CN109112091B

CN109112091B - 一株阴沟肠杆菌fy-0701以及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109112091B
Application number: CN201810620074.3A
Authority: CN
Inventors: 马挺; 纪凯华; 李国强; 高歌
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: CN109112091A

Abstract

本发明提供了一株阴沟肠杆菌FY‑0701以及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，该阴沟肠杆菌FY‑0701的保藏编号为CGMCCNo.15619。本发明提供的一株阴沟肠杆菌FY‑0701能够达到深层调剖的效果。

Description

一株阴沟肠杆菌FY-0701以及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株阴沟肠杆菌FY-0701以及其构建方法和应用。

背景技术

近年来，三次开采技术被应用于提高原油生产(Green and Willhite,1998)，微生物提高石油采收率(MEOR)技术由于其诸多优势如环境友好性、成本低效益高、高生物降解性和低毒性而被认为是一种重要的三次开采技术(Ghojavand et al.,2012；Kobayashi etal.,2011；Lazar et al.,2007；Makkar et al.,2011)。MEOR技术应用微生物和/或其代谢产物如有机酸、气体、生物表面活性剂和聚合物，通过向井内注入营养和培养微生物来延长油藏的寿命(Sen,2008；Sun et al.,2011).

异质性是中国一些油藏石油采收率低的主要原因之一，注入水快速流过高渗透性通道到达生产井，导致仅有一小部分的原油被采出(Han et al.,1999；Sun et al.,2013)。为了提高注入水的驱动效率，聚合物被用于高渗透地区的选择性封堵(Ana et al.,2009；Zheng et al.,2000)。目前，实验和生产中应用最广泛的聚合物是聚丙烯酰胺和黄原胶(Ana et al.,2009；Melo et al.,2002)。聚丙烯酰胺是一种难降解且有毒的化学聚合物。黄原胶是一种水溶性的对生物降解极为敏感的生物聚合物(TaylorandNasr-EI-Din,1998)。因此，寻找一种无毒且对生物降解敏感性低但又可被降解的聚合物势在必行。

细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是由细菌产生的一种不溶于水的多糖，其无毒且降解周期长(Ma et al.,2012；Nathan et al.,2011)。因此，细菌纤维素产生菌株可以注入到油藏中选择性的封堵并提高石油采收率。目前，最著名的BC产生菌株Gluconacetobactersp.是严格好氧菌，不能适应油藏中的缺氧环境(Jung et al.,2010a,b)。Ma等人分离出了一株在好氧和厌氧条件下均能产生细菌纤维素的菌株并命名为Enterobactersp.FY-07(Ma et al.,2012；Ji et al.,2016)。Enterobactersp.FY-07有应用于油藏高渗透区域封堵的潜力。然而，Enterobactersp.FY-07在各种普通的碳源作为唯一碳源的情况下都能产生大量的BC，会影响油藏中细菌的迁移效率，从而影响深层调剖能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一株阴沟肠杆菌FY-0701，能够达到深层调剖的效果。

本发明提供了一株阴沟肠杆菌FY-0701，该阴沟肠杆菌FY-0701的保藏编号为CGMCCNo.15619。

本发明还提供了一株阴沟肠杆菌FY-0701的构建方法，包括以下步骤：

1)以阴沟肠杆菌FY-07基因组为模版，用引物Fpg1u和Fpg1l扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂，所述Fpg1u的序列如SEQ ID No.1所示，所述Fpg1l的序列如SEQIDNo.2所示；

以阴沟肠杆菌FY-07基因组为模版，用引物Fpg3u和Fpg3l扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的下游同源臂，所述Fpg3u的序列如SEQ ID No.3所示，所述Fpg3l的序列如SEQ IDNo.4所示；

2)以pGFP质粒为模版，用引物Fpg2u和Fpg2l扩增绿色荧光蛋白基因，所述Fpg2u的序列如SEQ ID No.5所示，所述Fpg2u的序列如SEQ ID No.6所示；

3)采用重叠PCR将所述步骤1)得到的上游同源臂、下游同源臂和所述步骤2)得到的绿色荧光蛋白基因进行连接，得到Fpg片段；

4)将所述步骤3)得到的Fpg片段经EcoR I和XbaI进行双酶切，得到Fpg酶切产物；

将质粒pTSK1经EcoRI和Xba I进行双酶切，得到pTSK1酶切产物；

5)将所述步骤4)得到的Fpg酶切产物和pTSK1酶切产物经T4DNA连接酶进行连接，将得到的连接产物转化进入E.coli DH5α感受态细胞，得到基因敲除载体pTSFPG；

6)采用接合转移法将所述步骤5)得到的基因敲除载体pTSFPG转移到阴沟肠杆菌FY-07中，在含Car和Tet双抗培养基上筛选转化子；

7)将所述步骤6)筛选得到的转化子接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第一培养，将得到的第一培养物在含有Tet抗体的LB固体培养基上进行第二培养，得到第二培养物，所述第一培养的温度为30～40℃，所述第二培养的温度为37～45℃；

8)将所述步骤7)得到的第二培养物接种于含有纤维素酶和Tet抗体的LB液体培养基中进行第三培养，得到第三培养物，分别以引物Fpgk1u和Fpgk1l、引物Fpgk2u和Fpgk2l对第三培养物进行两个体系的PCR扩增，当任意体系的PCR扩增出一条片段时，则得到的第三培养物为单交换转化子，所述Fpgk1u的序列如SEQ ID No.7所示，所述Fpgk1l的序列如SEQID No.8所示，所述Fpgk2u的序列如SEQ ID No.9所示，所述Fpgk2l的序列如SEQ ID No.10所示，所述第三培养的温度为25～35℃；

9)将所述步骤8)得到的单交换转化子接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第四培养，得到第四培养物，所述第四培养的温度为30～40℃；

10)将所述步骤9)得到的第四培养物接种于含有蔗糖的LB固体培养基上进行第五培养，得到第五培养物，所述第五培养的温度为37～45℃；

11)将所述步骤10)得到的第五培养物接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第六培养，得到第六培养物，分别用引物Fpgk1u和Fpgk1l、Fpgk2u和Fpgk2l对所述第六培养物进行两个体系的PCR扩增，当两个体系均扩增出片段，而且用引物Fpgk1u和Fpgk2l对第六培养物进行PCR扩增得到的片段与野生型片段减去果糖1,6-2磷酸化酶基因的片段的数据相同时，得到的第六培养物为阴沟肠杆菌FY-0701，所述第六培养的温度为25～35℃；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。

优选的，所述步骤1)扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂的体系每25μl包括：PrimerstarPol 12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg1u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg1l 0.5μl、浓度为100～300ng/μL的阴沟肠杆菌FY-07基因组1μl和ddH₂O10.5μl；

所述步骤1)扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的下游同源臂的体系每25μl包括：PrimerstarPol12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg3u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg3l 0.5μl、浓度为100～300ng/μL的阴沟肠杆菌FY-07基因组1μl和ddH₂O10.5μl。

优选的，所述步骤1)扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂和下游同源臂的扩增条件独立的包括：98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；30个循环。

优选的，所述步骤2)扩增绿色荧光蛋白基因使用的的体系每15μl包括PrimerstarPol 12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg2u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg2l0.5μl、浓度为100～300ng/μL的质粒pGFP 1μl和ddH₂O 10.5μl；

所述扩增绿色荧光蛋白基因的条件为：98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；30个循环。

优选的，所述步骤3)重叠PCR用的引物包括Fpgnu和Fpgnl，所述Fpgnu的序列如SEQIDNo.11所示，所述Fpgnl的序列如SEQ ID No.12所示。

优选的，所述重叠PCR用的体系每25μl包括：PrimerstarPol 12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpgnu 0.5μl、20pmol/L的Fpgnl 0.5μl、浓度为100～200ng/μL的上游同源臂1μl、浓度为100～200ng/μL的下游同源臂1μl和9.5μlddH₂O；

所述重叠PCR的条件包括：98℃，10s；72℃，10s+10s/kb；10个循环；加入Fpgnu和Fpgnl，98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；25个循环。

本发明还提供了上述技术方案所述的阴沟肠杆菌FY-0701或上述方案所述的构建方法得到的阴沟肠杆菌FY-0701在原油采收中的应用。

优选的，所述阴沟肠杆菌FY-0701作为深层调剖。

本发明提供了一株阴沟肠杆菌FY-0701，该阴沟肠杆菌FY-0701的保藏编号为CGMCC No.15619。本发明提供的阴沟肠杆菌FY-0701相较于野生菌株达到深层调剖的效果原理是：野生型菌株在几乎所有碳源存在条件下均能产生细菌纤维素，细菌纤维素会交联聚集形成膜状结构，即使采用玻璃珠打散等方式进行处理，其颗粒体积仍然较大，在注入岩心的过程中因岩心孔隙大小的原因只能被注入到岩心前端，很难推进到中后端，无法达到深层调剖。基因工程菌株在甘油等非糖碳源存在的条件下不产生细菌纤维素，估其大小只是菌体本身大小，在进行注入时可被注入到岩心中后端，故可实现深层调剖。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的一株阴沟肠杆菌FY-0701，较野生型菌株相比，能够达到深层调剖的效果。

生物保藏说明

阴沟肠杆菌FY-0701(Enterobactercloacae)，于2018年04月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.15619。

附图说明

图1为Enterobactersp.FY-07在糖类碳源葡萄糖和非糖碳源甘油条件下的生长曲线；

图2为Enterobactersp.FY-07在葡萄糖或甘油作为碳源条件下RNA提取后的凝胶电泳检测结果；

图3为果糖1,6-2磷酸化酶fbp基因定量引物的qPCR检测标准曲线；

图4为果糖1,6-2磷酸化酶fbp基因定量引物的qPCR检测溶解曲线；

图5为不同碳源条件下Enterobacter sp.FY-07基因组中3个果糖1，2-2磷酸化酶表达情况定量分析

图6为基因敲除载体的构建原理图；

图7为Enterobacter sp.FY-07野生型菌株和基因工程菌株在不同碳源条件下的纤维素产生情况的扫描电子显微镜图像；

图8为微生物调剖物理模拟实验模式图；

图9为微生物调剖物理模拟实验水驱压力和封堵率情况；

图10为荧光定量PCR检测到的各岩芯菌浓分布情况；

图11为当基因工程菌株Enterobactersp.FY-0701被用于微生物选择性封堵时，岩心前端、中端和后端的扫描电子显微镜观察结果；

图12为当野生株Enterobactersp.FY-07被用于微生物选择性封堵时，岩心前端、中端和后端的扫描电子显微镜观察。

具体实施方式

本发明提供的阴沟肠杆菌FY-0701为敲除阴沟肠杆菌FY-07的果糖1,6-2磷酸化酶基因的菌株，所述果糖1,6-2磷酸化酶基因优选为果糖1,6-2磷酸化酶基因fbp，登录号为AKI40_4472。本发明对所述阴沟肠杆菌FY-07的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可，在本发明实施例中优选采用保藏编号为CGMCC No:6103的阴沟肠杆菌FY-07。本发明提供的阴沟肠杆菌FY-0701能够达到深层调剖的技术效果。本发明提供的阴沟肠杆菌FY-0701在糖类物质作为碳源时产细菌纤维素，而以非糖物质作为碳源时不产细菌纤维素。

将质粒pTSK1经EcoRI和Xba I进行双酶切，得到pTSK1酶切产物；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。

本发明以阴沟肠杆菌FY-07基因组为模版，用引物Fpg1u和Fpg1l扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂，所述Fpg1u的序列如SEQ ID No.1所示，所述Fpg1l的序列如SEQID No.2所示；以所述阴沟肠杆菌FY-07基因组为模板，用引物Fpg3u和Fpg3l扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的下游同源臂，所述Fpg3u的序列如SEQ ID No.3所示，所述Fpg3l的序列如SEQ ID No.4所示。

本发明对所述阴沟肠杆菌FY-07基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的提取方法即可。

在本发明中，所述Fpg1u的序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

CTGCAACCTGCCATGGAAT；

所述Fpg1l的序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

TAAAAGGTGCAGAAATCCGTGTACTTAAACAGCTCGCACCGTAACAG。

在本发明中，所述Fpg1u和Fpg1l是根据AKI40_4472基因的上游同源臂设计得到的。

在本发明中，所述所述Fpg3u的序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

AATGGCTACGATGGCGACATGCCGGAAAGAAGAGAAAACG；

所述Fpg3l的序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

GGCAAAATCGGTCAAGATGATT。

在本发明中，所述Fpg3u和Fpg3l是根据AKI40_4472基因的下游同源臂设计得到的。

在本发明中，扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂的体系每25μl优选包括：Primerstar Pol 12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg1u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg1l 0.5μl、浓度为100～300ng/μL的阴沟肠杆菌FY-07基因组1μl和ddH₂O10.5μl；所述阴沟肠杆菌FY-07基因组的浓度更优选为150～250ng/μL，最优选为180～220ng/μL。

在本发明中，所述扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的上游同源臂的扩增条件优选包括：98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；30个循环。

在本发明中，所述扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的下游同源臂的体系每25μl优选包括：Primerstar Pol12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg3u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg3l0.5μl、浓度为100～300ng/μL的阴沟肠杆菌FY-07基因组1μl和ddH₂O10.5μl；所述阴沟肠杆菌FY-07基因组的浓度更优选为150～250ng/μL，最优选为180～220ng/μL。

在本发明中，所述扩增果糖1,6-2磷酸化酶基因的下游同源臂的扩增条件优选包括：98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；30个循环。

本发明以pGFP质粒为模版，用引物Fpg2u和Fpg2l扩增绿色荧光蛋白基因，所述Fpg2u的序列如SEQ ID No.5所示，所述Fpg2l的序列如SEQ ID No.6所示。

本发明对所述pGFP质粒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可。

在本发明中，所述Fpg2u的序列如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：

CTGTTACGGTGCGAGCTGTTTAAGTACACGGATTTCTGCACCTTTTA；

所述Fpg2l的序列如SEQ ID No.6所示，具体如下所示：

CGTTTTCTCTTCTTTCCGGCATGTCGCCAT CGTAGCCATT。

在本发明中，所述Fpg2u和Fpg2l是根据绿色荧光蛋白基因设计得到的。

在本发明中，所述扩增绿色荧光蛋白基因使用的的体系每15μl优选包括PrimerstarPol 12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg2u 0.5μl、浓度为20pmol/L的Fpg2l0.5μl、浓度为100～300ng/μL的质粒pGFP 1μl和ddH₂O 10.5μl；

所述扩增绿色荧光蛋白基因的条件优选为：98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；30个循环。

本发明为了将上游同源臂、下游同源臂和绿色荧光蛋白基因通过重叠PCR连接，Fpg1l与Fpg2u，Fpg2u与Fpg3u分别有长度约为20bp的互补序列。

本发明采用重叠PCR将所述步骤1)得到的上游同源臂、下游同源臂和所述步骤2)得到的绿色荧光蛋白基因进行连接，得到Fpg片段。

在本发明中，所述重叠PCR用的引物包括Fpgnu和Fpgnl，所述Fpgnu的序列如SEQIDNo.11所示，具体如下所示：

TGACGAATTCTGCAACCTGCCATGGAATATGCTGCGGTTG；

所述Fpgnl的序列如SEQ ID No.12所示，具体如下所示：

GATCTCTAGACCGAAATCACCGAAGGCGAAAAATCCCTCAC。

在本发明中，所述Fpgnu和Fpgnl是分别根据上述技术方案所述的上游同源臂序列和下游同源臂序列设计得到的。在本发明中，所述Fpgnu和Fpgnl的序列较长，增加引物配对效率，含有酶切位点和保护碱基，方便通过酶切连接到基因敲除质粒上。

在本发明中，所述重叠PCR用的体系每25μl优选包括：Primerstar Pol12.5μl、浓度为20pmol/L的Fpgnu 0.5μl、20pmol/L的Fpgnl 0.5μl、浓度为100～200ng/μL的上游同源臂1μl、浓度为100～200ng/μL的下游同源臂1μl和9.5μl ddH₂O；所述上游同源臂的浓度更优选为120～180ng/μL，最优选为140～160ng/μL；所述下游同源臂的浓度更优选为120～180ng/μL，最优选为140～160ng/μL。

所述重叠PCR的条件优选包括：98℃，10s；72℃，10s+10s/kb；10个循环；加入Fpgnu和Fpgnl，98℃，10s；55℃，10s；72℃，10s/kb；25个循环。

本发明将得到的Fpg片段经EcoR I和XbaI进行双酶切，得到Fpg酶切产物；将质粒pTSK1经EcoR I和XbaI进行双酶切，得到pTSK1酶切产物。本发明对所述采用EcoR I和Xba I进行双酶切的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的EcoRI和XbaI双酶切的条件即可。

本发明将得到的Fpg酶切产物和pTSK1酶切产物经T4DNA连接酶进行连接，再转化进入E.coli DH5α感受态细胞，得到基因敲除载体pTSFPG。

本发明对所述Fpg酶切产物和pTSK1酶切产物经T4DNA连接酶连接的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的T4DNA连接酶连接的条件即可。本发明对上述经过T4DNA连接酶连接得到的连接产物转化进入E.coli DH5α感受态细胞，再筛选得到基因敲除载体pTSFPG的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的方法即可。

本发明采用接合转移法将得到的基因敲除载体pTSFPG转移到阴沟肠杆菌FY-07中，在含Car和Tet双抗培养基上筛选转化子。本发明对所述筛选转化子的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用筛选转化子的方法即可。在本发明中，所述双抗培养基优选为LB固体培养基，所述LB固体培养基中Car的浓度优选为50ug/mL，所述LB固体培养基中Tet的浓度优选为10ug/mL。

本发明对所述接合转移法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的方法即可。

本发明将筛选得到的转化子接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第一培养，将得到的第一培养物在含有Tet的LB固体培养基上进行第二培养，得到第二培养物，所述第一培养的温度为37～45℃，所述第二培养的温度为37～45℃。在本发明中，所述LB固体培养基中Tet的浓度优选为10ug/mL。在本发明中，所述LB液体培养基中纤维素酶的质量体积浓度优选为万分之一

在本发明中，所述转化子的接种量优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％，最优选为1.0％。

在本发明中，所述第一培养的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述第一培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm；所述第一培养的时间优选为12h。在本发明中，所述第一培养的过程中，敲除载体基因因其含有温度敏感型复制区而进行缓慢丢失。在本发明中，所述纤维素酶消化第一培养物培养过程中产生的细菌纤维素。在本发明中，所述第一培养物为基因敲除载体转移进入的野生型菌株。

在本发明中，所述第二培养的温度优选为40～43℃，更优选为42℃；所述第二培养的时间优选为12h。在本发明中，所述第二培养中含有的Tet筛选发生单交换菌株。在本发明中，所述第二培养物为单菌落，所述单菌落理论上应全部为单交换突变子，所述单交换为上游同源臂或下游同源臂与野生型菌株中上游同源臂或下游同源臂发生交换。

本发明将第二培养物接种于含有纤维素酶和Tet的LB液体培养基中进行第三培养，得到第三培养物，所述第三培养的温度优选为25～35℃。在本发明中，所述第三培养的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述第三培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm。在本发明中，所述LB液体培养基中纤维素酶的质量体积浓度优选为万分之一。在本发明中，所述LB固体培养基中Tet的浓度优选为10ug/mL。

得到第三培养物后，本发明分别以引物Fpgk1u和Fpgk1l、引物Fpgk2u和Fpgk2l对第三培养物进行两个体系的PCR扩增，当任意体系的PCR扩增出一条片段时，则所述第三培养物为单交换转化子，所述Fpgk1u的序列如SEQ ID No.7所示，所述Fpgk1l的序列如SEQ IDNo.8所示，所述Fpgk2u的序列如SEQ IDNo.9所示，所述Fpgk2l的序列如SEQ ID No.10所示。

在本发明中，所述Fpgk1u的序列如SEQ ID No.7所示，具体如下所示：

CGCCAGCCCATCCAGCAGTTTC；

所述Fpgk1l的序列如SEQ ID No.8所示，具体如下所示：

CCACCCCGGTGAACAGCTCCTC。

在本发明中，所述Fpgk1u和Fpgk1l是根据待敲除目的基因的上游同源臂和下游同源臂设计得到的。

在本发明中，所述Fpgk2u的序列如SEQ ID No.9所示，具体如下所示：

CAACCACTACCTGAGCACCCAG；

所述Fpgk2l的序列如SEQ ID No.10所示，具体如下所示：

GGTGAGCGGCATTGGAGTGTAT。

在本发明中，所述Fpgk2u和Fpgk2l是根据待敲除目的基因的上游同源臂和下游同源臂设计得到的。

本发明将单交换转化子接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第四培养，得到第四培养物，所述第四培养的温度为30～40℃。在本发明中，所述LB液体培养基中纤维素酶的质量体积浓度优选为万分之一。

在本发明中，所述单交换转化子的接种量优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％，最优选为1.0％。

在本发明中，所述第四培养的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述第四培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm；所述第四培养的时间优选为12h。

在本发明中，所述第四培养的过程中，单交换转化子要么维持单交换状态不变，要么进行二次交换形成野生型或双交换菌株。

本发明将第四培养物接种于含有蔗糖的LB固体培养基上进行第五培养，得到第五培养物，所述第五培养的温度为37～45℃。

在本发明中，所述LB固体培养基中蔗糖的质量百分含量优选为5～10，更优选为6～9％，最优选为7～8％。在本发明中，所述蔗糖的作用为杀死没有进行二次交换的单交换转化子，使在蔗糖平板上生长的要么是野生型，要么是基因敲除菌株。

在本发明中，所述第五培养的温度优选为40～43℃，更优选为42℃；所述第五培养的时间优选为12h。

在本发明中，因敲除载体上含有蔗糖致死基因sacB，理论上在含有蔗糖的培养基上只能生长野生型菌株或双交换菌株。

本发明将第五培养物接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中进行第六培养，得到第六培养物，所述第六培养的温度为30℃。在本发明中，所述第六培养的温度优选为30℃；所述第六培养的时间优选为12h。在本发明中，所述LB液体培养基中纤维素酶的质量体积浓度优选为万分之一。在本发明中，所述第六培养得到的培养物要么是野生型菌株，要么是双交换转化子。

得到第六培养物后，本发明分别用引物Fpgk1u和Fpgk1l、Fpgk2u和Fpgk2l对所述第六培养物进行两个体系的PCR扩增，当两个体系均扩增出片段，而且用引物Fpgk1u和Fpgk2l对第六培养物进行PCR扩增得到的片段与野生型片段减去果糖1,6-2磷酸化酶基因的片段的数据相同时，得到的第六培养物为阴沟肠杆菌FY-0701。

在本发明中，所述野生型片段为理论上野生型培养物经同一对引物对扩增所得片段。

本发明还提供了上述技术方案所述的阴沟肠杆菌FY-0701或上述技术方案所述的构建方法得到的阴沟肠杆菌FY-0701在原油采收中的应用。在本发明中，所述阴沟肠杆菌FY-0701作为深层调剖剂。在本发明中，所述阴沟肠杆菌FY-0701作为微生物封堵剂。

在本发明中，所述阴沟肠杆菌FY-0701用于微生物封堵剂的具体应用方法优选为：将菌株接种于甘油为碳源的培养基，30℃，200rpm培养12h，在此培养过程中因该菌株已敲除果糖1，6-2磷酸化酶，故在以甘油为碳源的培养基中无法产生纤维素；将培养物经处理后注入人工岩心，注入模式1：将培养得到的培养物用灭菌蒸馏水进行稀释至终浓度为4‰，注入0.5PV该稀释物，继续注入1PV的培养基，然后注入0.5PV灭菌蒸馏水；注入模式2：将培养物用发酵培养基进行稀释至终浓度为2‰，注入1PV该稀释物，然后注入1PV灭菌蒸馏水；将人工岩心置于30℃培养箱中培养3d；进行水驱，记录水驱压力变化，根据公式计算封堵率。

在本发明中，所述阴沟肠杆菌FY-0701进行深层调剖的原理(见图10)是：野生型菌株在几乎所有碳源存在条件下均能产生细菌纤维素，细菌纤维素会交联聚集形成膜状结构，即使采用玻璃珠打散等方式进行处理，其颗粒体积仍然较大，在注入岩心的过程中因岩心孔隙大小的原因只能被注入到岩心前端，很难推进到中后端，无法达到深层调剖；阴沟肠杆菌FY-0701菌株在甘油等非糖碳源存在的条件下不产生细菌纤维素，估其大小只是菌体本身大小，在进行注入时可被注入到岩心中后端，故可实现深层调剖。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株阴沟肠杆菌FY-0701以及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

基因工程菌株构建目标靶点的选择

本发明旨在构建一株在糖类物质作为碳源时产细菌纤维素，而以非糖物质作为碳源时不产细菌纤维素的菌株。因此选择应用RNA提取和反转录定量PCR分析Enterobactersp.FY-07在以甘油或葡萄糖作为唯一碳源时糖异生途径关键基因果糖-1，6-2磷酸化酶表达情况的异同。在对数生长后期，4℃，5000rpm离心10min收集以葡萄糖或甘油作为唯一碳源培养的Enterobactersp.FY-07细菌菌体，并迅速置于液氮中，Enterobactersp.FY-07在葡萄糖或甘油作为碳源条件下的生长曲线如图1所示。用Purezol结合RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech,Beijing,China)提取细菌总RNA。根据操作手册的建议，用DNase(Takara,Dalian,China)在柱上处理所有的RNA样本以除去残留的基因组DNA污染。应用琼脂糖凝胶电泳和Bio-drop纳米分光光度计检测RNA的浓度和完整性，Enterobactersp.FY-07在葡萄糖或甘油作为碳源条件下RNA提取后的凝胶电泳结果如图2所示。用反转录试剂盒(Tiangen,Beijing,China)进行反转录获得cDNA。每个cDNA合成反应加入500ng总RNA。对糖异生途径中的关键基因果糖-1，6-二磷酸化酶基因的三个拷贝进行引物设计合成和相对定量分析，以AKI_4472基因为例，其扩增标准曲线和熔解曲线检测结果如图3及图4所示，16s rRNA基因作为2-ΔΔCT中标准化RNA表达的内参基因R值的误差(ΔR)通过Bio-rad qPCR iQ5的程序计算。该实施例中应用的引物序列如表2所示。经上述技术手段确定基因工程菌株的构建靶点为敲除果糖1,6-2磷酸化酶基因的AKI_4472拷贝。

用于此实例中生长曲线的测定，RNA提取和反转录定量PCR分析的Enterobactersp.FY-07的发酵培养基组成如下：

KNO₃1g/L，Na₂HPO₄.12H₂O 15g/L，MgSO₄.7H₂O 0.25g/L，MnCl₂0.2g/L，酵母粉0.1g/L，蛋白胨2g/L，溶剂为水，121℃灭菌30min；糖类碳源为葡萄糖，非糖碳源为甘油，加入量均为配成300g/L的母液，115℃灭菌20min，接种前按照10％加入到发酵培养基中。

Enterobactersp.FY-07菌株培养及生长曲线的测定方法如下：

①菌种活化及种子液的制备方法：从冰箱中取出冷冻保存的Enterobactersp.FY-07甘油管，冰上融化。在超净工作台中，用接种环蘸取少量菌液划线接种于平板培养基上，30℃静置培养至平板上长出单菌落(约24h)。用接种环挑取生长状态良好的单菌落密集划线接种于斜面培养基，30℃静置培养至斜面培养基被菌体膜和纤维素膜完全覆盖(约24h)。用适量无菌蒸馏水将斜面培养基上的菌膜洗下，充分悬浮于100mL的无菌蒸馏水中得到菌悬液，置于4℃冰箱保存备用。菌悬液菌浓可通过梯度稀释涂布平板方法测定，一般情况下菌悬液菌浓为10⁷cfu/mL。

②接种：向发酵培养基中按照加入量10％分别加入母液浓度为300g/L的甘油或者葡萄糖母液即为非糖碳源培养基和糖类培养基。向培养基中加入终浓度为1g/L的纤维素酶，按照接种量5％向两种培养基中加入种子液。

③生长曲线的测定：将接种后的非糖碳源培养基和糖类碳源培养基30℃200r/min振荡培养，每隔3h，分别取非糖碳源振荡培养及糖类碳源振荡培养的培养液各5mL，利用紫外可见分光光度计测量波长600nm处的吸光度值，绘制吸光度值(纵坐标)随时间(横坐标)的变化曲线，即为Enterobactersp.FY-07在糖类碳源葡萄糖和非糖碳源甘油条件下的生长曲线，结果见图1。

RNA提取实验步骤如下：

①将种子液按照5％接种量接种于糖类物质作为碳源和非糖物质作为碳源的培养基中，30℃、200r/min振荡培养至对数生长中后期(根据测定的生长曲线选取取样时间点)。

②将全部培养液分多次离心，离心参数为4℃，5000r/min，离心10min，弃上清收集菌体于预冷的50mL无RNA酶离心管中。将离心管倒置，控干液体。将菌体连同离心管放入液氮罐中，用于提取总RNA。

③RNA提取的准备工作：用70％的乙醇擦洗台面，实验过程中用到的枪头、离心管、试剂等均为无RNA酶的。操作者需带手套、口罩。整个RNA提取过程要保持低温，试剂需提取预冷。研钵用锡箔纸包裹严实，150℃干热灭菌4h。

④液氮预冷研钵，将菌体取出放置于研钵中，加入1mLPurezol试剂，研磨成粉状。研磨过程中不断补充液氮直至研磨完成。

⑤继续研磨至研钵中的样品完全融化成水状，吸取样品转移至无RNA酶的1.5mL离心管中。

⑥向离心管中加入200μL预冷三氯甲烷，剧烈震荡15s，静置10min，室温放置过程中多次混匀样品。4℃，12000r/min离心15min。

⑦吸取上层液体，转移到新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入500μL冷冻预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀。

⑧将上述液体全部转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12000rpm离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

⑨向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

⑩DNase I工作液的配制：取10μLDNase I储存液放入新的RNase-free离心管中

注：当提取RNA用于RT-qPCR时，只需收集5mL培养液提取总RNA即可。

RNA质量检测：

提取到的RNA需进行浓度和质量检测以确定是否满足转录组测序的要求。RNA浓度和质量检测一般采用电泳检测及超微量分光光度计检测两种方法。

①电泳法检测：用无RNA酶的BufferTEA配制1％的琼脂糖凝胶，取2μL提取的RNA溶液点样并进行电泳。电泳过程中，电压设定为150V，电泳时间尽量不要超过15min。电泳结束后，利用凝胶成像仪对凝胶进行成像并分析RNA样品的完整性。

②超微量分光光度计法检测：取1μL提取的RNA溶液，用超微量分光光度计测定RNA样品在波长260nm，280nm及230nm下的吸光度值，计算RNA样品的浓度，并根据OD260nm/OD280nm及OD260nm/OD230nm的比值确定RNA样品的纯度。

凝胶电泳检测结果如图2所示，葡萄糖及甘油条件下提取的RNA均可见非常清晰的两条带，这两条条带迁移速度快的为16srRNA，速度较慢的为23srRNA。此外，几乎不可见5srRNA条带且23srRNA条带亮度大于16srRNA条带亮度，这说明提取的RNA样品几乎无降解，完整性较好。所提取RNA的浓度及纯度如表1所示，葡萄糖及甘油条件下提取的RNA样品的浓度均较高，提取的RNA总量满足实验要求，且纯度较高，几乎无DNA、蛋白质及盐类污染。

表1不同碳源条件下提取的RNA样品的浓度检测结果

样品编号	浓度(ng/μL)	OD<sub>260nm</sub>/OD<sub>280nm</sub>	OD<sub>260nm</sub>/OD<sub>230nm</sub>
				1(glucose)	1936	2.017	1.93
2(glycerol)	1081	2.075	1.87

RT-qPCR实验方法

cDNA的合成应用宝生物公司的PrimescriptII第一条链cDNA合成试剂盒进行，步骤如下：

①按照如下反应体系将各组分添加到无RNA酶的PCR管中

随机引物(50mM)1μL；dNTP 1μL；总RNAXμL；无RNA酶蒸馏水补足至10μL。

②将上述反应混合液放置于PCR仪上进行变性退火反应。反应条件为：65℃5min；冰上急冷2min。

③向上述变性后反应液中加入5*PrimeScript Buffer4μL，无RNA酶水5μL，Primescript RTase(200U/Μ)1μL。此时总反应体积为20μL。

④将上述反应液放置于PCR仪中进行cDNA的合成。反应条件为：30℃10min；42℃1h；70℃15min；4℃保存。

qPCR方法:

引物设计

本研究中应用PrimerPremier5.0软件进行引物搜索，qPCR扩增片段长度一般为100-300bp，引物长度为18-22bp之间。然后应用Oligo软件对搜索到的引物进行评估和微调，得到qPCR引物。应用于qPCR的引物要求非常严格，在设计过程中需要严格保证不存在高于正常扩增效率三分之一的错赔率，确保引物内不存在发夹结构、确保引物内及引物间不会形成稳定的二聚体结构。应用于反转录定量PCR的引物见表2。

表2应用于反转录定量PCR的引物

qPCR引物质量检测

qPCR引物设计完成后需要对引物进行质量检测，质量检测合格的引物方可用于qPCR实验。引物的质量检测采取荧光定量PCR检测方法。

定量PCR的反应体系如表3所示：

表3qPCR引物的定量PCR检测反应体系

反应条件为：95℃3min；(95℃10s；55℃30s；72℃30s；80℃10s)；由95℃开始每10s降低0.5℃经81个循环后降到55℃；括号中反应程序进行40个循环，分别在72℃及80℃时采集荧光信号。

定量PCR检测时扩增效率为90％-105％之间，且产物峰单一的引物被应用于后续的基因表达定量实验。以果糖1，6-2磷酸化酶基因fbp(AKI40_4472)的qPCR引物设计为例，由图3可以看出，该引物扩增效率为102.1％，满足qPCR分析要求。图4为溶解曲线，分析显示，该引物经qPCR扩增后的产物单一，特异性高，满足qPCR实验分析要求。

相对定量PCR实验方法

①将反转录合成的cDNA进行10倍稀释。

②以稀释后的cDNA作为模板，配制不含引物的定量PCR反应体系(定量PCR反应体系参考qPCR引物质量定量PCR检测体系)。按照每管19μL将配制好的PCR反应体系分装到八联管中。

③向分装好的反应体系中加入相对应的引物，每对引物需做三个平行，且同一个样品在每轮定量PCR中必须带有内参基因以保证内参基因与目的基因的扩增条件一致。

④盖上八联管盖子，轻弹混匀并瞬时离心保证PCR反应体系全部位于管底。

⑤将离心好的八联管置于定量PCR仪中，设置反应条件进行定量PCR扩增。

⑥扩增结束后根据仪器给出的目的基因与内参基因的CT值及相对定量ΔΔCt法计算分析目的基因在不同碳源条件下的表达差异。

应用相对定量PCR的方法，我们对分别以甘油或者葡萄糖作为碳源条件下糖异生途径关键基因果糖-1，6-2磷酸化酶基因拷贝进行了分析。三个编码基因在不同碳源存在条件下表达分析结果见图5。

基因工程菌株构建靶点的选择

对甘油或者葡萄糖作为碳源进行相对定量分析的目的是分析不同碳源条件下细菌纤维素合成机制的差异，以期找出构建甘油条件下不产细菌纤维素而在葡萄糖条件下合成细菌纤维素工程菌株的构建靶点。这种工程菌株能够解决Enterobactersp.FY-07用于油藏调剖的注入问题和深部调剖问题。通过相对定量分析，我们选取果糖1,6-二磷酸化酶作为基因敲除的靶点。选择原因为：1、该步骤为糖异生途径中的不可逆步骤，敲除之后甘油基本无法通过糖异生合成葡萄糖前体进而无法合成细菌纤维素；2、葡萄糖前体也是肽聚糖，脂多糖等菌体所必须成分的合成前体，故不可以完全阻断糖异生途径，而Enterobactersp.FY-07基因组中预测到编码果糖1,6-二磷酸化酶的基因有三个。敲除其中之一理论上不会严重影响细胞正常生长，因此我们选择表达量较高的AKI_4472拷贝进行敲除。

实施例2

基因敲除载体的构建

以阴沟肠杆菌FY-07基因组为模板，应用Fpg1u，Fpg1l引物对和Fpg3u，Fpg3l引物对扩增目标敲除基因的上下游同源臂，应用Fpg2u，Fpg2l引物对以pGFP质粒为模板扩增绿色荧光蛋白基因。应用Fpgnu和Fgnl引物对及重叠PCR的方法将上下游同源臂及绿色荧光蛋白基因连接成单一PCR产物Fpg。Fpg片段用EcoRI、XbaI进行双酶切，pTSK1用同样的酶双切。两酶切产物以T4DNALigase进行连接，转化进入E.coli DH5α感受态细胞，获得基因敲除载体pTSFPG，该实施例中应用到的引物如表4所示。

表4基因敲除载体及基因敲除菌株构建过程中的引物信息

基因敲除载体的构建原理：

敲除载体的构建采取的方法是：利用重叠PCR的方法将待敲除基因的上下游同源臂融合起来，通过酶切连接的方法连接到敲除质粒pTSK1上，经转化筛选后得到含有基因敲除载体的转化子。基因敲除载体的构建原理图见图6。

基因敲除载体构建引物设计思路：

Fpg1u,Fpg1l引物对，Fpg3u,Fpg3l是根据待敲除基因AKI40_4472基因的上下游同源臂设计，Fpg2u，Fpg2l引物对是根据绿色荧光蛋白基因序列设计。其中，为了这三段片段可通过重叠PCR的方法连到一起，Fpg1l与Fpg2u，Fpg2l与Fpg3u分别有长度约为20bp的互补序列。Fpgnu，Fpgnl引物对是将三段序列连接到一起时应用的引物序列，特点是序列较长，增加引物配对效率，含有酶切位点和保护碱基，方便通过酶切连接到基因敲除质粒上。

基因敲除载体的构建过程

以阴沟肠杆菌FY-07基因组为模板，应用Fpg1u，Fpg1l引物对和Fpg3u，Fpg3l引物对扩增目标敲除基因的上下游同源臂，应用Fpg2u，Fpg2l引物对以pGFP质粒为模板扩增绿色荧光蛋白基因。PCR体系及扩增条件如表5所示：

表5PCR体系

组分	体积(μL)	备注
			PrimerstarPol	12.5
20pmol/μL上游引物	0.5
			20pmol/μL下游引物	0.5
基因组	1.00	100-300ng/μL基因组DNA
			ddH<sub>2</sub>O	Upto25.00

PCR反应条件：

通过pcr扩增待敲除基因的上下游同源臂，并通过pcr清洁试剂盒纯化目的片段纯化后的目的片段应用重叠PCR，采用PrimerstarPol聚合酶进行搭桥。PCR反应体系与反应条件如表6所示。

表6PCR体系

组分	体积(μL)	备注
			PrimerstarPol	12.5
上游同源臂上游引物	0.5	20pmol/μL(后加)
			下游同源臂下游引物	0.5	20pmol/μL(后加)
上游片段	XμL	100-200ng
			下游片段	YμL	100-200ng
ddH2O	Up to25.00

PCR反应条件：

加入上下游引物

通过DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

对搭桥得到的目的片段进行酶切，敲除质粒pTSK1也经同样的限制性内切酶酶切处理。对酶切后的质粒片段和目的片段进行纯化，并测定纯化后片段的浓度。

对搭桥得到的目的片段进行酶切，敲除质粒pTSK1也经同样的限制性内切酶酶切处理。对酶切后的质粒片段和目的片段进行纯化，并测定纯化后片段的浓度；

根据浓度计算连接体系，将连接体系中的各组分依次加入PCR管中，置于16℃恒温金属浴中过夜连接；

将过夜连接产物加入到E.coli S17感受态细胞中进行热激转化及复苏。将复苏后的菌体离心涂布于含有Amp的LB平板上，30℃恒温培养至长出转化子；

挑取转化子，转入含有Amp的5mL LB液体培养基中，30℃培养过

夜，进行菌液PCR检测，检测引物为上下游同源臂的扩增引物。

经检测，同时含有上游及下游同源臂的转化子为构建成功的基因敲除载体。将转化子进行菌液保藏及用于后续基因敲除实验。

实施例3

基因工程菌株的构建

通过接合转移将基因工程载体转移进入阴沟肠杆菌FY-07。正确的转化子具有羧苄青霉素和四环素抗性，并用以pTSK1骨架为模板设计的引物进行PCR验证。将筛选正确的转化子在无选择性压力的条件下42℃培养过夜。将过夜培养物稀释涂布于含有四环素抗性的LB平板。应用Fpgk1u和Fpgk1l引物对以及Fpgk2u和Fpgk2l引物对对LB平板上生长的单菌落进行菌落PCR验证筛选单交换转化子。将单交换转化子在无选择性压力条件下传代，并稀释涂布与含有10％蔗糖的LB平板。再次应用Fpgk1u和Fpgk1l引物对以及Fpgk2u和Fpgk2l引物对蔗糖LB平板上的单菌落进行菌落PCR验证筛选双交换得到基因工程菌株FY-0701.本实施例中应用到的引物信息如表5所示。该基因工程菌株的保藏编号为：CGMCC No.15619。

接合转移的具体步骤：

①将含有相应质粒的供体菌E.coli S17和Enterobacter sp.FY-07分别接种于含有相应抗生素的5mL LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。(培养Enterobacter sp.FY-07时需加入纤维素酶)

②将过夜培养的菌液转入5mL离心管中，5000r/min离心10min，弃上清收集菌体。

③加入2mL 10mM的无菌硫酸镁溶液重悬菌体，5000r/min离心10min，弃掉上清。重复此步骤1次。

④分别向供体菌和受体菌菌体沉淀中加入200μL 10mM的无菌硫酸镁，吹悬均匀，将两种菌按比例混合并加入一定量的纤维素酶，将混合物接种于放置在LB平板培养基上的滤膜中央，静置30min待菌液被滤膜和培养基吸收，放入30℃恒温培养箱中静置培养24h。

⑤用200μL 10mM的无菌硫酸镁洗下滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有相应抗生素的双抗平板，30℃静置培养直至平板上长出转化子。

⑥挑取转化子，接种于含有相对应的两种抗生素和纤维素酶的5mL的LB液体培养基中，30℃200r/min振荡培养至OD600nm＞1.0。

⑦通过菌液PCR的方法验证转化子，将验证正确的转化子保藏备用。

注：受体菌Enterobacter sp.FY-07,羧苄青霉素抗性。当供体菌E.coli S17含有pTSK1衍生质粒时，带有氨苄青霉素，四环素，链霉素抗性，与受体菌进行接合转移时，双抗平板为四环素和羧苄青霉素抗性平板；当供体菌E.coli S17含有pBBR1MCS2衍生质粒时，带有氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素抗性，与受体菌进行接合转移时，双抗平板为卡那霉素和羧苄青霉素抗性平板；此外，接合转移在必要时需要做阴性阳性对照，同时将E.coli S17涂布于含四环素或卡那霉素的平板上，将Enterobacter sp.FY-07涂布于含羧苄青霉素的平板上作为阳性对照；再将这两种菌液分别涂布于同时含四环素或卡那霉素和羧苄青霉素的双抗平板培养基上作为阴性对照。

基因敲除及筛选方法如下：

①利用接合转移将构建好的基因敲除载体转移到待敲除菌株Enterobactersp.FY-07中，在Car和Tet双抗平板上筛选转化子，挑取转化子进行菌液PCR筛选正确转化子。菌液PCR扩增的是敲除载体质粒骨架上的片段。

②将检测正确的转化子按照1％的接种量接种于含有纤维素酶的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。在此过程中，敲除载体因其含有温度敏感型复制区而进行缓慢丢失。

③将上述培养液进行梯度稀释涂布于含有Tet的LB固体平板培养基上，置于42℃恒温培养箱中倒置培养至长出单菌落。在平板上能够生长的单菌落理论上应全部为单交换突变子。

④挑取平板上的单菌落，接种于含有纤维素酶以及Tet的5mL LB液体培养基中，30℃200r/min振荡培养过夜。菌液PCR筛选正确的单交换突变子。分别以Fpgk1u/Fpgk1l和Fpgk2u/Fpgk2l为引物对进行菌液PCR。能PCR扩增出其中一条目的片段的为单交换转化子。

⑤将鉴定正确的单交换菌株按照1％接种量接种于含有纤维素酶的5mL的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。在此过程中单交换菌株要么维持单交换状态不变，要么进行二次交换形成野生型或者双交换菌株。

⑥将培养液梯度稀释涂布于含有5-10％蔗糖的LB固体平板上，42℃静置培养至长出单菌落。因敲除载体上含有蔗糖致死基因sacB，理论上能在蔗糖平板上长出的单菌落只能是野生株或者双交换菌株。

⑦挑取蔗糖平板上的单菌落至含有纤维素酶的5mL的LB液体培养基中，培养过夜后进行菌液PCR筛选双交换菌株。当应用Fpgk1u/Fpgk1l和Fpgk2u/Fpgk2l引物对均能扩增出目的片段且应用Fpgk1u/Fpgk2l扩增得到的目的片段大小与野生型片段大小减去敲除基因的片段大小之后的数据相符时即为双交换基因敲除突变株。

⑧应用扫描电子显微镜技术检测Enterobacter sp.FY-07野生型菌株及基因敲除菌株Enterobacter sp.FY-0701在葡萄糖或甘油作为碳源条件下的纤维素产生情况，检测结果如图7所示，Enterobacter sp.FY-07野生型菌株在葡萄糖或者甘油作为碳源条件下均能产生纤维素，而基因工程菌株Enterobacter sp.FY-0701在葡萄糖作为碳源条件下可产生细菌纤维素，而在甘油作为碳源条件下不能产生细菌纤维素。

实施例4

岩心驱替实验

在本发明中，Enterobacter sp.FY-07和基因工程菌株产生BC对于深层调剖和选择性封堵的效果通过岩心驱替实验评价。微生物调剖岩心驱替试验模式图如图8所示。人造岩心的具体信息见表7。岩心***金属岩心夹持器并在抽真空后饱和七中区原油注入水。孔隙体积通过浸透水的体积计算。然后用油田注入水驱替饱和的岩心直到压力稳定，计算渗透率，微生物调剖岩心驱替试验水驱压力和封堵率见图9。一个高渗透岩心和一个低渗透岩心并列连接以模拟油藏的异质性。随后，菌液和以葡萄糖为唯一碳源的发酵培养基注入到岩心中30℃培养3天，菌液中菌含量为10⁶cfu/ml。为了评价不同注入方式的效果，使用两种注入方案，即菌液和发酵培养基分别注入或同时注入。注入方案的细节如表8所示。孵育后，用相同的油田注入水驱替岩心直到压力稳定。驱动速率为1mL/min。记录压力值以检测细菌处理前(Pbefore)后(Pafter)的渗透率，用渗透率通过公式R＝(1-Pbefore/Pafter)*100％计算封堵率。通过计算封堵率发现基因工程菌株与野生株在两种注入模式下封堵率均能达到80％以上，均具有较高的封堵率，均可应用与微生物封堵提高原油采收率。

表7用于岩心驱替实验的人工岩心参数

表8应用于岩心驱替实验的岩心连接方式，菌悬液和发酵培养基的注入模式

连接方式	注入模式	菌株
			岩心-A&岩心-B(并列)	0.5PvBS<sup>1</sup>+1PvFM<sup>2</sup>+0.5PvDW<sup>3</sup>	基因工程菌株
岩心-C&岩心-D(并列)	1PvBFM<sup>4</sup>+1PvDW<sup>3</sup>	基因工程菌株
			岩心-E&岩心-F(并列)	0.5PvBS<sup>1</sup>+1PvFM<sup>2</sup>+0.5PvDW<sup>3</sup>	野生株
岩心-G&岩心-H(并列)	1PvBFM<sup>1</sup>+1PvDW<sup>3</sup>	野生株

BS¹:菌悬液,细菌种子液经由灭菌蒸馏水稀释至终浓度为4％。

FM²:发酵培养基且以葡萄糖为碳源。

DW³:灭菌蒸馏水。

BFM⁴:细菌种子液经由发酵培养基稀释至终浓度为2％。

实施例5

岩心各部细菌定量分析

为了评价深层调剖能力，应用DNA提取及实时荧光定量PCR来测定岩心前端、中端和岩心后端的菌浓。在DNA提取过程中，岩心样品被碾成粉末，应用Li et al(2014)的方法提取样品总基因组DNA。具体细节为：用TE缓冲液(Tris 80mM,EDTA40mM,pH 8.0)重悬碾碎的样品，然后加入玻璃珠并在室温下用小型研磨机(BioSpec,Bartlesville,OK)200转研磨1分钟。然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒(Axygen Biosciences,Union City,CA)提取基因组DNA并应用Bio-drop纳米分光光度计测定DNA的浓度和完整性。Real-time qPCR使用Bio-rad iQ5real-time PCR检测***检测并分析。qPCR中用到的引物列于表2中。16s rRNA基因作为2-ΔΔCT中标准化RNA表达的内参基因。R值的误差(ΔR)通过Bio-rad qPCRiQ5的程序计算。

应用荧光定量PCR检测到的各岩芯菌浓分布情况如图10。由图可以看出，当应用基因工程菌株进行调剖时，不论菌液和培养基分别注入或者同时注入，岩芯各部位的菌浓均为后端菌浓高于中端菌浓高于前端菌浓，这说明应用基因工程菌株进行调剖时可以达到深层调剖的效果。而应用野生型菌株进行调剖时，当菌液和培养基分别注入时，岩芯各部位的菌浓均为中端菌浓高于后端菌浓高于前端菌浓，这说明应用野生型菌株菌液和培养基分别注入进行调剖时，未能达到深层调剖的效果。当应用野生型菌株进行调剖，菌液和培养基同时注入时，岩心各部位的菌浓为后端菌浓高于中端菌浓高于前端菌浓，但总体菌浓均低于基因敲除菌株应用相同注入方法时的菌浓，这也可能是应用野生型菌株培养基和菌液同时注入调剖效果较差的原因。分析原因可能是野生型菌株发酵液培养过程中为了尽可能接近油藏现场调剖情况，在发酵过程中未添加纤维素酶和玻璃珠，发酵好的发酵液中含有细菌纤维素团块，这些细菌纤维素团块会聚集沉淀，而菌液注入时采用的活塞式中间容器只能将上清注入岩芯，导致菌浓降低。

实施例6：扫描电子显微镜观察

本发明应用扫描电子显微镜(SEM)观察Enterobacter sp.FY-07和基因工程菌株Enterobacter sp.FY-0701在以葡萄糖或甘油为唯一碳源时的BC产生能力。选择性封堵的情况也通过SEM观察分析。为了检测Enterobactersp.FY-07和基因工程菌株Enterobactersp.FY-0701的纤维素产生能力，将在琼脂发酵培养基上的菌落连同培养基一起切下(≈0.3cm*0.3cm)。为了分析选择性封堵的情况，将岩心平均切开分为前端、中端和后端。样品用2.5％戊二醛4℃固定12小时。然后，去除上清，用0.1M PBS清洗15分钟，重复3次。然后用浓度梯度从30％到90％提高的乙醇清洗15min。之后用100％乙醇清洗10分钟，重复2次。去除乙醇上清，残留的乙醇在室温挥发。应用真空冷冻干燥机将冷冻后的样品脱水。将脱水后的样品置于扫描电子显微镜载物台上并用离子溅射设备喷金。处理后的样品连同载物台一起置于扫描电子显微镜中，抽真空，电子轰击下观察。电子束的加速电压为15kV。扫描电子显微镜观察结果如图11和图12所示。当应用基因工程菌株调剖时(图11)，岩芯后端可见众多纤维素丝状网络结构，明显多于中端，而中端又明显多于前端，这与定量结果一致。当野生型菌株用于调剖时(图12)，岩芯中端的丝状网络结构明显多于后端和前端，与实例6中细菌定量结果一致。细菌定量和扫描电子显微镜观察结果均显示，与野生型菌株相比，基因工程菌株更适用于深层调剖

由以上实施例可以得出，本发明提供的一株阴沟肠杆菌FY-0701，较野生型菌株相比，能够达到深层调剖的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一株阴沟肠杆菌FY-0701以及其构建方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcaacctg ccatggaat 19

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaaaggtgc agaaatccgt gtacttaaac agctcgcacc gtaacag 47

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatggctacg atggcgacat gccggaaaga agagaaaacg 40

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaaaatcg gtcaagatga tt 22

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgttacggt gcgagctgtt taagtacacg gatttctgca cctttta 47

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgttttctct tctttccggc atgtcgccat cgtagccatt 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgccagccca tccagcagtt tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccaccccggt gaacagctcc tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caaccactac ctgagcaccc ag 22

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtgagcggc attggagtgt at 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgacgaattc tgcaacctgc catggaatat gctgcggttg 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatctctaga ccgaaatcac cgaaggcgaa aaatccctca c 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgggtgaact gactgctttg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgatgttgga agagccatcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgctatggg tcaggcaaat 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggcatcgtg gcgaggtt 18

Claims

1.一株阴沟肠杆菌FY-0701，该阴沟肠杆菌FY-0701的保藏编号为CGMCC No.15619；所述阴沟肠杆菌FY-0701在甘油存在的条件下不产生细菌纤维素。

2.权利要求1所述的阴沟肠杆菌FY-0701在原油采收中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述阴沟肠杆菌FY-0701作为深层调剖剂。