CN109100518A - 利用竞争法快速检测禽流感、人流感易感人群的试纸条及试纸卡 - Google Patents

利用竞争法快速检测禽流感、人流感易感人群的试纸条及试纸卡 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用竞争法快速检测禽流感、人流感易感人群的试纸条及试纸卡。该试纸条(卡)包括用于检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)和/或用于检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)，试纸条(卡)包括沿层析方向依次设置的样品垫、胶体金标记垫、检测反应区以及吸水垫。本发明所述的试纸条(卡)检测灵敏度高，假阳性和假阴性率低，使用方便，容易观察区别，适合于临床快速诊断和基层流行病学调查等中大规模应用。

Description

利用竞争法快速检测禽流感、人流感易感人群的试纸条及试 纸卡
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种基于胶体金免疫层析技术快速检测禽流感和人流感病毒易感人群的试纸条(卡)。
背景技术
流感病毒在自然界中的宿主分布非常广泛，具有复杂的基因结构，且其基因发生重配和突变的概率很高，因此在全球范围内呈周期性流行。流感具有发病率及病死率高、传播速度快、波及范围广等特点，一旦爆发起来，将会对人类造成严重的灾难。流感病毒表面有一种重要的结构蛋白，呈H聚体的形式存在，称为血凝素(HA)，流感病毒侵入人体的方式主要是通过其表面的血凝素(HA)结构与宿主细胞表面特异性糖链受体结合进而感染宿主，HA主要识别的唾液酸分子会通过其末端的C原子与α2-3和Gal相结合形成SAα2-3Gal的结构或是形成SAα2-6Gal的结构，具有这样的宿主细胞表面结构与HA的结合具有特异性。不同类型的流感病毒结合宿主细胞表面糖链末端结构类型不同，其中，人流感病毒特异性识别的唾液酸糖链末端结构为SAα2-6Gal；禽流感病毒主要识别SAα2-3Gal唾液酸糖链末端结构。由于人体唾液中具有可封闭病毒表面的糖链末端结构，因此它的含量多少可以用来判断对于流感病毒的易感性。
凝集素是一类能够与糖蛋白或糖脂表面的糖链结构发生结合的非酶蛋白，但它并没有类似于抗体的免疫活性。西洋接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin，SNA)和马鞍树凝集素-II(Maackia Aimrensis Lectin-II，MAL-II)与流感病毒HA特异性识别的区域具有相似性；其中，SNA特异性识别末端为SAα2-6Gal的糖链受体结构，这与人流感病毒特异性结合的位点具有相似性；MAL-II特异性识别末端为SAα2-3Gal的糖链受体结构，这与禽流感病毒特异性结合的位点具有相似性。中国专利“一种用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的检测工具”(公开号：CN103884834A)披露了凝集素MAL-II与禽流感易感性以及凝集素SNA与人流感病毒易感性的相关关系，并指出，易感人群唾液中与对应凝集素MAL-II或SNA结合的α2-3或α2-6连接末端唾液酸糖链结构的表达水平显著下调，但是该专利仅应用于芯片试剂盒，检测的简便性、速度和成本均有待改进。
中国专利“快速检测禽流感和人流感易感人群的方法以及试纸条”(公开号：CN106771120A)披露了基于胶体金层析技术快速检测禽流感和人流感病毒易感人群的试纸条，其反应原理为双凝集素夹心法。但由于凝集素不具有类似于抗体的免疫活性，凝集素与唾液酸糖蛋白在结合的特异性上，无法与抗原抗体结合反应相提并论。对于检测唾液酸糖蛋白这类具有抗原性质的物质，采用竞争法更为合理，既体现了凝集素特异性结合的专属性，又使检测原理更加清晰，影响检测结果的因素也会变得更少，从而降低检测结果的假阳性和假阴性。但检测样品的处理、金标垫上的凝集素浓度、检测线上的包被物及其浓度筛选具有了更大的难度，需要通过技术攻关才能确定，保证检测结果的准确性、可靠性。目前尚未见到使用竞争法原理检测禽流感和人流感易感人群的胶体金试纸条(卡)的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用竞争法快速检测禽流感、人流感易感人群的试纸条及试纸卡。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸，该试纸包括用于检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸和/或用于检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸，所述Ⅰ型试纸和Ⅱ型试纸均包括沿层析方向依次设置的样品垫、胶体金标记垫、检测反应区和吸水垫，所述检测反应区包括依次排列的检测线和质控线，所述Ⅰ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素MAL-II(MAL-II—胶体金标记物)，所述Ⅱ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素SNA(SNA—胶体金标记物)，所述Ⅰ型试纸的质控线包括凝集素ConA，所述Ⅱ型试纸的质控线包括凝集素STL，所述Ⅰ型试纸及Ⅱ型试纸的检测线包括胎球蛋白。
优选的，所述胶体金标记垫是将标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA通过涂敷以及干燥吸附在玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上而制成的；所述检测线是将胎球蛋白通过涂敷以及干燥固化在硝酸纤维素膜上而制成的；所述质控线是将凝集素ConA或STL通过涂敷以及干燥固化在检测线所在硝酸纤维素膜上而制成的。
优选的，所述标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA的涂敷具体是指将浓度为30～60μg/mL的标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA喷涂在玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上；所述胎球蛋白的涂敷具体是指将浓度为1～4mg/mL的胎球蛋白划线或喷涂在硝酸纤维素膜的检测线位置，所述凝集素ConA或STL的涂敷具体是指将浓度为1～4mg/mL的凝集素ConA或STL划线或喷涂在硝酸纤维素膜的质控线位置。
优选的，所述试纸固定在基底上或设置在具有窗口的卡壳内。
一种试纸的制备方法，包括以下步骤：
(一)Ⅰ型试纸的制备
1.1)将所述标记胶体金的凝集素MAL-II涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上后干燥(37～40℃干燥18～24小时)，得到胶体金标记垫；
1.2)将所述胎球蛋白以及凝集素ConA涂敷于硝酸纤维素膜上，然后经干燥(20～30℃)制备得到检测线以及质控线；
1.3)将样品垫、步骤1.1)得到的胶体金标记垫、步骤1.2)得到的含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，以及吸水垫组装成Ⅰ型试纸；
(二)Ⅱ型试纸的制备
2.1)将所述标记胶体金的凝集素SNA涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上后干燥(37～40℃干燥18～24小时)，得到胶体金标记垫；
2.2)将所述胎球蛋白以及凝集素STL涂敷于硝酸纤维素膜上，然后经干燥(20～30℃)制备得到检测线以及质控线；
2.3)将样品垫、步骤2.1)得到的胶体金标记垫、步骤2.2)得到的含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，以及吸水垫组装成Ⅱ型试纸。
优选的，所述胶体金标记垫的制备中，将浓度为30～60μg/mL的标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA按照50～200μL/cm2涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上；所述检测线以及质控线的制备中，将浓度均为1～4mg/mL的胎球蛋白以及凝集素ConA或STL涂敷于硝酸纤维素膜上。
一种利用竞争法快速检测唾液酸糖链的方法，包括以下步骤：
1)对采集的检测样本进行预处理，以防止检测样本中的蛋白降解，得检测样品；
2)将检测样品或经过稀释后的检测样品加样至制备得到的Ⅰ型和/或Ⅱ型试纸；
3)利用Ⅰ型和/或Ⅱ型试纸上的胎球蛋白与检测样本中的末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链或末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链竞争性结合对应试纸上的标记胶体金的凝集素MAL-II或SNA，从而形成检测结果，对检测结果的判定如下：
若检测线以及质控线均显色，对于Ⅰ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链呈阴性或含量较低，对于Ⅱ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链呈阴性或含量较低；
若仅质控线显色，对于Ⅰ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链呈阳性或含量较高，对于Ⅱ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链呈阳性或含量较高；
若质控线不显色，则判定对应试纸无效。
优选的，所述检测样本选自唾液或鼻腔分泌物；检测样品的稀释采用去离子水、注射水、生理盐水(0.9％氯化钠溶液)、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，将经过预处理的检测样本(检测样品)稀释1～5倍。
优选的，所述预处理包括以下步骤：于0～4℃下向采集到的检测样本中加入蛋白酶抑制剂后进行离心，向离心所得上清液中再次加入蛋白酶抑制剂。
上述Ⅰ型和/或Ⅱ型试纸在制备快速检测流感易感人群的试剂(例如，试纸条、试纸卡等)中的应用(其中，Ⅰ型试纸可用于检测禽流感易感人群，Ⅱ型试纸可用于检测人流感易感人群)。
本发明的有益效果体现在：
本发明以胎球蛋白作为检测线，分别与胶体金标记的凝集素MAL-II或SNA构成层析试纸，实现了基于竞争法的唾液酸糖链结构(例如，具有SAα2-3Gal或SAα2-6Gal末端)快速检测，试纸检测灵敏度、重复率高，特异性强，稳定性好，假阳率和假阴率可控制在1％以下，高于现有基于夹心法的检测试剂的水平，检测结果容易观察区别，使用方便，适合于流感易感性的临床快速诊断和基层、农村流行病学调查大规模应用，也可以用于唾液酸糖链结构的定性及半定量检测。
附图说明
图1为试纸条的结构示意图；
图中：1为PVC板，2为检测线，3为质控线，4为吸水垫，5为NC膜，6为金标垫，7为样品垫。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
(一)检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条制备
(1)胶体金制备：将氯金酸(HAuCl4)配成1％的氯金酸溶液，取1mL氯金酸溶液加入99mL去离子水中，加热至沸腾后立即加入2mL 1％的枸掾酸钠溶液，迅速搅拌均匀，继续加热10分钟，冷却至室温，补充去离子水至100mL，得胶体金溶液。
(2)MAL-II—胶体金标记物的制备：取10mL制备好的胶体金溶液，用0.1mol/L的碳酸钾溶液将pH值调节到4.9～5.3(例如，5.0)，加入凝集素MAL-II 120μg，混匀，室温反应10分钟，4℃2000rpm离心20分钟，弃去沉淀。上清液于4℃12000rpm离心60分钟，弃去上清，沉淀溶于1mL的0.01mol/L pH8.0的PBS(内含0.2％BSA)中，得MAL-II—胶体金标记物溶液。
(3)金标垫的制备：取MAL-II—胶体金标记物溶液以0.01mol/L pH8.0的PBS(内含0.2％BSA)稀释1～2倍(例如，稀释1倍，则MAL-II浓度约为60μg/mL)，按100μL/cm2均匀的喷涂于玻璃纤维膜上，30％的湿度以下，40℃干燥24小时，得金标垫。金标垫用锡箔袋密封，内装干燥剂，常温保存。
(4)检测线与质控线的包被：将胎球蛋白用0.01mol/L的PBS(pH7.2)稀释至浓度为2mg/mL，在NC膜上划线(或采用喷于NC膜上作为替代划线的涂敷方式)，室温中自然干燥4小时，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时，使胎球蛋白固化在NC膜上，作为检测线。在离检测线6毫米处，用2mg/mL的凝集素ConA再划一条线(或喷于NC膜上作为替代划线的涂敷方式)，室温中自然干燥4小时，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时，使凝集素ConA固化，作为质控线。检测线和质控线的涂敷与干燥固化可同时进行。
(5)试纸条的组装：试纸条由样品垫7、金标垫6、固化有检测线2和质控线3的硝酸纤维素膜(NC膜5)、吸水垫4及基底(例如，PVC板1)组成；其中，吸水垫4可采用吸水玻璃纤维，吸收检测样品中多余液体；样品垫7可以采用玻璃纤维膜，接触待检测样品，具体结构参见图1。
在PVC板1上，沿着层析方向依次布置试纸条的各个试纸部分，其中，在下游端为吸水垫4，上游端为样品垫7，中段以固化有检测线2和质控线3的NC膜5作为检测反应区，在NC膜5与样品垫7之间放置吸附有胶体金标记的凝集素MAL-II的金标垫6。
试纸贴附于PVC板1上，裁切成4mm宽的条形带；其中，先将NC膜5贴附在PVC板1上，然后将吸水垫4和金标垫6贴附在PVC板1上，并且与NC膜5两端分别部分重叠，最后将样品垫7贴附在PVC板1上，并且与金标垫6部分重叠。另外，若将试纸组装于卡壳内，即可形成试纸卡。卡壳由上板和下板构成，上板有检测窗和加样孔，样品垫7正对加样孔，检测反应区正对检测窗。NC膜5上固化的检测线2更靠近金标垫6，试纸条(卡)表面有字母“T”和“C”作为标识检测线和质控线的符号，方便区分；试纸条(卡)于密封干燥条件下保存，备用。
(二)检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条制备
(1)胶体金制备：将氯金酸(HAuCl4)配成1％的氯金酸溶液，取1mL氯金酸溶液加入99mL去离子水中，加热至沸腾后立即加入2mL 1％的枸掾酸钠溶液，迅速搅拌均匀，继续加热10分钟，冷却至室温，补充去离子水至100mL，得胶体金溶液。
(2)SNA—胶体金标记物的制备：取10mL制备好的胶体金溶液，用0.1mol/L的碳酸钾溶液将pH值调节到5.8～6.2(例如，6.0)，加入凝集素SNA 120μg，混匀，室温反应10分钟，4℃2000rpm离心20分钟，弃去沉淀。上清液于4℃12000rpm离心60分钟，弃去上清，沉淀溶于1mL的0.01mol/L pH8.0的PBS(内含0.2％BSA)中，得SNA—胶体金标记物溶液。
(3)金标垫的制备：取SNA—胶体金标记物溶液以0.01mol/L pH8.0的PBS(内含0.2％BSA)稀释1～2倍(例如，稀释1倍，则SNA浓度约为60μg/mL)，按100μL/cm2均匀的喷涂于玻璃纤维膜上，30％的湿度以下，40℃干燥24小时，得金标垫。金标垫用锡箔袋密封，内装干燥剂，常温保存。
(4)检测线与质控线的包被：将胎球蛋白用0.01mol/L的PBS(pH7.2)稀释至浓度为2mg/mL，在NC膜上划线(或喷于NC膜上作为替代划线的涂敷方式)，室温中自然干燥4小时，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时，使胎球蛋白固化在NC膜上，作为检测线。在离检测线6毫米处，用2mg/mL的凝集素STL再划一条线(或喷于NC膜上作为替代划线的涂敷方式)，室温中自然干燥4小时，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时，使凝集素STL固化，作为质控线。检测线和质控线的喷涂与干燥固化可同时进行。
(5)试纸条的组装：试纸条由样品垫7、金标垫6、固化有检测线2和质控线3的硝酸纤维素膜(NC膜5)、吸水垫4及基底(例如，PVC板1)组成；其中，吸水垫4可采用吸水玻璃纤维，吸收检测样品中多余液体；样品垫7可以采用玻璃纤维膜，接触待检测样品，具体结构参见图1。
在PVC板1上，沿着层析方向依次布置试纸条的各个试纸部分，其中，在下游端为吸水垫4，上游端为样品垫7，中段以固化有检测线2和质控线3的NC膜5作为检测反应区，在NC膜5与样品垫7之间放置吸附有胶体金标记的凝集素SNA的金标垫6。
试纸贴附于PVC板1上，裁切成4mm宽的条形带；其中，先将NC膜5贴附在PVC板1上，然后将吸水垫4和金标垫6贴附在PVC板1上，并且与NC膜5两端分别部分重叠，最后将样品垫7贴附在PVC板1上，并且与金标垫6部分重叠。另外，若将试纸组装于卡壳内，即可形成试纸卡。卡壳由上板和下板构成，上板有检测窗和加样孔，样品垫7正对加样孔，检测反应区正对检测窗。NC膜5上固化的检测线2更靠近金标垫6，试纸条(卡)表面有字母“T”和“C”作为标识检测线和质控线的符号，方便区分；试纸条(卡)于密封干燥条件下保存，备用。
(三)检测原理
检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)：胶体金标记垫(即金标垫)吸附有MAL-II—胶体金标记物；检测线包被有胎球蛋白；质控线包被有可以与凝集素MAL-II结合的凝集素ConA。在提供任何待检测样品前，检测线和质控线都不显示颜色。当样品加入样品垫后，样品中的SAα2-3Gal糖链与MAL-II—胶体金标记物一起层析泳动到检测反应区，由于样品中的SAα2-3Gal糖链与胎球蛋白中的SAα2-3Gal糖链竞争性与MAL-II—胶体金标记物结合，当样品中的SAα2-3Gal糖链浓度超过一定量时，MAL-II—胶体金标记物就不能与检测线上的胎球蛋白结合，此时检测线位置不出现***线条；当样品中没有SAα2-3Gal糖链或者样品中SAα2-3Gal糖链低于一定量时，MAL-II—胶体金标记物就与检测线上的胎球蛋白结合，从而在检测线位置显示出一条***线条；而无论样品中是否含有SAα2-3Gal糖链，质控线位置都会出现***线条，以示检测有效。
检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)：胶体金标记垫(即金标垫)吸附有SNA—胶体金标记物；检测线包被有胎球蛋白；质控线包被有可以与凝集素SNA结合的凝集素STL。在提供任何样品前，检测线和质控线都不显示颜色。当样品加入样品垫后，样品中的SAα2-6Gal糖链与SNA—胶体金标记物一起层析泳动到检测反应区，由于样品中的SAα2-6Gal糖链与胎球蛋白中的SAα2-6Gal糖链竞争性与SNA—胶体金标记物结合，当样品中的SAα2-6Gal糖链浓度超过一定量时，SNA—胶体金标记物就不能与检测线上的胎球蛋白结合，此时检测线位置不出现***线条；当样品中没有SAα2-6Gal糖链或者样品中SAα2-6Gal糖链浓度低于一定量时，SNA—胶体金标记物就与检测线上的胎球蛋白结合，从而在检测线位置显示出一条***线条；而无论样品中是否含有SAα2-6Gal糖链，质控线位置都会出现***线条，以示检测有效。
上述胎球蛋白指牛胎球蛋白，其包含12个半胱氨酸残基，主要组成成分为：多肽74％、己糖8.3％、氨基己糖5.5％，及唾液酸8.7％。其中SAα2-3Gal糖链连接的唾液酸含量为4.8％，SAα2-6Gal糖链连接的唾液酸含量为2.8％。由于其含有定量的糖链，因此，在所设计的试纸条(卡)中，可用于制作检测线。
(四)检测禽流感、人流感易感人群的试纸条(卡)的假阳率和假阴率测试实验
4.1、唾液样本采集和预处理：健康人50例，饭后两小时，约9点到10点之间，生理盐水漱口三次后，迅速采集自然分泌的全唾液，每例至少1mL，并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂(每毫升唾液加入10μL)防止蛋白降解。将采集到的唾液样本合并(50例混合)，在4℃、12000rpm条件下离心1h(去除唾液残渣和脱落细胞)，收集上清液；向离心后的唾液样本上清中加入蛋白酶抑制剂(每10mL加入1μL蛋白酶抑制剂)，即可作为待检测样品备用(4℃)，上述蛋白酶抑制剂例如采用SIGMA公司的Protease Inhibitor Cocktail。
4.2、样品中SAα2-6Gal糖链、SAα2-3Gal糖链的去除：
1、凝集素磁性微粒复合物的制备
取50个2mL的离心管，置于磁性分离架上，各吸取3mg环氧化磁性微粒(环氧化磁铁悬浮于水溶液中保存，约14mg/mL)置于上述离心管中。磁性分离，待上清清澈后，弃上清。各加入1mL硼酸硼砂偶联缓冲液(组成：5mL 0.05mol/L硼砂溶液、45mL0.2mol/L硼酸溶液，及0.15mol/L NaCl，用盐酸或氢氧化钠调节pH调至7.4)，振荡混匀后置于磁性分离架上清洗磁粒，磁性分离3min，上清清澈后弃上清。将600μL SNA/MAL-II溶液(1mg/mL，溶剂是偶联缓冲液)加入清洗好的环氧化磁性微粒中，混匀后置于恒温振荡器上，在25℃，180rpm条件下振荡反应3h，偶联反应结束后，磁性分离3min，弃上清。将封闭液(水溶液，含2％的乙醇胺和0.1％的BSA)1mL分别加入上述离心管中，在25℃，180rpm条件下振荡反应1小时。封闭结束后，置于磁性分离架上，磁性分离后，弃去上清，分别得到SNA磁性微粒复合物和MAL-II磁性微粒复合物。
2、α2-6连接末端唾液酸糖链的去除
取4.1中处理好的唾液样品，加入上述制备好的SNA磁性微粒复合物中，每管加入700μL(唾液)，在25℃、180rpm条件下振荡反应3小时。待反应结束后，取出置于磁性分离架上分离后，收集上清。得到去除SAα2-6Gal糖链的唾液样品。
3、α2-3连接末端唾液酸糖链的去除
取上述去除SAα2-6Gal糖链的唾液样品，加入上述制备好的MAL-II磁性微粒复合物中，在25℃、180rpm条件下振荡反应3小时。待反应结束后，取出置于磁性分离架上分离后，收集上清。得到去除SAα2-6Gal糖链及SAα2-3Gal糖链的唾液样品。
4.3、假阳性测试
1、检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)
(1)取处理好的唾液样品(去除SAα2-6Gal糖链及SAα2-3Gal糖链)5mL。
(2)将唾液样品100μL及去离子水100μL，滴入检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)样品垫，共做50例。5分钟内观察结果，判定样品中是否含有SAα2-3Gal糖链。
判定依据如下：
阴性(无)：检测线以及质控线均呈现***；
阳性(有)：仅质控线呈现***；
无效：质控线不呈现***，则无论检测线是否呈现***，试纸条(卡)的检测结果均判为无效；
判定结果为：唾液样品1份呈阳性，49份呈阴性，全部有效，假阳性率为2％，随着样品例增加，可以控制在1％以下。
2、检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)
(1)取处理好的唾液样品(去除SAα2-6Gal糖链及SAα2-3Gal糖链)5mL。
(2)将唾液样品100μL及去离子水100μL，滴入检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)样品垫，共做50例。5分钟内观察结果，判定样品中是否含有SAα2-6Gal糖链。
判定依据如下：
阴性(无)：检测线以及质控线均呈现***；
阳性(有)：仅质控线呈现***；
无效：质控线不呈现***，则无论检测线是否呈现***，试纸条(卡)检测结果均判为无效；
判定结果为：唾液样品2份呈阳性，48份呈阴性，全部有效，假阳性率为4％，随着样品例增加，可以控制在1％以下。
4.4、假阴性测试
1、样品制备：
取去除SAα2-6Gal糖链及SAα2-3Gal糖链的唾液样品10mL，加入16.4mg胎球蛋白，溶解混匀后作为试验样品。
2、检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)
(1)取制备好的试验样品5mL。
(2)将试验样品100μL及去离子水100μL，滴入检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸条(卡)样品垫，共做50例。5分钟内观察结果，判定样品中是否含有SAα2-3Gal糖链。
判定依据如下：
阴性(无)：检测线以及质控线均呈现***；
阳性(有)：仅质控线呈现***；
无效：质控线不呈现***，则无论检测线是否呈现***，试纸条(卡)的检测结果均判为无效；
判定结果为：唾液样品1份呈阴性，49份呈阳性，全部有效，假阴性率为2％，随着样品例增加，可以控制在1％以下。
3、检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)
(1)取制备好的试验样品5mL。
(2)将试验样品100μL及去离子水100μL，滴入检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸条(卡)样品垫，共做50例。5分钟内观察结果，判定样品中是否含有SAα2-6Gal糖链。
判定依据如下：
阴性(无)：检测线以及质控线均呈现***；
阳性(有)：仅质控线呈现***；
无效：质控线不呈现***，则无论检测线是否呈现***，试纸条(卡)的检测结果均判为无效；
判定结果为：唾液样品1份呈阴性，49份呈阳性，全部有效，假阴性率为2％，随着样品例增加，可以控制在1％以下。

Claims (10)

1.一种利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸，其特征在于：该试纸包括用于检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸和/或用于检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸，所述Ⅰ型试纸和Ⅱ型试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫(7)、胶体金标记垫、检测反应区和吸水垫(4)，所述检测反应区包括检测线(2)和质控线(3)，所述Ⅰ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素MAL-II，所述Ⅱ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素SNA，所述Ⅰ型试纸的质控线(3)包括凝集素ConA，所述Ⅱ型试纸的质控线(3)包括凝集素STL，所述Ⅰ型及Ⅱ型试纸的检测线(2)包括胎球蛋白。
2.根据权利要求1所述一种利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸，其特征在于：所述胶体金标记垫是将标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA通过涂敷以及干燥吸附在玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上而制成的；所述检测线(2)是将胎球蛋白通过涂敷以及干燥固化在硝酸纤维素膜上而制成的；所述质控线(3)是将凝集素ConA或STL通过涂敷以及干燥固化在硝酸纤维素膜上而制成的。
3.根据权利要求2所述一种利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸，其特征在于：所述标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA的涂敷具体是指将浓度为30～60μg/mL的标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA喷涂在玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上；所述胎球蛋白的涂敷具体是指将浓度为1～4mg/mL的胎球蛋白划线或喷涂在硝酸纤维素膜的检测线位置，所述凝集素ConA或STL的涂敷具体是指将浓度为1～4mg/mL的凝集素ConA或STL划线或喷涂在硝酸纤维素膜的质控线位置。
4.根据权利要求1所述一种利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸，其特征在于：所述试纸固定在基底上或设置在具有窗口的卡壳内。
5.一种如权利要求1所述的利用竞争法快速检测流感易感人群的试纸的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将所述标记胶体金的凝集素MAL-II涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上后干燥，得到胶体金标记垫；
2)将所述胎球蛋白以及凝集素ConA涂敷于硝酸纤维素膜上，然后经干燥制备得到检测线(2)以及质控线(3)；
3)将样品垫(7)、胶体金标记垫、含有检测线(2)和质控线(3)的硝酸纤维素膜以及吸水垫(4)组装成用于检测禽流感易感人群的Ⅰ型试纸；
或者，
1)将所述标记胶体金的凝集素SNA涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上后干燥，得到胶体金标记垫；
2)将所述胎球蛋白以及凝集素STL涂敷于硝酸纤维素膜上，然后经干燥制备得到检测线(2)以及质控线(3)；
3)将样品垫(7)、胶体金标记垫、含有检测线(2)和质控线(3)的硝酸纤维素膜以及吸水垫(4)组装成用于检测人流感易感人群的Ⅱ型试纸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，将浓度为30～60μg/mL的标记胶体金的凝集素MAL-II或标记胶体金的凝集素SNA按照50～200μL/cm2涂敷于玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜上；所述步骤2)中，将浓度均为1～4mg/mL的胎球蛋白以及凝集素ConA或STL涂敷于硝酸纤维素膜上。
7.一种利用竞争法快速检测唾液酸糖链的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对采集的检测样本进行预处理，以防止检测样本中的蛋白降解，得检测样品；
2)将检测样品或经过稀释后的检测样品加样至Ⅰ型和/或Ⅱ型试纸，所述Ⅰ型试纸及Ⅱ型试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫(7)、胶体金标记垫、检测反应区和吸水垫(4)，所述检测反应区包括检测线(2)和质控线(3)，所述Ⅰ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素MAL-II，所述Ⅱ型试纸的胶体金标记垫包括标记胶体金的凝集素SNA，所述Ⅰ型试纸的质控线(3)包括凝集素ConA，所述Ⅱ型试纸的质控线(3)包括凝集素STL，所述Ⅰ型及Ⅱ型试纸的检测线(2)包括胎球蛋白；
3)利用Ⅰ型和/或Ⅱ型试纸上的胎球蛋白与检测样本中的末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链或末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链竞争性结合对应试纸上的标记胶体金的凝集素MAL-II或SNA，形成检测结果，对检测结果的判定如下：
若检测线(2)以及质控线(3)均显色，对于Ⅰ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链呈阴性或含量较低，对于Ⅱ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链呈阴性或含量较低；
若仅质控线(3)显色，对于Ⅰ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-3Gal结构的唾液酸糖链呈阳性或含量较高，对于Ⅱ型试纸，则判定检测样本中所述末端具有SAα2-6Gal结构的唾液酸糖链呈阳性或含量较高；
若质控线(3)不显色，则判定对应试纸无效。
8.根据权利要求7所述的利用竞争法快速检测唾液酸糖链的方法，其特征在于：所述检测样本选自唾液或鼻腔分泌物；检测样品的稀释采用去离子水、注射水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，稀释倍数为1～5倍。
9.根据权利要求7所述的利用竞争法快速检测唾液酸糖链的方法，其特征在于：所述预处理包括以下步骤：向采集的检测样本中加入蛋白酶抑制剂后进行离心，向离心所得上清液中再次加入蛋白酶抑制剂，得检测样品。
10.一种如权利要求1所述的试纸在制备快速检测流感易感人群的试剂中的应用。
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