CN109112182A - 一种猪单个***基因定量表达的方法 - Google Patents

一种猪单个***基因定量表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪单个***基因定量表达的方法，通过S1：引物池的准备、S2：逆转录反应体系的配置、S3：PCR聚合酶链式反应、S4：模版DNA稀释、S5：qPCR定量聚合酶链式反应等步骤，从而实现猪单个***的基因定量表达。本发明，采用单细胞定量PCR，实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成，不需额外操作，具有减少试验误差、降低污染、提高灵敏度等优势；使用单个细胞进行定量PCR，大大减少了样品需求量，缩短了时间和精力，降低了花费，同时也解决了定量PCR技术在珍贵样品中应用的局限性。本发明方法，操作简单，成本低，误差小，准确度高，效果好。

Description

一种猪单个***基因定量表达的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体为一种猪单个***基因定量表达的方法。
技术背景
现今，动物胚胎工程技术的发展极大地促进了畜牧业和生物医学的进步，利用它可以改良家畜品种、培育转基因新品种、制备人类疾病模型、生产药用蛋白、研究胚胎发育机理等。而猪是胚胎生物学家和遗传学家研究的重中之重，因为猪的生理和解剖结构与人类有很大的相似之处。
在畜牧业生产中，母猪繁殖力低是影响生产效率和经济效益的关键因素之一，而早期胚胎死亡被认为是造成母猪繁殖力下降的主要原因之一，约30％的胚胎死亡发生在受精卵形成到胚胎着床的这一段时间内。因此，针对早期胚胎发育的研究一直是家畜繁殖学的研究热点。对早期胚胎发育研究的常规方法包括RNA干扰、蛋白质印迹、免疫荧光染色及定量PCR技术。其中定量PCR技术可用于DNA或RNA的定量分析、基因表达差异分析等，是现代动物胚胎生物技术的重要和必不可少环节。
传统的定量PCR技术需要进行细胞收样、总RNA的提取、反转录及最后的Step One仪器的定量分析。传统的qPCR操作步骤多，所需时间长，增加了操作过程中出现样品污染的可能性，并且其所需的样品比较多，一次定量PCR所需数十枚细，这就限制了此技术在珍贵样品中的应用。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种猪单个***基因定量表达的方法，以解决以上缺陷。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪单个***基因定量表达的方法，包括以下步骤：
S1：Assay Pool(引物池)的准备
将OCT4、NANOG、SOX2、TEL1、TEL2、TEL3、WDR5、EF1α1、ID2、STELLA、CARML、INO80、P21、P27、P53、P57、GAPDH、H2A、METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、LIN28、L-MYC、CDX2共25个基因的扩增引物，按比例进行混合，制成引物池，所述25个基因的扩增引物的各自终浓度均为0.1μM；
S2：RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的配置
在4个无核酸的离心管中，均配置RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)5.0μl，并放置在冰上待用，然后取形态良好的猪***，用DPBS杜氏磷酸盐缓冲液洗涤三次，向四个离心管中各加入一个***，立即置于-80℃冰箱中放置2min，最后3000rpm条件下离心2min；
S3：PCR(聚合酶链式反应)
将离心后的离心管立即置于PCR仪中进行反应，反应步骤及控制条件分别为：逆转录，50℃、60min、1个循环；预变性，95℃、3min、1个循环；变性，95℃、15s、0个循环；退火、延伸，60℃、15min、17个循环；维持在4℃待用；
S4：模版DNA稀释
将PCR反应结束后待用的模版DNA，按照800～1200的稀释倍数进行稀释，涡旋混匀，3000rpm条件下离心2min，然后-20℃保存备用；
S5：qPCR(定量聚合酶链式反应)
利用稀释离心备用的模版DNA配置qPCR反应体系，然后在300rpm条件下离心2min，最后立即置于qPCR仪中进行反应，从而实现猪单个***的基因定量表达。
优选地，以重量份计，所述RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2～3份、Assay Pool(引物池)0.2～0.8份、RT/Taq酶0.05～0.15份、Nuclease free water(无核酸的水)1.5～2.5份。
优选地，以重量份计，所述qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR GreenMaster Mix 9～13份、Assay Pool(引物池)0.5～2份、稀释后的模版DNA 0.5～2份、Nuclease free water(无核酸的水)6～9份。
优选地，所述qPCR反应步骤及控制条件分别为：步骤一：预变性，95℃、5min；步骤二：循环反应，40个循环，先95℃、10s，然后60℃、30s，最后95℃、15s；步骤三：溶解曲线，40个循环，先60℃、60s，然后95℃、15s。
优选地，以重量份计，所述RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2.5份、Assay Pool引物池0.5份、RT/Taq酶0.1份、Nucleasefree water(无核酸的水)1.9份。
优选地，以重量份计，所述qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR GreenMaster Mix 10.4份、Assay Pool(引物池)1份、稀释后的模版DNA 1份、Nuclease freewater(无核酸的水)7.6份。
本发明的有益效果在于：
本发明一种猪单个***基因定量表达的方法，采用单细胞定量PCR仅需模版DNA的扩增和Step One仪器的定量分析两步化，实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成，不需额外的操作，具有减少试验误差、降低污染、提高灵敏度等优势。使用单个细胞进行定量PCR大大减少了样品的需求量，缩短了投入的时间和精力，并且降低了花费，同时也解决了定量PCR技术在珍贵样品中应用的局限性。本发明方法，操作简单，成本低，误差小，准确度高，效果好。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
一种猪单个***基因定量表达的方法，包括以下步骤：
S1：Assay Pool(引物池)的准备
将OCT4、NANOG、SOX2、TEL1、TEL2、TEL3、WDR5、EF1α1、ID2、STELLA、CARML、INO80、P21、P27、P53、P57、GAPDH、H2A、METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、LIN28、L-MYC、CDX2共25个基因的扩增引物，按比例进行混合，制成引物池，所述25个基因的扩增引物的各自终浓度均为0.1μM。
S2：RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的配置
在4个无核酸的离心管中，均配置RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)5.0μl，并放置在冰上待用，然后取形态良好的猪***，用DPBS杜氏磷酸盐缓冲液洗涤三次，向四个离心管中各加入一个***，立即置于-80℃冰箱中放置2min，最后3000rpm条件下离心2min；
其中，以重量份计，RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2份、Assay Pool(引物池)0.2份、RT/Taq酶0.15份、Nucleasefree water(无核酸的水)2.5份。
S3：PCR(聚合酶链式反应)
将离心后的离心管立即置于PCR仪中进行反应，反应步骤及控制条件分别为：逆转录，50℃、60min、1个循环；预变性，95℃、3min、1个循环；变性，95℃、15s、0个循环；退火、延伸，60℃、15min、17个循环；维持在4℃待用。
S4：模版DNA稀释
将PCR反应结束后待用的模版DNA，按照800～1200的稀释倍数进行稀释，涡旋混匀，3000rpm条件下离心2min，然后-20℃保存备用。
S5：qPCR(定量聚合酶链式反应)
利用稀释离心备用的模版DNA配置qPCR反应体系，然后在300rpm条件下离心2min，最后立即置于qPCR仪中进行反应，从而实现猪单个***的基因定量表达。
其中，以重量份计，qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR Green MasterMix 9份、Assay Pool(引物池)2份、稀释后的模版DNA 0.5份、Nuclease free water(无核酸的水)9份。
其中，qPCR反应步骤及控制条件分别为：步骤一：预变性，95℃、5min；步骤二：循环反应，40个循环，先95℃、10s，然后60℃、30s，最后95℃、15s；步骤三：溶解曲线，40个循环，先60℃、60s，然后95℃、15s。
实施例2：
一种猪单个***基因定量表达的方法，包括以下步骤：
S1：Assay Pool(引物池)的准备
将OCT4、NANOG、SOX2、TEL1、TEL2、TEL3、WDR5、EF1α1、ID2、STELLA、CARML、INO80、P21、P27、P53、P57、GAPDH、H2A、METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、LIN28、L-MYC、CDX2共25个基因的扩增引物，按比例进行混合，制成引物池，所述25个基因的扩增引物的各自终浓度均为0.1μM。
S2：RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的配置
在4个无核酸的离心管中，均配置RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)5.0μl，并放置在冰上待用，然后取形态良好的猪***，用DPBS杜氏磷酸盐缓冲液洗涤三次，向四个离心管中各加入一个***，立即置于-80℃冰箱中放置2min，最后3000rpm条件下离心2min；
其中，以重量份计，RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)3份、Assay Pool(引物池)0.8份、RT/Taq酶0.05份、Nucleasefree water(无核酸的水)1.5份。
S3：PCR(聚合酶链式反应)
将离心后的离心管立即置于PCR仪中进行反应，反应步骤及控制条件分别为：逆转录，50℃、60min、1个循环；预变性，95℃、3min、1个循环；变性，95℃、15s、0个循环；退火、延伸，60℃、15min、17个循环；维持在4℃待用。
S4：模版DNA稀释
将PCR反应结束后待用的模版DNA，按照800～1200的稀释倍数进行稀释，涡旋混匀，3000rpm条件下离心2min，然后-20℃保存备用。
S5：qPCR(定量聚合酶链式反应)
利用稀释离心备用的模版DNA配置qPCR反应体系，然后在300rpm条件下离心2min，最后立即置于qPCR仪中进行反应，从而实现猪单个***的基因定量表达。
其中，以重量份计，qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR Green MasterMix 13份、Assay Pool(引物池)0.5份、稀释后的模版DNA 2份、Nuclease free water(无核酸的水)6份。
其中，qPCR反应步骤及控制条件分别为：步骤一：预变性，95℃、5min；步骤二：循环反应，40个循环，先95℃、10s，然后60℃、30s，最后95℃、15s；步骤三：溶解曲线，40个循环，先60℃、60s，然后95℃、15s。
实施例3：
一种猪单个***基因定量表达的方法，包括以下步骤：
S1：Assay Pool(引物池)的准备
将OCT4、NANOG、SOX2、TEL1、TEL2、TEL3、WDR5、EF1α1、ID2、STELLA、CARML、INO80、P21、P27、P53、P57、GAPDH、H2A、METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、LIN28、L-MYC、CDX2共25个基因的扩增引物，按比例进行混合，制成引物池，所述25个基因的扩增引物的各自终浓度均为0.1μM。
S2：RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的配置
在4个无核酸的离心管中，均配置RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)5.0μl，并放置在冰上待用，然后取形态良好的猪***，用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)洗涤三次，向四个离心管中各加入一个***，立即置于-80℃冰箱中放置2min，最后3000rpm条件下离心2min；
其中，以重量份计，RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2.5份、Assay Pool(引物池)0.5份、RT/Taq酶0.1份、Nucleasefree water(无核酸的水)1.9份。
S3：PCR(聚合酶链式反应)
将离心后的离心管立即置于PCR仪中进行反应，反应步骤及控制条件分别为：逆转录，50℃、60min、1个循环；预变性，95℃、3min、1个循环；变性，95℃、15s、0个循环；退火、延伸，60℃、15min、17个循环；维持在4℃待用。
S4：模版DNA稀释
将PCR反应结束后待用的模版DNA，按照800～1200的稀释倍数进行稀释，涡旋混匀，3000rpm条件下离心2min，然后-20℃保存备用。
S5：qPCR(定量聚合酶链式反应)
利用稀释离心备用的模版DNA配置qPCR反应体系，然后在300rpm条件下离心2min，最后立即置于qPCR仪中进行反应，从而实现猪单个***的基因定量表达。
其中，以重量份计，qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR Green MasterMix 10.4份、Assay Pool(引物池)1份、稀释后的模版DNA 1份、Nuclease free water(无核酸的水)7.6份。
其中，qPCR反应步骤及控制条件分别为：步骤一：预变性，95℃、5min；步骤二：循环反应，40个循环，先95℃、10s，然后60℃、30s，最后95℃、15s；步骤三：溶解曲线，40个循环，先60℃、60s，然后95℃、15s。
上述是对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：Assay Pool(引物池)的准备
将OCT4、NANOG、SOX2、TEL1、TEL2、TEL3、WDR5、EF1α1、ID2、STELLA、CARML、INO80、P21、P27、P53、P57、GAPDH、H2A、METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、LIN28、L-MYC、CDX2共25个基因的扩增引物，按比例进行混合，制成引物池，所述25个基因的扩增引物的各自终浓度均为0.1μM；
S2：RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的配置
在4个无核酸的离心管中，均配置RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)5.0μl，并放置在冰上待用，然后取形态良好的猪***，用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液洗涤三次)，向四个离心管中各加入一个***，立即置于-80℃冰箱中放置2min，最后3000rpm条件下离心2min；
S3：PCR(聚合酶链式反应)
将离心后的离心管立即置于PCR仪中进行反应，反应步骤及控制条件分别为：逆转录，50℃、60min、1个循环；预变性，95℃、3min、1个循环；变性，95℃、15s、0个循环；退火、延伸，60℃、15min、17个循环；维持在4℃待用；
S4：模版DNA稀释
将PCR反应结束后待用的模版DNA，按照800～1200的稀释倍数进行稀释，涡旋混匀，3000rpm条件下离心2min，然后-20℃保存备用；
S5：qPCR(定量聚合酶链式反应)
利用稀释离心备用的模版DNA配置qPCR反应体系，然后在300rpm条件下离心2min，最后立即置于qPCR仪中进行反应，从而实现猪单个***的基因定量表达。
2.根据权利要求1所述的一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，以重量份计，所述RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2～3份、Assay Pool(引物池)0.2～0.8份、RT/Taq酶0.05～0.15份、Nucleasefree water(无核酸的水)1.5～2.5份。
3.根据权利要求1所述的一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，以重量份计，所述qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR Green Master Mix 9～13份、Assay Pool(引物池)0.5～2份、稀释后的模版DNA 0.5～2份、Nuclease free water(无核酸的水)6～9份。
4.根据权利要求1所述的一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，所述qPCR反应步骤及控制条件分别为：步骤一：预变性，95℃、5min；步骤二：循环反应，40个循环，先95℃、10s，然后60℃、30s，最后95℃、15s；步骤三：溶解曲线，40个循环，先60℃、60s，然后95℃、15s。
5.根据权利要求1所述的一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，以重量份计，所述RT-PreAmp Master Mix(逆转录反应体系)的组分包括：2×Reaction Mix(反应混合物)2.5份、Assay Pool引物池0.5份、RT/Taq酶0.1份、Nuclease free water(无核酸的水)1.9份。
6.根据权利要求1所述的一种猪单个***基因定量表达的方法，其特征在于，以重量份计，所述qPCR反应体系的组分，包括：qPCR SYBR Green Master Mix 10.4份、Assay Pool(引物池)1份、稀释后的模版DNA 1份、Nuclease free water(无核酸的水)7.6份。
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