CN109105905B - 一种多肽保健品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽保健品及其制备方法，属于保健品技术领域。本发明采用鲍鱼作为原料，通过除脂、酶解、电渗析纯化、纳滤浓缩的方法，得到了具有较高的提高免疫活力、抗疲劳作用的酶解多肽，并且通过该方法得到的多肽保健品，富集了原料中的锌，并显著降低了钠盐含量，进一步提高了其保健功效。

Description

一种多肽保健品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种多肽保健品及其制备方法，属于保健品技术领域。
背景技术
科学研究发现生物体内存在多种具有生理活性的多肽物质，它们具有不同的结构和功能活性。人体摄入的蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。几乎所有细胞都受多肽调节。它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。人们己从包括人、植物、动物在内的各种生物体中分离出各类活性多肽，并且对多肽的性质、制备方法、分离纯化方法、鉴定技术、功能活性及应用等方面进行了大量的研究，并取得了一定的成效。科学发现几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切
相关，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。由于多肽具有调节植物神经***、活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性。这为开发肽药物、肽类保健食品提供了理论依据。
专利CN103255186A披露了一种鲍鱼多糖、脂质和蛋白肽的联产制备方法，技术工艺包括以鲍鱼内脏为原料，通过复合酶解、膜分离、醇沉、离心分离、冷冻结晶、脱色、干燥等手段提取制备鲍鱼多糖、脂质和蛋白肽。但是上述方法中，实质性地没有对鲍鱼多肽进行提纯，导致了这种方法得到的多肽中仍然含有脂肪、盐类、多糖等杂质，使得该多肽存在着功效不高、盐类摄入量提高等问题。
鲍鱼中含有一定量的锌，服用后具有保健作用，然而，却含有更多的钠离子、含盐量高，也就导致了过多服用会导致盐的摄入量高，容易产生高血压的风险。据报道，每100g的鲍鱼中含有0.4mg的锌，但是却含有2011mg的钠[1]。因此，在生产鲍鱼多肽时，需要考虑上述技术问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种采用鲍鱼作为原料、并经过酶解方法得到的鲍鱼多肽，这种多肽具有较高的提高免疫活力、抗疲劳作用的酶解多肽，可以应用于制备保健品，另外，本发明的方法可以克服鲍鱼中Na+和Zn2+的浓度倒挂的问题，得到的多肽粉应用于保健品中具有提高免疫力。
技术方案是：
本发明的第一个方面，提供了：
一种多肽保健品，其中包含有鲍鱼酶解多肽。
进一步地，所述的多肽保健品是片剂。
进一步地，所述的片剂中包含有按重量份计的鲍鱼酶解多肽180～200份、填充剂320～350份、崩解剂120～150份、润滑剂15～20份、香精0.1～0.3份。
进一步地，所述的填充剂是微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或几种的混合。
进一步地，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或几种的混合。
进一步地，所述的润滑剂是硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅中的一种或几种的混合。
本发明的第二个方面，提供了：
上述的多肽保健品的制备方法，包括如下步骤：
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10～15混合，并加入蛋白酶进行酶解处理，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5～8：1混合，进行萃取除脂肪；
第4步，对第3步得到的萃余液采用吸附脱色处理；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，去除Na+；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
进一步地，第2步中所述的蛋白酶选自菠萝蛋白酶、胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶中的一种或几种的混合，加酶量是4000～6000U/g底物；酶解过程温度是40～50℃，酶解时间是1～3h。
进一步地，第3步中的萃取温度是20～30℃，萃取时间是20～30min。
进一步地，第4步中的吸附脱色采用的是活性炭或者多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2～5wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5～1h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160～165℃下热处理0.5～1h；步骤b，配制含有10～12wt%步骤a得到的硅藻土、4～6wt%十二烷基三甲基溴化铵、40～45wt%乙醇的水溶液，于35～40℃搅拌0.5～1h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20～25份，聚醚砜15～20份、二甲基乙酰胺160～200份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有5～8wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4～6，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；超滤膜（4）的截留分子量是10～20万Da。
进一步地，第5步中的超滤膜的截留分子量是10～20万Da；超滤过程压力是0.2～0.5Mpa，超滤温度是25～35℃。
进一步地，第6步中的电渗析处理的电流密度为25～40A/m2。
进一步地，第7步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200～800Da；纳滤过程的压力是1.0～2.0Mpa，超滤温度是25～35℃。
本发明的第三个方面，提供了：
上述多肽保健品的生产装置，包括：
酶解罐，用于对鲍鱼进行酶解处理；
萃取罐，连接于酶解罐，用于对酶解液进行萃取除脂肪；
石油醚加入罐，连接于萃取罐，用于向萃取罐中加入石油醚萃取剂；
吸附柱，连接于萃取罐，用于对萃余液进行吸附脱色处理；
超滤膜，连接于吸附柱，用于吸附处理后的料液进行超滤除杂处理；
一价盐选择透过性电渗析膜，连接于超滤膜的渗透侧，用于对超滤膜4的渗透液进行除Na+处理；
纳滤膜，连接于一价盐选择透过性电渗析膜的淡液侧，用于对一价盐选择透过性电渗析膜中得到的除Na+料液进行纳滤处理，使多肽和Zn2+浓缩且使Na+透过；
喷雾干燥器，连接于纳滤膜，用于对纳滤膜的浓缩液进行喷雾干燥处理，得到多肽。
进一步地，吸附柱中装填的是活性炭或者多糖-聚醚砜双改性的硅藻土。
进一步地，超滤膜的截留分子量是10～20万Da。
进一步地，一价盐选择透过性电渗析膜的材质选自聚醚酮、聚醚砜或者聚苯胺。
进一步地，纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200～800Da。
有益效果
本发明采用鲍鱼作为原料，通过除脂、酶解、电渗析纯化、纳滤浓缩的方法，得到了具有较高的提高免疫活力、抗疲劳作用的酶解多肽，并且通过该方法得到的多肽保健品，富集了原料中的锌，并显著降低了钠盐含量，进一步提高了其保健功效。
附图说明
图1是本发明的制备流程图；
图2是本发明的制备装置图；
图3是本发明制备得到的多肽的排阻色谱法测定鲍鱼多肽的图谱。
其中，1、酶解罐；2、萃取罐；3、吸附柱；4、超滤膜；5、一价盐选择透过性电渗析膜；6、纳滤膜；7、喷雾干燥器；8、石油醚加入罐。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文使用的词语“包括”、“包含”、“具有”或其任何其他变体意欲 涵盖非排它性的包括。例如，包括列出要素的工艺、方法、物品或设 备不必受限于那些要素，而是可以包括其他没有明确列出或属于这种 工艺、方法、物品或设备固有的要素。
本发明提供了一种以鲍鱼酶解多肽作为主要活性物质的保健品，采用鲍鱼的内脏作为原料，经过脱脂肪、脱色、超滤、电渗析、纳滤工艺对其进行处理，得到纯度高、活性高的多肽。
以上的酶解多肽的制备中，步骤中的第1步是对鲍鱼肉进行预处理，这里的鲍鱼肉即鲍鱼的内脏，采用常规的方法进行清洗，并用食物破碎机打碎成肉泥。
得到肉泥之后，与水混合成混悬液，进行酶解处理，这里的酶解处理优选采用菠萝蛋白酶，其具有较好的酶解活性，加酶量是4000～6000U/g底物；酶解过程温度是40～50℃，酶解时间是1～3h；酶解之后，去除掉底部的残渣得到酶解液。
酶解液中会含有较多的酶解多肽，也会含有脂肪，本发明采用的方法是采用石油醚萃取的方法对酶解液进行萃取处理，使脂肪被石油醚萃取除去，萃余液中为主要含有多肽、多糖以及其它的大分子杂质，萃取温度是20～30℃，萃取时间是20～30min。
对萃余液需要进行吸附处理，可以除去一部分杂质，也可以吸附除去色素、多糖等。这里所用的吸附剂可以是活性炭，也可以是采用多糖-聚醚砜改性的硅藻土，这种吸附剂表现出更好地对多糖、色素的选择分离性，并可以减少对多肽的吸附，使分离选择性更好。
超滤处理的目的是去除掉酶解液中的胶体杂质、带入的吸附剂颗粒、大分子的低活性蛋白质，并使小分子多肽透过超滤膜，吸附脱色采用的是活性炭或者多糖-聚醚砜双改性的硅藻土，其中采用的多糖-聚醚砜双改性的硅藻土通过表面改性处理后，对于多肽和多糖杂质的选择性更高，得到的多肽的纯度好；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2～5wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5～1h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160～165℃下热处理0.5～1h；步骤b，配制含有10～12wt%步骤a得到的硅藻土、4～6wt%十二烷基三甲基溴化铵、40～45wt%乙醇的水溶液，于35～40℃搅拌0.5～1h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20～25份，聚醚砜15～20份、二甲基乙酰胺160～200份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有5～8wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4～6，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；超滤膜的截留分子量是10～20万Da。
由于本发明中采用的鲍鱼的二价离子和一价离子存在着浓度倒挂，Na+的浓度较高，而Zn2+的浓度较低，因此，本发明采用了一价盐选择透过性电渗析对超滤透过液进行处理，这里的一价盐选择透过性电渗析在电场的作用下，只会使一价盐透过膜层，而二价盐不会透过，并且不带电荷的多肽也不会被移除，就能够在保证多肽不损失的情况下减小Na+的浓度。本发明中所采用的一价盐选择透过性电渗析膜，其材质可以为聚醚酮[2]、聚醚砜[3]或者聚苯胺[4] ，电渗析处理的电流密度为25～40A/m2。
在进行一价盐选择透过性电渗析操作之后，得到的淡液再用纳滤膜进行分离处理，纳滤膜具有对二价盐和多肽的截留率，同时可以使一价盐以及一些小分子杂质例如多糖的透过，可以提高多肽的纯度，并减小多肽产品中的含盐量。如果纳滤处理的料液中的Na+的浓度过高时，一方面会导致膜孔的增大，使多肽的截留率下降，另一方面，由于纳滤膜是电荷膜，当截留侧的Na+的浓度过高时，纳滤膜的Donnan效应会迫使更多的二价盐Zn2+透过膜层进入渗透侧，以维持住膜两侧的电荷平衡[5]。因此，上述的一价盐选择透过性电渗析的操作可以在不损失多肽和锌的情况下，减小钠离子浓度，就能够与纳滤膜之间形成协同效果，提高纳滤膜对多肽和锌的截留率，纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200～800Da；纳滤过程的压力是1.0～2.0Mpa，超滤温度是25～35℃。
在纳滤对酶解液进行浓缩、纯化处理之后，通过常规的喷雾干燥的方法即可得到多肽。
本发明中，可以采用常规的方法将多肽制备在保健品制剂中，例如：片剂、胶囊剂、颗粒剂等。
本发明的一个优选的配方是片剂。片剂中包含有按重量份计的鲍鱼酶解多肽180～200份、填充剂320～350份、崩解剂120～150份、润滑剂15～20份、香精0.1～0.3份。填充剂是微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或几种的混合。崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或几种的混合。润滑剂是硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅中的一种或几种的混合。
另外，本发明还提供了上述的鲍鱼酶解多肽在用于制备抗疲劳或者提高免疫力的制剂中的用途。
基于以上的方法，本发明提供的制备装置如图2所示包括：
酶解罐1，用于对鲍鱼进行酶解处理；
萃取罐2，连接于酶解罐1，用于对酶解液进行萃取除脂肪；
石油醚加入罐8，连接于萃取罐2，用于向萃取罐2中加入石油醚萃取剂；
吸附柱3，连接于萃取罐2，用于对萃余液进行吸附脱色处理；
超滤膜4，连接于吸附柱3，用于吸附处理后的料液进行超滤除杂处理；
一价盐选择透过性电渗析膜5，连接于超滤膜4的渗透侧，用于对超滤膜4的渗透液进行除Na+处理；
纳滤膜6，连接于一价盐选择透过性电渗析膜5的淡液侧，用于对一价盐选择透过性电渗析膜5中得到的除Na+料液进行纳滤处理，使多肽和Zn2+浓缩且使Na+透过；
喷雾干燥器7，连接于纳滤膜6，用于对纳滤膜6的浓缩液进行喷雾干燥处理，得到多肽。
进一步地，吸附柱3中装填的是活性炭或者多糖-聚醚砜双改性的硅藻土。
进一步地，超滤膜4的截留分子量是10～20万Da。
进一步地，一价盐选择透过性电渗析膜5的材质选自聚醚酮、聚醚砜或者聚苯胺。
进一步地，纳滤膜6的材质是聚酰胺，截留分子量是200～800Da。
参考文献：
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实施例1 鲍鱼酶解多肽的制备
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10混合，并加入4000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是40℃，酶解时间是1h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是20℃，萃取时间是20min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用活性炭吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是10万Da；超滤过程压力是0.2Mpa，超滤温度是25℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为25A/m2；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200Da；纳滤过程的压力是1.0Mpa，超滤温度是25℃；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
实施例2 鲍鱼酶解多肽的制备
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1： 15混合，并加入6000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是50℃，酶解时间是3h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比8：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是30℃，萃取时间是30min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用活性炭吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是20万Da；超滤过程压力是0.5Mpa，超滤温度是35℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为40A/m2；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是800Da；纳滤过程的压力是2.0Mpa，超滤温度是35℃；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
实施例3鲍鱼酶解多肽的制备
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10混合，并加入4000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是40℃，酶解时间是1h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是20℃，萃取时间是20min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用多糖-聚醚砜双改性的硅藻土吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160℃下热处理0.5h；步骤b，配制含有10wt%步骤a得到的硅藻土、4wt%十二烷基三甲基溴化铵、40wt%乙醇的水溶液，于35℃搅拌0.5h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20份，聚醚砜15份、二甲基乙酰胺160份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有5wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是10万Da；超滤过程压力是0.2Mpa，超滤温度是25℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为25A/m2；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200Da；纳滤过程的压力是1.0Mpa，超滤温度是25℃；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
实施例4鲍鱼酶解多肽的制备
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：15混合，并加入6000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是50℃，酶解时间是3h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比8：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是30℃，萃取时间是30min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用多糖-聚醚砜双改性的硅藻土吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为5wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为1h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于165℃下热处理1h；步骤b，配制含有12wt%步骤a得到的硅藻土、6wt%十二烷基三甲基溴化铵、45wt%乙醇的水溶液，于40℃搅拌1h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土25份，聚醚砜20份、二甲基乙酰胺200份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有8wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：6，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是20万Da；超滤过程压力是0.5Mpa，超滤温度是35℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为40A/m2；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是800Da；纳滤过程的压力是2.0Mpa，超滤温度是35℃；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
实施例5 片剂的制备
取实施例2中制备得到的鲍鱼酶解多肽200g、乳糖350g，羟甲基纤维素钠120g～硬脂酸镁15g、桔子香精0.2份，混合均匀，用压力为10吨的压片机进行压片，压片灭菌后密封保存。
实施例6 片剂的制备
取实施例4中制备得到的鲍鱼酶解多肽180g、乳糖320g，羟甲基纤维素钠150g、硬脂酸镁20g、桔子香精0.2份，混合均匀，用压力为12吨的压片机进行压片，压片灭菌后密封保存。
对照例1
与实施例3的区别是：未对超滤渗透液采用一价盐选择透过性电渗析处理。
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10混合，并加入4000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是40℃，酶解时间是1h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是20℃，萃取时间是20min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用多糖-聚醚砜双改性的硅藻土吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160℃下热处理0.5h；步骤b，配制含有10wt%步骤a得到的硅藻土、4wt%十二烷基三甲基溴化铵、40wt%乙醇的水溶液，于35℃搅拌0.5h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20份，聚醚砜15份、二甲基乙酰胺160份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有5wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是10万Da；超滤过程压力是0.2Mpa，超滤温度是25℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200Da；纳滤过程的压力是1.0Mpa，超滤温度是25℃；
第7步，对第6步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
对照例2
与实施例3的区别是：萃余液未经过吸附脱色处理。
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10混合，并加入4000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是40℃，酶解时间是1h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是20℃，萃取时间是20min；
第4步，对第3步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是10万Da；超滤过程压力是0.2Mpa，超滤温度是25℃；
第5步，对第4步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为25A/m2；
第6步，对第5步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200Da；纳滤过程的压力是1.0Mpa，超滤温度是25℃；
第7步，对第6步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
对照例3
与实施例3的区别是：硅藻土微球吸附剂未经过多糖表面改性处理。
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10混合，并加入4000U/g底物菠萝蛋白酶进行酶解处理，酶解过程温度是40℃，酶解时间是1h，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5：1混合，进行萃取除脂肪，萃取温度是20℃，萃取时间是20min；
第4步，对第3步得到的萃余液采用聚醚砜改性的硅藻土吸附脱色处理，萃余液的水力停留时间是40min，吸附温度是30℃；多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2wt%的盐酸将硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160℃下热处理0.5h；步骤b，配制含有10wt%步骤a得到的硅藻土、4wt%十二烷基三甲基溴化铵、40wt%乙醇的水溶液，于35℃搅拌0.5h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20份，聚醚砜15份、二甲基乙酰胺160份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至水中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到聚醚砜改性的硅藻土；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂，超滤膜的截留分子量是10万Da；超滤过程压力是0.2Mpa，超滤温度是25℃；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，使Na+的浓度下降约40%，电渗析处理的电流密度为25A/m2；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理，浓缩倍数是4倍，第6步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200Da；纳滤过程的压力是1.0Mpa，超滤温度是25℃；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到酶解多肽。
对照例4
采用现有技术CN103255186A中的鲍鱼多肽的酶解提取方法。
将鲍鱼内脏清洗干净后，按照固液比1：1混合，再调节pH至8.5，在2000g的混合液中加入胰蛋白酶10g和胶原蛋白酶10g，于50℃下酶解6h，再调节pH至5，加入菠萝蛋白酶5g，50℃下酶解3h，过滤除不溶物，将过滤的滤液采用截留分子量20000的超滤膜进行过滤，滤液调节pH至6.0，加入活性炭于35℃下处理15min，再经过离子交换树脂柱脱色处理，透过液喷雾干燥和，得到鲍鱼多肽。
多肽活性试验
1.小鼠负重游泳试验
选择健康昆明种雌性小鼠70只，体重19～22g，将每批动物按体重随机分为7组，每组10只，各组均按0.5g/kg.BW经口灌胃，1次/d，连续30d，于末次给予小鼠受试物30min后，进行小鼠负重游泳试验。小鼠负重游泳试验的方法参考***《保健食品检验与评价技术规范》2003年版中关于缓解体力疲劳功能的方法设计，具体为：将小鼠尾部负重5%，置于40cm×60cm×36cm水池中游泳，水深30cm，水温25℃±0.5℃，记录小鼠游泳开始至死亡时间作为小鼠负重游泳时间。试验结果如表1所示：
表1小鼠负重游泳时间
Figure DEST_PATH_IMAGE002
*相对于实施例1组P<0.05；＃相对于实施例3组P<0.05
从上表中可以看出，本发明中制备的多肽具有提高动物活力的作用；实施例3中由于未对多肽进行提纯处理，导致了多肽活性不高。
2.免疫器官脏器指数测定试验
选择健康昆明种雌性小鼠70只，体重19～22g，将每批动物按体重随机分为7组，每组10只，各组均按0.5g/kg.BW经口灌胃，1次/d，对照组采用去离子水，连续30d，处死小鼠，取小鼠的胸腺及脾脏，以小鼠的脾脏(或胸腺)重(mg)与体重(g)的比值作为免疫器官指数。试验结果如表2所示：
表2免疫器官指数
Figure DEST_PATH_IMAGE004
*相对于实施例1组P<0.05；＃相对于实施例3组P<0.05；
从表中可看到，本发明提供的酶解多肽具有刺激小鼠免疫***组织生长的效果，并且其活性优于未经过吸附处理的多肽组。
3.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
选择健康昆明种雌性小鼠70只，体重19～22g，将每批动物按体重随机分为7组，每组10只，各组均按0.5g/kg.BW经口灌胃，1次/d，对照组采用去离子水，连续30d，向每只小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，激活小鼠巨噬细胞。4d后，颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/只，吸取腹腔洗液与等量的1%鸡红细胞混匀。吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内，放置孵箱内37℃孵育20分钟。孵育结束后用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1分钟，Giemsa液染色15分钟。用40X显微镜计数吞噬率和吞噬指数(吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数)，并据此判定巨噬细胞的吞噬能力。
吞噬百分率＝(吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数÷计数的吞噬细胞数)×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数÷计数的吞噬细胞数
表3腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞指数
Figure DEST_PATH_IMAGE006
*相对于实施例1组P<0.05；＃相对于实施例3组P<0.05
从表中可以看到，本发明制备的多肽具有提高小鼠免疫能力的效果，对照例3和对照例4组中，由于未对多肽进行提纯处理，导致了多肽活性不高。
多肽的表征
1.氨基酸组成：实施例3到的酶解多肽经盐酸水解后采用高效液相色谱法测定其氨基酸组成并计算脯氨酸的羟基化率。测定条件为：Sopium Amino Acid Analysis色谱柱，线性梯度洗脱，A相为0.2mol/L柠檬酸钠水溶液(pH3.00)，B相为0.2mol/L硼酸钠水溶液(pH9.80)，洗脱液流速为0.4mL/min，柱温为65℃。氨基酸组成如下：
表4 氨基酸组成
Figure RE-552304DEST_PATH_IMAGE004
2.多肽的分子量：采用高效液相排阻色谱法测定实施例3中制备得到的多肽相对分子量分布，测试条件如下：Waters600高效液相色谱仪，2487检测器，220nm波长，柱温30℃，流速0.5mL/min，色谱柱TSKgel 2000 SWXL，流动相为三氟乙醇：乙腈：水=1：450：550。如图3所示。从图中可以看出，本发明制备的多肽的分子量较小，主要集中在320～760Da之间。
3.多肽纯度
采用双缩脲法测定酶解多肽含量。高温下两分子脲（NH3CONH3）反应脱去一分子氨得到双缩脲。含有肽键的多肽能与双缩脲试剂中的Cu2+反应生成紫色络合物，该物质在550nm处有强吸收峰，可用分光光度计检测。此反应只与多肽含量有关，生成物颜色深浅与多肽含量成正比。双缩脲试剂的配制：称取1.5gCuSO4•5H2O和6.0gC4O6H4KNa溶于500mL去离子水中，充分溶解后移入1L容量瓶中，加入300mL10%的NaOH，定容，移入棕色瓶中待用。将1.0mL10%TCA加入到1.0mL多肽溶液中，摇匀后静置10min，4000r/min下离心，取1.0mL上清液与4.0mL双缩脲试剂混合，50℃水浴10min，测定550nm处的吸光度值。以0~100mg/mL牛血清白蛋白绘制标准曲线，用纯水做参比。参照标准曲线，计算样品溶液的多肽含量，如表5。
表5 多肽含量
Figure DEST_PATH_IMAGE010
从表中可以看出，本发明的方法制备得到的多肽优于现有技术中的提取方法，主要是由于本发明采用了多个组合提纯工艺对其进行处理。通过实施例3和对照例2的对比可以看出，采用了吸附脱色处理的酶解液具有更好的多肽纯度；通过对照例3和对照例3的对比可以看出，采用了多糖修饰改性的吸附微球能够有效地选择性吸附酶解液中的多糖和其它成分，得到的多肽的纯度更好。
电渗析和纳滤过程的表征
采用原子发射光谱仪测定电渗析的原料液和淡液、纳滤膜进料以及纳滤渗透液中的Na+和Zn2+离子浓度，采用如下公式计算纳滤膜对离子的截留率：
R=( Cf -Cp)/Cf×100%
式中，Cf是纳滤膜进料中离子浓度，ppm；
Cp是纳滤膜渗透液中离子浓度，ppm；
R是截留率，%。
多肽含量的测定采用双缩脲法测定实施例3中制备得到的多肽含量。高温下两分子脲（NH3CONH3）反应脱去一分子氨得到双缩脲。含有肽键的多肽能与双缩脲试剂中的Cu2+反应生成紫色络合物，该物质在550nm处有强吸收峰，可用分光光度计检测。此反应只与多肽含量有关，生成物颜色深浅与多肽含量成正比。
双缩脲试剂的配制：称取1.5gCuSO4•5H2O和6.0gC4O6H4KNa溶于500mL去离子水中，充分溶解后移入1L容量瓶中，加入300mL10%的NaOH，定容，移入棕色瓶中待用。将1.0mL10%TCA加入到1.0mL多肽溶液中，摇匀后静置10min，4000r/min下离心，取1.0mL上清液与4.0mL双缩脲试剂混合，50℃水浴10min，测定550nm处的吸光度值。以0~100mg/mL牛血清白蛋白绘制标准曲线，用纯水做参比。参照标准曲线，计算样品溶液的多肽含量。
表6 纳滤运行过程
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表7 多肽纯度
Figure DEST_PATH_IMAGE014
从上表中可以看出，本发明制备得到的多肽中，已经克服了鲍鱼中Na+和Zn2+的浓度倒挂的问题，在得到的多肽中，Na+和Zn2+的浓度基本相当。避免了过量食用Na+的危害的同时，也提高了Zn2+的对人体健康的促进作用。另外，通过实施例3和对照例1的对比可以看出，通过一价盐选择性电渗析处理之后，可以有效地单独地降低酶解液中的Na+含量，在不影响多肽和Zn2+的情况下，避免了Na+的对纳滤过程中Zn2+和多肽截留率的影响，提高了Zn2+和多肽在纳滤膜表面的截留效果。通过实施例3和对照例3的对比可以看出，采用改性处理的吸附微球可以更好地对多肽中的杂质进行吸附，提高多肽纯度。
片剂的表征
将实施例5和实施例6制备得到的片剂按照中国药典2010的片剂通则进行检测，片剂的制剂性如下：
表8 片剂的制剂性
Figure RE-264859DEST_PATH_IMAGE008
从上表中可以看到，本发明提供的片剂具有较好的制剂性能。

Claims (10)

1.一种多肽保健品，其特征在于，所述的多肽保健品是片剂；所述的片剂中包含有按重量份计的鲍鱼酶解多肽180～200份、填充剂320～350份、崩解剂120～150份、润滑剂15～20份、香精0.1～0.3份；
所述的鲍鱼酶解多肽的制备方法包括如下步骤：
第1步，将鲍鱼肉清洗干净，并打碎；
第2步，将第1步得到的鲍鱼肉与水按照重量比1：10～15混合，并加入蛋白酶进行酶解处理，处理结束后进行灭酶；
第3步，将第2步得到的酶解液与石油醚萃取剂按照体积比5～8：1混合，进行萃取除脂肪；
第4步，对第3步得到的萃余液采用吸附脱色处理；
第5步，对第4步得到的料液采用超滤膜过滤除杂；
第6步，对第5步得到的超滤渗透液进行一价盐选择透过性电渗析处理，去除Na+；
第7步，对第6步得到的电渗析淡液采用纳滤膜浓缩处理；
第8步，对第7步得到的纳滤浓缩液采用喷雾干燥，得到鲍鱼酶解多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，所述的填充剂是微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或几种的混合。
3.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或几种的混合。
4.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，所述的润滑剂是硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅中的一种或几种的混合。
5.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第2步中所述的蛋白酶选自菠萝蛋白酶、胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶中的一种或几种的混合，酶解过程的加酶量是4000～6000U/g底物；酶解过程的温度是40～50℃，酶解时间是1～3h。
6.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第3步中的萃取的温度是20～30℃，萃取的时间是20～30min。
7.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第4步中的吸附脱色采用的是活性炭或者多糖-聚醚砜双改性的硅藻土；所述的多糖-聚醚砜双改性的硅藻土的制备方法是：步骤a，用浓度为2～5wt%的盐酸对硅藻土进行活化处理，处理时间为0.5～1h，再把硅藻土滤出并用水洗涤，然后于160～165℃下热处理0.5～1h；步骤b，配制含有10～12wt%步骤a得到的硅藻土、4～6wt%十二烷基三甲基溴化铵、40～45wt%乙醇的混合溶液，于35～40℃搅拌0.5～1h，将产物滤出后，清洗并烘干，得到表面阳离子改性的硅藻土；步骤c，按重量份计，将表面阳离子改性的硅藻土20～25份，聚醚砜15～20份、二甲基乙酰胺160～200份混合均匀成悬浮液，将悬浮液滴加至含有5～8wt%壳聚糖的水溶液中，悬浮液和水溶液的体积比是1：4～6，将形成的微球吸附剂离心分离，减压干燥后得到多糖-聚醚砜双改性的硅藻土。
8.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第5步中的超滤膜的截留分子量是10～20万Da；超滤过程压力是0.2～0.5MPa，超滤过程温度是25～35℃。
9.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第6步中的一价盐选择透过性电渗析处理的电流密度为25～40A/m2。
10.根据权利要求1所述的多肽保健品，其特征在于，第7步中的纳滤膜的材质是聚酰胺，截留分子量是200～800Da；纳滤过程的压力是1.0～2.0MPa。
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Denomination of invention: A peptide health product and its preparation method

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Pledgor: SHANDONG GUOHETANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

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