胞周期的G1期(G1)。一方面，细胞是G1中的非***细胞或休眠细胞。一方面，细胞处于细胞周期的G0期(G0)。一方面，本发明的方法体外用于激活或调节细胞中的同源重组。
一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是细胞周期的G1期(G1)或细胞周期G0期(G0)的细胞中的同源重组的方法，其包括(a)促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生；和/或(b)使细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触。
在实施方案中，通过施用使用本发明方法鉴定的促进或刺激BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的试剂来促进或刺激BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装。
一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制KEAP1或CRL3-KEAP1的步骤。一方面，本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括阻断USP11降解或促进USP11活性的步骤。在一个实施方案中，方法包括施用USP11或其激动剂。一方面，本发明提供了用于激活细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制KEAP1并且阻断USP11降解的步骤。一方面，本发明提供了用于激活细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制CRL3-KEAP1并且阻断USP11降解的步骤。一方面，发明提供了用于激活细胞中、特别是G1或G0细胞中的同源重组的方法，其包括抑制CRL3并且阻断USP11降解的步骤。
本发明的方法可以在细胞中、特别是在细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中进行，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA。
本发明提供了用于激活或调节细胞中、特别是在细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的同源重组的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。在一个实施方案中，通过施用使用本发明方法鉴定的促进或刺激BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生的试剂来促进或刺激复合物的组装。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其包括促进或刺激细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括促进或刺激所述细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。在一个实施方案中，通过施用使用本发明方法鉴定的促进或刺激BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生的试剂来促进或刺激复合物的组装。
本发明还提供了用于修复细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)的细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括使所述细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触。
本发明还提供了用于修复G1或G0细胞中的DNA双链断裂的方法，其中DNA末端切除被激活或者已经被激活从而产生单链DNA，所述方法包括(a)抑制KEAP1和/或CRL3-KEAP1；(b)阻断USP11的降解或者促进或刺激USP11活性；(c)施用USP11或其激动剂；和/或(d)抑制CRL3-KEAP1并阻断USP11的降解。
用于激活细胞中的同源重组的方法还可以包括激活或促进单链DNA(ssDNA)产生途径。一方面，通过DNA末端切除激活ssDNA产生途径。在一个实施方案中，用于激活细胞中的同源重组的方法还包括激活DNA末端切除。
在一个实施方案中，通过抑制53BP1(或RIF1)表达或活性(例如，将53BP1募集到DSB位点)和/或上调或表达CtIP来激活或促进DNA末端切除。在一个实施方案中，通过抑制53BP1(或RIF1)表达或活性(例如，将53BP1募集到DSB位点)和上调或表达CtIP来激活或促进DNA末端切除。在一个实施方案中，所述方法包括使用拮抗剂抑制53BP1，包括但不限于短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA)或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)家族酶的抑制剂(例如，曲古抑菌素A)，以及使用模拟组成型磷酸化的CtIP类似物，例如CtIP-Thr879Glu。
用于激活细胞中的同源重组的方法可以包括激活将BRCA1募集到DNA双链断裂(DSB)位点。在一个实施方案中，通过抑制53BP1(TP53BP1)或RIF1的表达，或者抑制53BP1或RIF1募集到DSB位点来激活BRCA1募集。可以使用拮抗剂抑制53BP1或RIF1，所述拮抗剂包括但不限于短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA))。在一个实施方案中，利用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)家族酶的抑制剂，特别是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)，优选曲古抑菌素来抑制53BP1(Fukuda T.等,Cancer Sci.2015八月；106(8):1050-6.doi:10.1111/cas.12717.2015年7月14日，电子出版物)。
一方面，用于激活或刺激细胞中的同源重组的方法还包括基因编辑***。一方面，基因编辑***包括使细胞与核酸酶接触。核酸酶的实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、工程化的兆核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(TALENS)、兆内切核酸酶或归巢内切核酸酶、成簇规律性间隔短回文重复(CRISPR)-相关(Cas)蛋白、Ttago核酸酶和核酸酶之间的融合体，例如兆-TAL和紧密TALEN。
一方面，基因编辑步骤包括TALEN***。
一方面，基因编辑步骤包括ZFN***。
一方面，基因编辑步骤包括CRISPR/Cas9***。
在本发明的各方面中，基因编辑***可以校正基因组修饰。遗传修饰可以包含具有与遗传病症相关的基因座的多核苷酸序列中的至少一个突变。一方面，基因组修饰选自由***、缺失及其组合组成的组。在一些实施方案中，遗传病症是单基因病症。在一些实施方案中，所述疾患是多基因病症。在一些实施方案中，该病症与一个或多个SNP相关。在本发明的具体实施方案中，基因组修饰校正点突变。
在校正基因组修饰的本发明的方法的一个方面，基因编辑***包括使细胞与成簇规律性间隔短回文重复(CRISPR)-相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至并且杂交至与遗传病症相关的靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列。
一方面，本发明提供了用于改变与细胞中的靶多核苷酸序列相关的遗传病症的方法，其包括：(1)使所述细胞与激活所述细胞中的同源重组的***接触，其中所述***包含BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2或在整个细胞周期中维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的试剂；以及(2)使靶多核苷酸序列与成簇规律性间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至并且杂交至靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列。所述方法可以减少靶多核苷酸序列的表达、敲除靶多核苷酸序列或将靶多核苷酸序列从不期望的序列校正为期望序列。
一方面，本发明提供了用于改变与细胞中的靶多核苷酸序列相关的遗传病症的方法，其包括：(1)使所述细胞与激活所述细胞中的同源重组的***接触，其中所述***包含本发明的试剂盒、载体或组合物，特别地所述***包含53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂，以及模拟组成型磷酸化的CtIP类似物，优选地所述***包含KEAP1抑制剂，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA)的53BP1抑制剂，及CtIP-Thr879Glu；以及(2)使靶多核苷酸序列与成簇规律性间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导并且杂交至靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列。所述方法可以减少靶多核苷酸序列的表达、敲除靶多核苷酸序列或将靶多核苷酸序列从不期望的序列校正为期望序列。
本发明考虑了用于治疗或预防受试者中的遗传病症的方法，所述方法包括通过使细胞与激活所述细胞中的同源重组的***接触来改变细胞中与遗传病症相关的靶多核苷酸序列，其中所述***包含BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2或在整个细胞周期中维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的试剂；以及使靶多核苷酸序列与成簇规律性间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至并且杂交至靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列，从而治疗或预防所述遗传病症。
一方面，提供了用于治疗或预防受试者中的遗传病症的方法，所述方法包括：(a)通过使细胞与激活所述细胞中的同源重组的***接触来改变细胞中与遗传病症相关的靶多核苷酸序列，其中所述***包含本发明的试剂盒、载体或组合物，特别地所述***包含53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂，以及模拟组成型磷酸化的CtIP类似物，优选地所述***包含KEAP1抑制剂，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA)的53BP1抑制剂，及CtIP-Thr879Glu；以及(b)使靶多核苷酸序列与成簇规律性间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至并且杂交至靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列，从而治疗或预防所述遗传病症。
用于治疗或预防遗传病症的方法包括将细胞引入受试者，从而治疗或预防与靶多核苷酸序列相关的遗传病症。所述方法可包括通过***外源模板多核苷酸来修复切割的靶多核苷酸序列，其中所述修复导致包含所述靶多核苷酸序列的一个或多个核苷酸的***、缺失或取代的突变。
一方面，靶多核苷酸序列与肺遗传病症相关。在一个实施方案中，靶多核苷酸序列与囊性纤维化相关，特别地多核苷酸序列是囊性纤维化跨膜导体受体(CFTR)基因座。CFTR中的突变(例如，外显子11中的位置508处的苯丙氨酸缺失)造成囊性纤维化。
一方面，靶多核苷酸序列与肌肉的遗传病症相关。一方面，靶多核苷酸序列与肌营养不良相关。一方面，靶多核苷酸序列与杜氏肌营养不良(DMD)(肌营养不良蛋白基因中的突变)相关。一方面，靶多核苷酸序列与贝克肌营养不良(肌营养不良蛋白基因中的突变)相关。一方面，靶多核苷酸与1型肌强直性营养不良(DMPK基因中的突变)或2型肌强直性营养不良(CNBP基因突变)相关。一方面，靶多核苷酸序列与镰状细胞性贫血(突变型HBB血红蛋白)相关。
在本发明的各方面中，靶向多核苷酸序列与肝脏遗传病症相关。一方面，靶多核苷酸序列与α-1抗胰蛋白酶缺乏症(SERPINA1基因中的突变)相关。一方面，靶向多核苷酸序列与威尔逊病(编码ATP7B Cu转位酶的基因中的突变)相关。
一方面，本发明的方法还包括提供与其天然存在的对应物相比具有增强的特性的功能性蛋白质，特别是受试者中缺乏或缺陷的功能性蛋白质，例如用于治疗遗传病症。在本发明的实施方案中，所述方法包括通过连续施用基因编辑***和编码与其天然存在的对应物相比具有增强的特性的非天然存在的蛋白质的一种或多种转基因来在有需要的受试者的细胞中整合编码功能性蛋白质的序列。在其他实施方案中，所述方法包括向受试者施用表达受试者中异常表达的一种或多种蛋白质的功能性形式的遗传修饰的细胞。因此，可以将分离的细胞引入受试者(离体细胞疗法)，或可以在细胞是受试者的一部分时修饰细胞(体内)。在某些实施方案中，使用病毒载体、非病毒载体和/或其组合递送转基因。
本发明还提供了抑制细胞、特别是G1细胞中的同源重组的方法，其包括抑制细胞中BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装。在一个实施方案中，通过施用KEAP1或CRL3-KEAP1或其激动剂来抑制相互作用。在一个实施方案中，通过施用USP11拮抗剂/抑制剂(例如米托蒽醌)来抑制相互作用。在一个实施方案中，通过施用使用本发明的方法鉴定的抑制同源重组的试剂来抑制相互作用。
本发明方法的组分可以由本领域已知的递送***递送，所述递送***包括但不限于基于病毒的***或不基于病毒的***。常规的基于病毒的***可以包含例如用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。一方面，表达载体选自由质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体组成的组。在一个实施方案中，基于病毒的***是腺病毒载体或腺相关病毒载体。不基于病毒的***的实例包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和增强DNA摄取的试剂。
一方面，本发明提供了载体，其包含同源重组的激活剂或调节剂，以及任选的DNA末端切除的激活剂或调节剂。一方面，本发明提供了载体(例如病毒载体)，其包含在载体中编码的一种或多种以下组分：1)DNA末端切除的激活剂，例如53BP1(或RIF)表达或活性的抑制剂和/或模拟组成型磷酸化的CtIP化合物；2)激活同源重组的因子，例如在细胞周期中维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的因子；和任选地3)基因编辑***的组分，特别是CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***的组分。在一个实施方案中，基因编辑***的组分在一个或多个单独的表达载体中编码。
另一方面，本发明提供了组合物，其包含同源重组的激活剂或调节剂以及任选的DNA末端切除的激活剂或调节剂。一方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种以下组分：1)DNA末端切除的激活剂，例如53BP1(或RIF)表达或活性的抑制剂和/或模拟组成型磷酸化的CtIP化合物；2)激活同源重组的因子，例如在细胞周期中维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的因子；和任选地3)基因编辑***的组分，特别是CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***的组分。在一个实施方案中，基因编辑***的组分在一个或多个单独的组合物中。
DNA末端切除的激活剂的实例包括但不限于CtIP-Thr847Glu的编码序列，针对TP53BP1 mRNA的shRNA，以及针对KEAP1的shRNA。针对TP53BP1的shRNA可以用针对RIF1的shRNA或阻断53BP1募集到DSB位点的试剂(包括显性-阴性53BP1蛋白)取代。针对KEAP1的shRNA可以用含有其Lys20、Lys25和Lys30残基的突变或者含有干扰其与KEAP1相互作用的突变的PALB2突变体的编码序列取代。
在细胞周期期间维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的因子的实例包括但不限于KEAP1的抑制剂、DCAF10的抑制剂、在G0和G1细胞中维持USP11表达的RNA干扰剂或对KEAP1-CUL3-RBX1的泛素化不敏感的突变形式的PALB2，其涉及Lys20、Lys25或Lys30残基中的一个或多个的突变。KEAP1抑制剂的一个实例是Guntas,G.等,[44]中公开的KEAP1-NRF2相互作用的有效竞争性抑制剂的抗体类似物(monobody)。KEAP1抑制剂还描述在例如Canning P.等,Acta Pharm Sin B.,2015(4):285-99和Wells,G.,Biochem SocTrans.2015,43(4):674-9中。
在一个实施方案中，本发明的载体包含编码53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂和模拟组成型磷酸化的CtIP类似物的序列。在一个具体实施方案中，本发明的载体包含编码KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)、53BP1抑制剂和CtIP-Thr879Glu的序列。在一个具体实施方案中，本发明的载体包含编码以下的序列：KEAP1抑制剂(例如R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA)的53BP1抑制剂及CtIP-Thr879Glu。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂和模拟组成型磷酸化的CtIP类似物。在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)、53BP1抑制剂和CtIP-Thr879Glu。在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA)53BP1抑制剂及CtIP-Thr879Glu。
试剂盒
本发明还提供用于进行本文公开的测定或方法或者包含本文公开的组合物或载体的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定样品中的USP11活性的至少一种试剂。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定样品中的BRCA1-PALB2-BRCA2、PALB2-KEAP1、BRCA1-PALB2、USP11-DCAF10或USP11-PALB2复合物的至少一种试剂。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定样品中的BRCA1-PALB2-BRCA2、PALB2-KEAP1或USP11-PALB2复合物的至少一种试剂。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定样品中的BRCA1、BRCA2、PALB2、USP11、DCAF10和KEAP1的水平的试剂。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定样品中的PALB2的泛素化、特别是在PALB2的N末端的泛素化的至少一种试剂。在一些实施方案中，试剂是抗体或核酸或引物以用于PCR反应。
试剂盒还可以包含***件形式的合适的操作参数的说明书。说明书可告知消费者如何收集样品。试剂盒可以包含样品，其待用作标准品用于校准和比较。试剂盒还可以包含将样品中检测到的活性或生物标志物的水平与校准样品或图表进行比较的说明书。试剂盒还可以包含指示活性或生物标志物水平诊断本文公开的疾病的说明书。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含用于激活同源重组的本发明方法的一种或多种组分和任选的基因编辑***的组分。本发明的试剂盒还可以包含CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***或与其组合使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含CRISPR***或与其组合使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含TALEN***或与其组合使用。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含锌指核酸酶***或与其组合使用。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含载体***和用于使用试剂盒的说明书。一方面，试剂盒包含载体，所述载体包含本文讨论的DNA末端切除的激活剂和同源重组的激活剂。一方面，试剂盒包含一种或多种载体(例如病毒载体)，所述载体包含一种或多种以下组分：1)DNA末端切除的激活剂，例如53BP1(或RIF)表达或活性的抑制剂和/或模拟组成型磷酸化的CtIP化合物；2)激活同源重组的因子，例如在细胞周期期间维持BRCA1-PALB2相互作用的因子；以及任选地3)基因编辑***的组分，特别是CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***的组分。本文描述了在细胞周期期间维持BRCA1-PALB2相互作用的因子的实例，并且所述因子包括但不限于KEAP1的抑制剂，例如维持G0和G1细胞中USP11表达的RNA干扰剂或对KEAP1-CUL3-RBX1的泛素化不敏感的PALB2的突变形式，其涉及Lys20、Lys25或Lys30残基中的一个或多个的突变。DNA末端切除的激活剂的实例包括但不限于CtIP-Thr847Glu的编码序列、针对TP53BP1 mRNA的shRNA以及针对KEAP1的shRNA。针对TP53BP1的shRNA可以用针对RIF1的shRNA或阻断53BP1募集到DSB位点的试剂(包括显性-阴性53BP1蛋白)取代。针对KEAP1的shRNA可以用含有其Lys20、Lys25和Lys30残基的突变或者含有破坏其与KEAP1相互作用的突变的PALB2突变体的编码序列取代。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含一种或多种载体，所述载体包含编码53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂以及模拟组成型磷酸化的CtIP类似物的序列。在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒包含一种或多种载体，所述载体包含编码KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)、53BP1抑制剂和CtIP-Thr879Glu的序列。在一个具体实施方案中，本发明包含一种或多种载体，所述载体包含编码以下的序列：KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA))的53BP1抑制剂，以及CtIP-Thr879Glu。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含本发明的组合物和使用试剂盒的说明书。一方面，该试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文讨论的DNA末端切除的激活剂或调节剂以及同源重组的激活剂或调节剂。一方面，试剂盒包含组合物，所述组合物包含一种或多种以下组分：1)DNA末端切除的激活剂，例如53BP1(或RIF)表达或活性的抑制剂和/或模拟组成型磷酸化的CtIP化合物；2)激活同源重组的因子，例如在细胞周期中维持BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2相互作用的因子；以及任选地3)基因编辑***的组分，特别是CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***的组分。在一个实施方案中，基因编辑***的组分在分开的试剂盒中。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含53BP1抑制剂、KEAP1抑制剂或DCAF10抑制剂，以及模拟组成型磷酸化的CtIP类似物。在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)、53BP1抑制剂和CtIP-Thr879Glu。在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒包含组合物，所述组合物包含KEAP1抑制剂(例如，R1 KEAP1抑制剂；参见实施例3)，选自短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA和微小RNA(miRNA))的53BP1抑制剂，以及CtIP-Thr879Glu。
在各方面中，本发明的试剂盒与基因编辑试剂盒、特别是用于CRISPR***、TALEN***或锌指核酸酶***的试剂盒组合使用。基因编辑试剂盒是可商购自例如Addgene(Cambridge,MA)、ThermoFisher Scientific、System Biosciences Inc.和OriGeneTechnologies(MD),Clontech。
以下非限制性实例是本发明的说明：
实施例1
在实施例中描述的研究中使用了以下材料和方法。
质粒
PALB2的cDNA获自哺乳动物基因收集(Mammalian Gene Collection)(MGC)。将全长PALB2和BRCA1通过PCR扩增，亚克隆到pDONR221中，并使用Gateway克隆技术(Invitrogen)递送到pDEST-GFP、pDEST-Flag和mCherry-LacR载体中。类似地，将BRCA1的卷曲螺旋结构域(残基1363-1437)通过PCR扩增，亚克隆到pDONR221载体中并递送到mCherryLacR和pDEST-GFP载体中。将PALB2的N末端结构域通过PCR扩增，并使用EcoRI/XhoI位点引入到GST表达载体pET30-2-His-GST-TEV[31]。使用BamHI/SalI位点将BRCA1的卷曲螺旋结构域克隆到pMAL-c2中。通过定点诱变引入终止密码子或缺失获得PALB2的截短形式。将全长CtIP通过PCR扩增，亚克隆到pDONR221中，并使用Gateway克隆技术(Invitrogen)递送到慢病毒构建体pCW57.1(David Root博士馈赠；Addgene质粒#41393)中。USP11cDNA由David Cortez馈赠，并且通过PCR扩增，并使用EcoRI/SalI位点克隆到pDsRed2-C1载体中。使用BamHI/EcoRI位点将猪USP11(USP11)的细菌密码子优化的编码序列亚克隆到6x His-GST载体pETM-30-Htb中。如之前所述产生PALB2、BRCA1和USP11构建体的抗siRNA形式[14]。如之前所述将全长CUL3和RBX1通过PCR从人胰腺cDNA文库(Invitrogen)扩增，并分别使用NheI/XmaI和BssHII/NotI克隆到双重表达pFBDM载体中。NEDD8 cDNA由Dmitris Xirodimas馈赠，并在pET17b载体(Millipore)中在其C末端处与双StrepII标签融合。将人DEN1从由Aude Echalier提供的载体扩增，并通过PCR融合到不可切割的N末端StrepII2x标签并***到pET17b载体中。pCOOL-mKEAP1质粒由Feng Shao博士馈赠。pcDNA3-HA2-KEAP1和pcDNA3-HA2-KEAP1ΔBTB由Yue Xiong博士馈赠(Addgene质粒#21556和21593)。gRNA如之前所述合成和处理[33]。将退火的gRNA克隆到由Feng Zhang馈赠的Cas9表达载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)或pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene质粒#48139和42230)中。靶向LMNA或PML基因座和mClover标记的LMNA或PML的gRNA如之前所述[45]。慢病毒包装载体psPAX2和包膜载体VSV-G由Didier Trono馈赠(Addgene质粒#12260和12259)。使用XhoI/HindIII位点将His6-泛素克隆到pcDNA5-FRT/TO骨架中。所有突变使用QuikChange(Stratagene)通过定点诱变引入，并且对所有质粒进行序列验证。
细胞培养和质粒转染
所有培养基补充有10％胎牛血清(FBS)。将U-2-OS(U2OS)细胞培养在McCoy培养基(Gibco)中。将293T细胞培养在DMEM(Gibco)中。测试亲代细胞的支原体污染并通过STR DNA图谱表征验证。使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)按照制造商的方案进行质粒转染。如之前所述进行慢病毒感染[18]。U2OS和293T细胞购自ATCC.U2OS 256细胞由R.Greenberg馈赠。
抗体
使用以下抗体：兔抗53BP1(A300-273A,Bethyl)、兔抗53BP1(sc-22760,SantaCruz)、小鼠抗53BP1(#612523,BD Biosciences)、小鼠抗γ-H2AX(克隆JBW301,Millipore)、兔抗γ-H2AX(#2577,Cell Signaling Technologies)、兔抗KEAP1(ab66620,Abcam)、兔抗NRF2(ab62352,Abcam)、小鼠抗Flag(克隆M2,Sigma)、小鼠抗微管蛋白(CP06,Calbiochem)、小鼠抗GFP(#11814460001,Roche)、小鼠抗CCNA(MONX10262,Monosan)、兔抗BRCA2(ab9143,Abcam)、小鼠抗BRCA2(OP95,Calbiochem)、兔抗BRCA1(#07-434,Millipore)、兔抗USP11(ab109232,Abcam)、兔抗USP11(A301-613A,Bethyl)、兔抗RAD51(#70-001,Bioacademia)、小鼠抗BrdU(RPN202,GE Healthcare)、小鼠抗FK2(BMLPW8810,Enzo)、兔抗PALB2[34]、兔抗GST(sc-459,Santa Cruz)、兔抗CUL3(A301-108A,Bethyl)、小鼠抗MBP(E8032,NEB)、小鼠抗HA(克隆12CA5，由M.Tyers博士馈赠)、兔抗泛素(Z0458,Dako)和小鼠抗肌动蛋白(CP01,Calbiochem)。使用以下抗体在免疫荧光显微术中作为二抗：Alexa Fluor 488驴抗兔IgG、Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG、Alexa Fluor 555驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555驴抗兔IgG、Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 647驴抗人IgG、Alexa Fluor 647驴抗山羊IgG(Molecular Probes)。
RNA干扰
本研究中使用的所有siRNA均为购自ThermoFisher的单一双链体siRNA。使用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)以正向转染模式进行RNA干扰(RNAi)转染。使用的各个siRNA双链体是BRCA1(D-003461-05)、PALB2(D-012928-04)、USP11(D-006063-01)、CUL1(M-004086-01)、CUL2(M-007277-00)、CUL3(M-010224-02)、CUL4A(M-012610-01)、CUL4B(M-017965-01)、CUL5(M-019553-01)、KEAP1(D-12453-02)、RAD51(M-003530-04)、CtIP/RBBP8(M-001376-00)、BRCA2(D-003462-04)、53BP1(D-003549-01)和非靶向对照siRNA(D-001210-02)。除非另有说明，否则在细胞处理前48小时前转染siRNA。
抑制剂和精细化学品
以指定浓度使用以下药物：100ng/mL-1的环己酰亚胺(CHX；Sigma)、0.2μM的喜树碱(CPT；Sigma)、10μM的ATM抑制剂(KU55933；Selleck Chemicals)、10μM的ATR抑制剂(VE-821；由Philip Reaper馈赠)、10μM的DNA-PKcs抑制剂(NU7441；Genetex)、2μM的蛋白酶体抑制剂MG132(Sigma)、40μM的洛伐他汀(S2061；Selleck Chemicals)、多西环素(#8634-1；Clontech)、5μM的Nedd8激活酶抑制剂(MLN4929；Active Biochem)和指定浓度的奥拉帕尼(Selleck)。
免疫荧光显微术
在大多数情况下，使细胞生长在玻璃盖玻片上，在室温下用PBS中的2％(w/v)多聚甲醛封固20分钟，在室温下用0.3％(v/v)Triton X-100透化20分钟，并且在室温下用PBS中的5％BSA封闭30分钟。或者，将细胞在-20℃下用100％冷甲醇固定10分钟，然后在PBS-BSA封闭之前在室温下用PBS洗涤5分钟。然后将细胞用在PBS-BSA中稀释的一抗在室温下孵育2小时。接着将细胞用PBS洗涤，然后在室温下用补充有0.8μg/ml DAPI的PBS-BSA稀释的二抗孵育以染色DNA1小时。用Prolong Gold封固剂(Invitrogen)将盖玻片封固在载玻片上。使用Zeiss LSM780激光扫描显微镜取得共聚焦图像。对于BRCA1-PALB2-BRCA2轴的G1相对S/G2分析，将细胞首先用双胸苷阻断同步化，释放以允许进入S期并在释放后5小时和12小时暴露于2或20Gy的X射线辐照，并且在处理后1至5小时固定(在指定的情况下)。为了检查DNA复制，在辐照和如之前所述处理之前将细胞用30μM BrdU预孵育30分钟。
USP11/KEAP1的CRISPR/Cas9基因组编辑
将293T和U2OS细胞用靶向53BP1、USP11或KEAP1并由含有Cas9接着2A-嘌呤霉素盒的pX459载体表达的3种不同的sgRNA瞬时转染。第二天，将细胞用嘌呤霉素选择2天，并亚克隆以形成单菌落或亚群。通过免疫印迹和/或免疫荧光筛选菌落以验证53BP1、USP11或KEAP1表达的损失，随后通过PCR和测序表征。通过PCR使用Turbo Pfu聚合酶(Agilent)扩增被CRISPR/Cas9靶向的基因组区域，并在测序前将PCR产物克隆到pCR2.1TOPO载体(Invitrogen)中。
奥拉帕尼克隆发生试验
将293T细胞用指定剂量的奥拉帕尼(Selleck Chemicals)孵育24小时，用PBS洗涤一次，并通过台盼蓝染色计数。然后，对于每种条件，将500个细胞一式两份涂铺。如之前所述进行细胞存活测定[35]。
重组蛋白产生
如之前所述产生GST和MBP融合蛋白[36,37]。简单来说，将大肠杆菌中表达的MBP蛋白质根据制造商描述的间歇法在直链淀粉树脂(New England Biolabs)上纯化，并储存在1X PBS，5％甘油中。将大肠杆菌中表达的GST蛋白质在50mM Tris HCl pH 7.5、300mMNaCl、2mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM EDTA、15μg/mL-1AEBSF和1×全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中的谷胱甘肽琼脂糖4B(GE Healthcare)树脂上纯化。在用50mM Tris HCl pH 8,2mM DTT中的50mM谷胱甘肽从树脂洗脱后，使用50mM Tris HCl pH 7.5、150mM NaCl、10mM谷胱甘肽、10％甘油、2mM柠檬酸钠和2mMβ-巯基乙醇中的His-标记的TEV蛋白酶(由F.Sicheri提供)切割His6-GST标签。使用50mM Tris HCl pH 7.5、300mM NaCl、20mM咪唑、5mM谷胱甘肽、10％甘油、1mM柠檬酸钠和2mMβ-巯基乙醇中的Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)耗竭His6-标记的蛋白质，然后离心浓缩(Amicon离心过滤器，Millipore)。如之前所述纯化GST-mKEAP1[38]，在HiTrap Q HP柱(GE Healthcare)上进行另外的阴离子交换步骤。GST标签留在蛋白质上用于体外实验。如之前所述进行CUL3和RBX1的纯化[32]。将Nedd8和Den1在极品肉汤培养基(Terrific broth media)中生长并且在16℃下用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过夜的大肠杆菌BL21中表达。收集细胞并将其重悬在于补充有溶菌酶、通用核酸酶(Pierce)、苯甲脒、亮抑酶肽、胃酶抑素、PMSF和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的洗涤缓冲液(400mM NaCl、50mM Tris-HCl,pH 8、5％甘油、2mM DTT)中，只是对于表达DEN1的细胞省略了蛋白酶抑制剂。通过超声处理裂解细胞，并且通过以20,000rpm离心50分钟清除裂解物。使用蠕动泵将可溶性上清液以3ml/min-1的流速使可溶性上清液结合至5mlStrep30 Tactin Superflow Cartridge。将柱用20柱体积(CV)的洗涤缓冲液洗涤，并用5CV的洗涤缓冲液洗脱，以1:2在水中稀释以降低最终盐浓度，并补充2.5mM脱硫生物素。汇集洗脱级分并使用3kDa截断值的Amicon浓缩器浓缩至总体积为4ml。将DEN1通过Superdex 75尺寸排阻柱进一步纯化，缓冲液交换成150mM NaCl、HEPES，pH 7.6、2％甘油和1mM DTT。通过与StrepII2x-DEN1以1:20摩尔比在室温下孵育1小时除去C末端前肽和StrepII2x标签。将DEN1切割反应在Zeba MWCO脱盐柱(Pierce)上进行缓冲液交换，以除去脱硫生物素，并通过保留C-末端前肽和DEN1的Strep-Tactin Cartridge。如所述在大肠杆菌中表达GST标记的野猪(Sus scrofa)(猪)USP11蛋白[39]。在50mM Tris pH 7.5、300mM NaCl、1mM EDTA、1mMAEBSF、1×蛋白酶抑制剂混合物(284ng/ml亮抑酶酞、1.37μg/ml-1胃酶抑素A、170μg/ml- 1PMSF和330μg/ml-1苯甲脒)和5％甘油中，通过溶菌酶处理和超声处理裂解细胞。将澄清裂解物施加到填充有谷胱甘肽琼脂糖4B的柱(GE Healthcare)上，用裂解缓冲液充分洗涤，之后在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、5％甘油和25mM还原型谷胱甘肽中洗脱。将DUB活性在荧光泛素-AMC(Enzo life sciences)上测定，使用Synergy Neo微量滴定板读数器(Biotek)测量。在螯合HiTrap树脂上按照制造商的说明纯化TEV-泛素-G76C，然后在S-75柱(GE healthcare)上进行尺寸排阻色谱。将蛋白质在1mM乙酸中充分透析并冻干。
PALB2的体外泛素化和去泛素化
在含有50mM Tris HCl pH 7.5、20mM NaCl、10mM MgCl2和0.5mM DTT的缓冲液中，使用50μM野生型泛素(Ubi WT,Boston Biochem)或无赖氨酸的泛素(Ubi K0,BostonBiochem)、100nM人UBA1(E1)、500nM CDC34(由F.Sicheri和D.Ceccarelli提供)、250nM类泛素化的CUL3/RBX1、375nM GST-mKEAP1和1.5mM ATP对PALB2的HA标记的N-末端片段(1-103)(1μM)进行体外泛素化。除非另有说明，否则将泛素化反应在37℃下进行1小时。对于USP11介导的去泛素化测定，首先在37℃下在含有25mM HEPES pH 8、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.5mM DTT和1.5mM ATP的缓冲液中在50μL反应中使用无赖氨酸的泛素利用如上所述酶浓度对HA-PALB2(1-103)进行泛素化1.5小时。通过加入1单位三磷酸腺苷双磷酸酶(NewEngland Biolabs)来终止反应。将反应产物以1:1的比例与野生型或无催化活性(C270S)USP11或USP2(由F.Sicheri和E.Zeqiraj博士提供)混合(使用100nM、500nM和2500nM(USP11)及500nM(USP2)的终浓度)，并在含有25mM HEPES pH 8、150mM NaCl、2mM DTT、0.1mg/mL BSA、0.03％Brij-35、5mM MgCl2、0.375mM ATP的缓冲液中在30℃下孵育2小时。
纯化的PALB2和BRCA1之间的下拉实验
将PALB2体外泛素化反应产物在最终浓度为50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、0.25mM DTT和0.1％NP-40的缓冲液中稀释。在加入泛素化产物之前，将20μgMBP或MBP-BRCA1-CC与补充有0.1％BSA的上述缓冲液中的直链淀粉树脂(New EnglandBiolabs)偶联。在4℃进行下拉反应2小时，然后进行大量洗涤。
免疫共沉淀
将细胞通过胰蛋白酶消化收集，用PBS洗涤一次，并在冰上在500μL裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1％NP-40、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、磷酸酶抑制混合物(Sigma)和N-乙基马来酰亚胺以抑制去泛素化)中裂解。将裂解物在4℃下以15000g离心10分钟，并使用280nm处的吸光度评估蛋白质浓度。在4℃下将等量的蛋白质(～0.5-1mg)用2μg兔抗PALB2、兔抗USP11抗体、兔抗GFP抗体或正常兔IgG孵育5小时。再加入蛋白A/蛋白G-Sepharose珠(Thermo Scientific)的混合物持续1小时。将珠子通过离心收集，用裂解缓冲液洗涤两次并用PBS洗涤一次，通过在2XLaemmli缓冲液中煮沸洗脱，之后通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。对于Flag-PALB2的MS分析，将150×106个瞬时转染的HEK293T细胞在高盐裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5、300mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X100、3mM MgCl2、3mM CaCl2)中裂解，所述裂解缓冲液补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、4mM 1,10-邻菲咯啉、50U benzonase和50U微球菌核酸酶。将澄清裂解物用Flag-M2琼脂糖(Sigma)孵育，然后在裂解缓冲液和50mM碳酸氢铵中大量洗涤。
质谱
在来自siCTRL转染的或USP11 siRNA耗竭的293T细胞的瞬时转染的Flag-PALB2的免疫沉淀后，分别使用10mM DTT(56℃下30分钟)和15mM 2-氯乙酰胺(室温下1小时)在珠上将半胱氨酸残基还原和烷基化。使用珠上的限制的胰蛋白酶消化(每份样品1μg胰蛋白酶(Worthington，NJ，USA)，37℃下20分钟)消化蛋白质并将其干燥至完全。对于LCMS/MS分析，将肽在5％甲酸中复溶，并上样到12cm熔融硅胶柱上，所述柱具有用3.5μm Zorbax C18(Agilent Technologies,CA,USA)内部填充的拉制尖头。使用耦合到Eksigent nanoLCultra(AB SCIEX,CA)的Orbitrap Velos(Thermo Scientific,MA,USA)分析样品。使用在0.1％甲酸中的2％至35％乙腈的90分钟线性梯度从柱上洗脱肽。对于前两种最丰富的多电荷肽，以数据依赖模式获得串联MS谱，并且其包括呈非修饰形式或包含二甘氨酸-泛素胰蛋白酶消化残余物的五种特异性N末端PALB2胰蛋白酶消化肽(电荷状态1+、2+、3+)的靶向扫描。使用碰撞诱导的解离获得串联MS谱。使用Mascot针对人Refseq_V53数据库搜索谱，允许多至4个错误切割且包括脲甲基(C)、脱酰胺化(NQ)、氧化(M)、GlyGly(K)和LeuArgGlyGly(K)[SEQ ID NO:4]作为可变修饰。
将体外泛素化的HA-PALB2(1-103)(50μL总反应混合物)在SDS-PAGE凝胶上简单跑动，然后进行全泳道切割，使用10mM DTT进行凝胶内还原(在56℃下30分钟)，使用50mM 2-氯乙酰胺进行烷基化，以及在37℃下胰蛋白酶消化16小时。将消化的肽与20μL 10种独特的重同位素标记的N末端PALB2(AQUA)肽的混合物(包括未修饰的或diG修饰形式的Lys 16、25、30或43周围区域的完全或部分胰蛋白酶消化物；每个肽80–1,200fmolμl-1，基于单个肽敏感性测试)混合，然后将6μL上样到12cm熔融硅胶柱上，所述柱具有用3.5μm Zorbax C18内部填充的拉制尖头。在耦合到Eksigent nanoLC ultra(AB SCIEX,CA,USA)的OrbitrapELITE(Thermo Scientific,MA,USA)上测量样品。使用在0.1％甲酸中的2％至35％乙腈的180分钟线性梯度从柱上洗脱肽。对于前两种最丰富的多电荷肽，以数据依赖模式获得串联MS谱，并且其包括轻或重同位素标记形式的十种特异性N末端PALB2胰蛋白酶消化肽(电荷状态1+、2+、3+)的靶向扫描。使用碰撞诱导的解离获得串联MS谱。使用Mascot针对人Refseq_V53数据库搜索谱，允许多至2个错误切割，包括脲基甲基(C)、脱酰胺(NQ)、氧化(M)、GlyGly(K)和LeuArgGlyGly(K)[SEQ ID NO:4]作为可变修饰，之后手动验证谱。
His-泛素下拉
将稳定表达His6-Ub的293FLIP-IN细胞用指定的siRNA转染并用多西环素(DOX)处理24小时以诱导His6-Ub表达。将细胞用10mM N-乙基马来酰亚胺预处理30分钟，并在变性裂解缓冲液(6M盐酸胍，0.1M Na2HPO4/NaH2PO4，10mM Tris-HCl，5mM咪唑，0.01Mβ-巯基乙醇，完全蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。将裂解物在冰上超声处理10秒，停止1分钟，并在4℃下以15000g离心10分钟。将上清液用Ni-NTA-琼脂糖珠(Qiagen)在4℃下孵育4小时。将珠子通过离心收集，用变性裂解缓冲液洗涤一次，用洗涤缓冲液(8M尿素,0.1M Na2HPO4/NaH2PO4,10mM Tris-HCl,5mM咪唑,0.01Mβ-巯基乙醇，全蛋白酶抑制剂混合物)洗涤一次，并用补充有0.1％Triton X-100的洗涤缓冲液洗涤两次，并在洗脱缓冲液(0.2M咪唑，0.15MTris-HCl，30％甘油，0.72Mβ-巯基乙醇，5％SDS)中洗脱，然后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。
基于HR的修复测定
将亲本U2OS细胞和稳定表达野生型CtIP或CtIP(T847E)突变体的U2OS细胞用指定的siRNA和PALB2-KR构建体转染，用单胸苷阻断同步化，用多西环素处理以诱导CtIP表达，并且随后通过加入40μM洛伐他汀阻断在G1期。将细胞通过胰蛋白酶消化收集，用PBS洗涤一次，并使用Nucleofector技术(Lonza；方案X-001)用2.5μg sgRNA质粒和2.5μg供体模板进行电穿孔。将细胞涂铺在补充有40μM洛伐他汀的培养基中，并生长24小时，之后进行流式细胞分析。
PALB2化学泛素化
如之前所述[40,41]，通过交联烷基化对经工程化仅具有一个可交联半胱氨酸的PALB2(1-103)多肽进行泛素化，并进行了以下修改。将纯化的PALB2半胱氨酸突变体(终浓度为600μM)与300mM Tris pH 8.8、120mM NaCl和5％甘油中的His6-TEV-泛素G76C(350μM)混合。向混合物中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)(Sigma-Aldrich)还原剂至终浓度为6mM，并在室温下孵育30分钟。将双反应性半胱氨酸交联剂1,3-二氯丙酮(Sigma-Aldrich)溶解在二甲基甲酰胺中并加入到蛋白质混合物中至终浓度为5.25mM。使反应在冰上进行1小时，然后通过加入5mMβ-巯基乙醇猝灭。通过穿过Ni-NTA-琼脂糖珠(Qiagen)富集His6-TEV-泛素缀合的PALB2。
研究和研究结果在下文讨论。
通过同源重组(HR)进行的DNA修复[1]在G1细胞中被高度抑制[2,3]，以确保仅在姐妹染色单体之间发生有丝***重组[4,5]。虽然许多HR因子是细胞周期调节的，但是对于抑制G1细胞中的重组的必要和充分的事件的特性依然未知。本研究发现细胞周期严格控制BRCA1与PALB2-BRCA2的相互作用，以便将BRCA2功能约束到S/G2期。PALB2上的BRCA1相互作用位点是由与CUL3-RBX1复合的KEAP1(PALB2相互作用蛋白[6])组成的E3泛素连接酶靶向[7]。PALB2泛素化抑制其与BRCA1的相互作用，并被去泛素化酶USP11抵消，去泛素化酶USP11本身在细胞周期控制下。BRCA1-PALB2相互作用的恢复与DNA末端切除的激活的组合足以在G1中诱导HR，如通过RAD51募集、期外DNA合成和基于CRISPR/Cas9的基因靶向测定的。抑制G1中的HR的机制至少由与多步骤阻断BRCA2募集到DNA损伤位点联系的DNA末端切除抑制组成，其涉及抑制BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装。利用限定因子诱导G1细胞中的HR的能力可用于非***细胞中的基因靶向应用。
乳腺和卵巢肿瘤抑制因子BRCA1、PALB2和BRCA2通过HR促进DNA双链断裂(DSB)修复[8-10]。BRCA1促进DNA末端切除以产生同源性搜索和链侵入所必需的单链(ss)DNA[1]，并与PALB2相互作用[13-15]以引导BRCA2[13]和RAD51[16,17]募集到DSB位点。BRCA1在染色质上DSB位点侧翼的积累在G1细胞中被抑制[18]，使人想起细胞周期的该阶段中HR的有效抑制。由于G1中BRCA1募集的抑制依赖于53BP1和RIF1蛋白[18,19]，它们是两种末端切除抑制剂[18-22]，最初从其刺激DNA末端加工的功能出发来观察BRCA1的这种调节。
然而，由于BRCA1还涉及通过与PALB2相互作用促进BRCA2的募集[13-15]，本研究调查了通过借助基因组编辑的53BP1(也称为TP53BP1)的突变(53BP1Δ；图5a-c)来诱导BRCA1募集到G1中的DSB位点是否也导致BRCA2积累到电离辐射(IR)诱导的聚集点中。与BRCA1相反，在2至20Gy范围内的IR剂量下，BRCA2和PALB2均不募集到U-2-OS(U2OS)细胞中的G1DSB位点(图1ab和图5d、e)。由于BRCA1和PALB2直接相互作用[13,14]，该结果表明G1细胞可能通过抑制BRCA1-PALB2相互作用阻断BRCA2募集。实际上，尽管无论细胞周期位置如何PALB2均与BRCA2相互作用，但是其仅在S期才与BRCA1有效相互作用(图1c)。DNA损伤的存在导致G1中残余PALB2-BRCA1相互作用的丧失，而其对S期的BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装几乎没有影响(图1c)。由于所有蛋白质均在G1表达(图1c)，结果表明BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装在所述细胞周期受到控制，可能将BRCA2在DSB位点处的积累限制在S/G2期。
使用在集成的LacO阵列[23]处评估mCherry标记的LacR-BRCA1融合蛋白与具有GFP标记的PALB2的共定位的单细胞测定确认了这些结果(图6b)。LacR/LacO***概况了细胞周期依赖性和DNA损伤敏感性BRCA1-PALB2相互作用(图6a)，并能够发现PALB2上位于其氨基末端BRCA1相互作用结构域外部的序列(残基1-50)负责其与BRCA1缔合的细胞周期依赖性调节(图6c，d)。进一步的缺失诱变鉴定了包含在PALB2中的残基46-103内(图6e，f)的负责BRCA1-PALB2相互作用的细胞周期依赖性调节的单一区域。该区域对应于KEAP1[6]的相互作用位点，鉴定了该蛋白质是BRCA1-PALB2相互作用的候选调节物。
KEAP1是用于CULLIN 3-RING泛素(Ub)连接酶(CRL3)的底物衔接子，其靶向抗氧化剂调节剂NRF2进行蛋白酶体降解[24]，并通过其KELCH结构域识别PALB2和NRF2两者上的“ETGE”基序[6]。从53BP1Δ细胞耗竭KEAP1或者使全长PALB2中的ETGE基序缺失(PALB2ΔETGE)在G1细胞中诱导PALB2IR诱导的聚集点形成(图1d和图7a)。此外，在通过基因组编辑使KEAP1失活的细胞中(KEAP1Δ，图7b)，在G1期和S期都检测到稳定的BRCA1-PALB2-BRCA2复合物(图1e)。因此，KEAP1是BRCA1-PALB2相互作用的抑制剂。
CUL3也与PALB2相互作用(图7c)，并且其在53BP1ΔU2OS细胞中的耗竭使G1中PALB2IR诱导的聚集点去抑制(图1d和图7a)。此外，在G1同步化的KEAP1Δ细胞中，与其野生型对应物不同，缺乏其BTB结构域(ΔBTB)的CUL3结合缺陷型KEAP1蛋白的表达不能抑制BRCA1-PALB2相互作用(图7d)。这些结果表明，KEAP1将CUL3募集到PALB2以抑制其与BRCA1的相互作用。
使用LacR/LacO***和免疫共沉淀测定，发现在BRCA1相互作用结构域中缺少全部8个赖氨酸残基的PALB2突变体(PALB2-KR；图2a)与BRCA1相互作用，而不论细胞周期位置(图2b和图7e，f)。进一步诱变鉴定了PALB2中的残基20、25和30对于抑制BRCA1-PALB2相互作用是非常关键的，因为在PALB2-KR的背景下重新引入这些赖氨酸(产生PALB2-KR/K3；图2a)导致G1细胞中BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装的抑制(图2b和图7e)。总之，这些结果提出了一种PALB2结合的KEAP1形成活性CRL3复合物，所述活性CRL3复合物使PALB2N末端泛素化以抑制其与BRCA1的相互作用的模型。
尽管可以在细胞中检测到PALB2泛素化(图8a)，但是PALB2N末端的富含赖氨酸的性质迄今阻碍了Lys20、25或30上体内泛素化位点的明确作图。然而，通过质谱法可以检测到在Lys16和Lys43上泛素化，表明PALB2N末端是泛素化的(图8b)。在互补的一组实验中，靶向LacO阵列的PALB2诱导了对缀合的泛素的免疫反应性(图8c-e)。Ub与PALB2的共定位在G1中最高，并依赖于KEAP1相互作用基序和Lys20/25/30残基的存在(图8d-e)，与G1细胞中PALB2在那些位点上泛素化的模型一致。实际上，可通过重组CRL3-KEAP1以依赖于PALB2的KEAP1相互作用结构域的方式容易地重构PALB2的N-末端的泛素化(残基1-103；融合到血凝素(HA)表位标签)(图2c)，并且在体外通过质谱明确地鉴定了Lys25和Lys30被KEAP1泛素化。
CRL3-KEAP1对PALB2的泛素化抑制了其与包含残基1363-1437的BRCA1片段(BRCA1-CC)的相互作用，由于存在BRCA1相互作用结构域之外的泛素化赖氨酸，这种抑制对于高度修饰形式的PALB2更加明显(图2d)。为了特异性测试被鉴定为关键的三个赖氨酸残基中单个赖氨酸残基的泛素化是否抑制与BRCA1的相互作用，使用化学交联安置在位置20或45处的单个泛素化部分(产生了PALB2-KC20-Ub和PALB2-KC45-Ub)。PALB2在位置20处的泛素化完全抑制了其与BRCA1的相互作用，而残基45的修饰对相互作用没有影响(图9a)，类似体内数据(图7e)。总之，这些结果表明PALB2在其N-末端的特定位点处的泛素化阻止其与BRCA1相互作用。
由于CRL3-KEAP1 E3连接酶的活性(图9b)和CRL3-KEAP1与PALB2的相互作用(图7c)都不受细胞周期调节，所以可能的是可能以细胞周期依赖性方式调节PALB2的去泛素化(eubiquitylation)。KEAP1与USP11物理地相互作用[25]，USP11是还与BRCA2[26]和PALB2(图9c)相互作用的去泛素化酶。USP11耗竭损害基因转换[27](图9d)，并导致对PARP抑制超敏感[27]，鉴定了USP11为未知功能的HR调节剂。免疫共沉淀实验证实，USP11及其催化活性对于形成稳定的BRCA1-PALB2-BRCA2复合物是必需的，特别是在DNA损伤的存在下(图3a和图9e，f)。
如果USP11拮抗CRL3-KEAP1对PALB2的泛素化，则除去KEAP1(或CUL3)应该逆转由USP11损失所赋予的表型。事实上，KEAP1的缺失恢复了通过基因组编辑(USP11Δ)制备的USP11敲除细胞中对PARP抑制剂(PARPi)的抗性和BRCA1-PALB2相互作用(图3b，c和图9e)。同样地，CUL3或KEAP1耗竭也逆转了USP11耗竭细胞的基因转化缺陷(图10a)。引入PALB2-KR突变体以依赖于Lys20/25/30的方式恢复其与BRCA1的相互作用，并且逆转了USP11Δ细胞中的PARPi敏感性。由于重组USP11可直接使PALB2(1-103)去泛素化(图3d)，这些结果表明USP11通过逆转PALB2Lys20/25/30残基上的抑制性泛素化来促进BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装。
观察到USP11在G1细胞中快速流通并且在细胞周期的这个阶段与PALB2相互作用较差(图11a，b)。此外，在DNA损伤诱导时，特别是G1期，USP11快速损失(图3e和图11b，c)。IR处理后USP11的不稳定依赖于ATM信号传导，而在UV辐照后其是ATR依赖性的(图11d，e)。G1中USP11稳态水平的降低是蛋白酶体降解的结果(图11f)。CRL4E3Ub连接酶最有可能负责控制USP11的稳定性，因为泛-CRL抑制剂MLN4924的处理[28](图11g)或CUL4的耗竭(图3f)保护USP11免于DNA损伤诱导的降解。CUL4耗竭导致G1 53BP1Δ细胞中的BRCA2和PALB2IR-诱导的聚集点形成(图3g和图12a)，与用作最终控制BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装的上游信号的CRL4复合物的USP11的调节一致。
尽管53BP1的缺失在G1细胞中产生低水平的ssDNA[29]，但是53BP1Δ突变与KEAP1耗竭的结合没有产生抗提取的RAD51 IR诱导的聚集点，表明几乎没有RAD51核丝形成(图12b)。那些细胞中的ssDNA形成仍然不足，因此利用促进G1细胞切除的CtIP的仿磷酸化T847E突变体[30]。与野生型CtIP不同，将CtIP-T847E引入到耗竭KEAP1的53BP1Δ细胞中在G1细胞中诱导了RAD51 IR诱导的聚集点形成(图4a，b和图12b，c)以及期外DNA合成(图12d)。这些结果表明，在G1中可以激活RAD51核丝形成的下游步骤，即链侵入、D-环形成和DNA合成。
为了测试是否还可以在G1中激活生产性HR，使用CRISPR/Cas9刺激的基因靶向测定(Pinder J.等,Nuclei Acids Res.43,9379-9392,2015)，其中通过显微术或流式细胞术(图4c和图12e，f)监测核纤层蛋白A(LMNA)或PML基因的5'处mClover荧光蛋白的编码序列的***，后一种方法能够选通具有限定DNA含量的细胞(如G1细胞)。还建立了同步化方案，其中通过洛伐他汀处理[2]24小时使在胸苷阻断释放后获得的G1细胞停滞在G1(图12g，h)。使用该***，测定在测定的线性范围内的供体模板浓度，并且确定了LMNA基因座处的基因靶向依赖于BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装(图13a，b)。还证实了在G1中通过HR的基因靶向被高度抑制(图4d)。
切除和BRCA1募集到DSB位点的组合激活(即在表达CtIP(T847E)的53BP1Δ细胞中)不足以刺激G1细胞中的LMNA或PML基因座处的基因靶向(图4e和图13c)。然而，当使用KEAP1耗竭或PALB2-KR突变体的表达在能够切除的G1细胞中恢复BRCA1-PALB2相互作用时，检测到两个基因座处的基因靶向事件的强力提高(图4e和图13c)。然而，G1细胞的基因靶向频率仍然低于异步***细胞的基因靶向频率，表明HR不完全激活。53BP1失活和CtIP(T847E)的表达对于G1HR都是必需的(图13d，e)，表明同时激活末端切除和BRCA2募集到DSB位点对于在细胞周期该阶段中激活期外重组是必要和充分的。
总之，BRCA1-PALB2-BRCA2复合物组装的调节是通过HR进行的DSB修复的细胞周期控制中的关键点。该调节集中于PALB2上的BRCA1相互作用位点，并且通过E3连接酶CRL3-KEAP1和去泛素化酶USP11的相反活性来实现，后者在G1中被CRL4复合物拮抗(图4f)。在这种模式中，USP11在S期的稳定性允许DSB位点处的PALB2-BRCA2募集和随后上样RAD51。研究还表明，G1细胞中的HR的抑制很大程度上是可逆的，并且涉及末端切除和BRCA2募集到DSB位点的组合抑制(图4f)。由于人体中的大多数细胞不是活跃循环的并且因此难以HR的，所以本文所述的操作导致开发了能够在多种组织中进行治疗基因靶向的基因组编辑方法。
实施例2
鉴定DCAF10作为用于USP11降解的底物衔接子。
CUL4-RING-连接酶(CRL4)复合物由CULLIN4(CUL4)、RBX1、DDB1、DDA1和被称为DCAF的底物衔接子组成[42]。为了寻找介导USP11泛素化的底物衔接子，组装耗竭了已知和预测的DCAF以及其他CUL4相互作用蛋白的集中siRNA文库(focused siRNA library)。在高含量显微术测定中筛选该文库，其中通过免疫荧光显微术评价USP11水平。用紫外光(UV)或电离辐射(IR)处理细胞以诱导USP11降解。将数据归一化至非辐照条件，并且使用两个独立实验的平均值来对UV-和IR-处理后的值作图。图14a所示的数据显示，除了CUL4耗竭后USP11的预期稳定之外，DCAF10、DCAF15和DCAF17耗竭也导致USP11稳定。由于siRNA介导的敲低倾向于脱靶效应，因此在免疫印迹实验中评估通过两种独立的siRNA敲低DCAF10、DCAF15或DCAF17是否可以使USP11稳定。发现尽管只能利用单一siRNA观察到USP11的稳定(图14b)，但是用两种siRNA耗竭DCAF10导致USP11的强力稳定(图14b)。由于CRL4底物衔接子结合至其底物[42]，接下来在免疫共沉淀测定中评估DCAF10或DCAF15是否可以与USP11相互作用。发现当Flag标记的USP11从HEK293细胞提取物中免疫沉淀时，其与DCAF10而不是DCAF15相互作用(图15a)，强烈地表明DCAF10是靶向USP11以降解的真正的底物衔接子。为了进一步评估DCAF10是否确实参与USP11的调节，从同类系野生型(Dcaf10+/+)、杂合子(Dcaf10-/+)和Dcaf10-/-小鼠产生小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，并且进行USP11的免疫印迹。DCAF10的损失导致小鼠细胞中的更高的稳态水平的USP11(图15b)，与DCAF10是靶向USP11的CRL4复合物的衔接子一致。最后，使用同向重复(DR)-GFP测定，评估DCAF10过表达是否能以显性方式抑制同源重组[43]。DCAF10但不是DCAF15的过表达导致与USP11和其他核心HR因子耗竭相同幅度的HR降低(图15c)。总之，这些数据表明DCAF10通过控制USP11来调节HR。
实施例3
遗传编码的KEAP1抑制剂可促进G1细胞中的同源重组。
G1细胞中基因靶向的激活需要除去53BP1、引入CtIP-T847E以及PALB2和BRCA1之间的相互作用，这可以通过除去KEAP1来实现。为了开发能够激活G1和非***细胞中的HR的***，确定KEAP1 siRNA是否可被KEAP1的抑制剂替代。选择最近描述的名为R1的高亲和力遗传编码的KEAP1抑制剂，其基于纤连蛋白-3(FN3)骨架[44]。在G1期同步化的53BP1ΔU2OS细胞中进行LMNA基因靶向测定[45]，并且发现R1 KEAP1抑制剂而不是其FN3对照的转染导致基因靶向(尽管较少)的强烈激活，以及KEAP1耗竭(图16)。KEAP1的抑制可能是用于激活非***细胞中HR的有利途径。
本发明的范围不限于本文所描述的具体实施方案，因为这些实施方案仅作为本发明一方面的单独说明，并且任何功能上等同的实施方案都在本发明的范围内。实际上，除了本文所示和描述的那些修改以外，从前述描述和附图中，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得明显。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用整体并入本文中一样。本文提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，用于描述和公开本文报道的可结合本发明使用的方法、试剂等目的。本文中没有内容能够解释为承认本发明无权凭借先前的发明而早于公开此类公开。
表1
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Claims (16)

1.一种用于激活或调节细胞中的同源重组的方法，其包括：
(a)促进或刺激所述细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生；
(b)使所述细胞与BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物接触；
(c)激活或刺激BRCA1募集到DNA双链断裂(DSB)位点；
(d)抑制或除去KEAP1或CRL3-KEAP1；
(e)抑制USP11的降解或促进USP11活性；和/或
(f)抑制DCAF10。
2.如权利要求1所述的方法，其包括抑制KEAP1或DCAF10。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括重构或激活DNA末端切除。
4.用于激活细胞中的同源重组的方法，其中DNA末端切除被激活或重构从而产生单链DNA，所述方法包括促进或刺激所述细胞中BRCA1-PALB2或BRCA1-PALB2-BRCA2复合物的组装或发生。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中通过抑制53BP1表达或活性以及上调或表达CtIP来激活DNA末端切除。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过施用CtIP或CtIP的类似物来上调或表达CtIP。
7.如权利要求3所述的方法，其包括抑制或除去KEAP1和53BP1，以及上调或表达CtIP或CtIP的类似物。
8.如权利要求5、6或7所述的方法，其中通过施用53BP1短干扰(si)RNA、短发夹(sh)RNA或微小RNA(miRNA)来抑制53BP1。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括向所述细胞中引入基因编辑***。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述基因编辑***是成簇规律性间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)***、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)***或锌指核酸酶***。
11.一种用于改变与细胞中的靶多核苷酸序列相关的遗传病症的方法，其包括：(1)根据权利要求1至8中任一项所述的方法激活所述细胞中的同源重组；以及(2)使所述靶多核苷酸序列与CRISPR相关(Cas)蛋白和一至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导并且杂交至所述靶多核苷酸序列的所选基序，其中切割所述靶多核苷酸序列，从而使所述靶多核苷酸序列的表达减少、敲除或从不期望的序列校正为期望序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞处于细胞周期的G1期(G1)或细胞周期的G0期(G0)。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞处于细胞周期的G1期(G1)。
14.一种用于监测样品中USP11的活性或表达的方法，其包括(i)在所述样品中分离以下的复合物：(a)BRCA1和PALB2；(b)BRCA1、PALB2和BRCA2；(c)USP11和PALB2；和/或(d)USP11和DCAF10；(ii)测量所述复合物的水平；以及(iii)检测与对照相比所述复合物的活性或表达的增加或减少，作为USP11的活性或表达的指示。
15.一种在个体中预测对PARP抑制剂的响应或者将对PARP抑制剂的响应分类的方法，其包括测定来自受试者的样品中BRCA1、PALB2和BRCA2的复合物以及与对照进行比较以确定所述个体是否对所述PARP抑制剂敏感。
16.一种用于刺激或激活细胞中的同源重组或基因编辑的试剂盒，其包含：(a)53BP1的抑制剂；(b)KEAP1的抑制剂；以及(c)CtIP或CtIP的类似物。
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