CN109100435B - 一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的hplc分析方法 - Google Patents

一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的hplc分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物动力学分析领域，具体涉及一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC方法。该方法依次包括标准曲线的建立和样品检测两个步骤，其特征在于，HPLC分析方法的条件为：采用Luna ® 5μm C18（4.6mm×250 mm）色谱分析柱，采用梯度洗脱变波长方法。本方法仅采用HPLC即实现了生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的同步测定，快速的提高了姜黄素和紫衫醇联合用药的药代动力学研究的效率，能快速促进了姜黄素和紫衫醇联合用药的开发进程，为研发的企业和科研机构大幅的降低时间、人力和经济成本。

Description

一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法
技术领域
本发明涉及药物动力学分析领域，具体涉及一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC方法。
背景技术
姜黄素(CU)是一种从中药中分离提纯的单体，是植物界很稀少的具有二酮的色素，
为二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，不溶于水。具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老等药理作用，高效低毒，作为新一代抗肿瘤药物前景良好。主要是从阻断信号通路传导NF-κB、STAT3及MAPK，调控相关肿瘤基因和蛋白表达BcL-2、p53等，调节黏附分子的介导，抑制肿瘤血管生成等方面实现其抗肿瘤的作用。
紫杉醇(PTX)是具有抗癌活性的天然二萜类化合物。多年以来是临床上治疗乳腺癌的一线化疗药物，并且对多种难治疗的恶性肿瘤有疗效显著，如睾丸胚胎癌、胆囊癌、非小细胞肺癌、卵巢癌。但其长期应用毒副作用较强，可导致严重的超敏反应、多药耐药和胃肠道刺激，甚至骨髓抑制。在临床中应用较多的治疗恶性肿瘤的是以顺铂联合PTX为主的化疗方案，但毒副作用未得到缓解。近年来研究者都倾向于寻找一种与PTX联用可减毒增效的物质来治疗恶性肿瘤。
近年来研究表明，CU能够减慢细胞对PTX的清除速度，增加PTX的有效浓度，逆转细胞对PTX的耐药性产生，且已证实两药联用增强对子宫内膜癌细胞的杀伤作用，对小鼠转移性肺癌也有明显作用，对人喉癌和肝癌疗效显著增加。两药联用在肝癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌等方面研究较多，已取得一定的成果，因此研究两药联用的药动学的分析方法具有重要意义。
目前对于CU和PTX的药动学研究，测定其生物样品浓度的HPLC法，均为单独测定其药物浓度，未见其联用的药动学评价分析方法(张一唱,龚元,方慧琼,等.姜黄胶囊中姜黄素在大鼠体内药动学和组织分布[J].中国药师,2018(1):65-68；许杜娟,黄灿,苏涌,等.注射用紫杉醇脂质体药代动力学研究[C].全国治疗药物监测学术年会.2014)。此外，还有研究建立了分别测定CU和PTX及同时测定二者生物样品药物浓度的UPLC-MS/MS，但对于生物样品的处理操作繁琐及对所使用的仪器要求高(李智宁,魏悦,朱杰,等.超高效液相色谱-质谱法测定大鼠血浆中的姜黄素[J].河南科学,2017,35(8):1252-1257；石永辉,余晓霞,吕立,等.
HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中紫杉醇的含量[J].今日药学,2017(11):735-738；李金银,房晶,李文学,等.高通量分析紫杉醇在动物体内的药动学及组织分布[J].中国医药,2014,9(12):1833-1837)。CU和PTX的药动学研究现有技术仍存在如下缺点：现有方法仅能单独测定CU和PTX生物样品含量，难以实现CU和PTX联用；而采用UPLC-MS/MS方法同时测定CU和PTX含量时，样品预处理和测定操作繁琐，耗时长，对仪器设备要求高。
发明内容
为解决上述问题本发明提供一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法，上述HPLC方法无需与质谱仪联用即可同步测定姜黄素和紫杉醇的含量，该方法操作简单高效，且对样品的预处理要求交低，无繁琐的预处理过程。
一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法，依次包括标准曲线的建立和样品检测两个步骤，其特征在于，HPLC分析方法的条件为：采用
Figure BDA0001727993310000021
5μm C18(4.6mm×250mm)色谱分析柱，采用梯度洗脱变波长方法：0～9.5min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈：磷酸缓冲液＝55:45(v/v)；9.51～11.5min时，检测波长为227nm，流动相为乙腈：磷酸缓冲液＝40:60(v/v)；柱温30℃，流动相流速为1mL/min。
优选的，所述HPLC分析方法的条件还包括：在11.51～19.0min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈：磷酸缓冲液＝55:45(v/v)。
优选的，所述磷酸缓冲液是由磷酸和三乙胺配制的pH＝3.5的混合液。
优选的，所述标准曲线的建立包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制：将姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇分别溶于甲醇，制备成相同浓度的姜黄素储备液、紫杉醇储备液及姜黄素和紫杉醇混合储备液，再用甲醇稀释为系列梯度浓度的标准溶液。
(2)标准曲线的建立：分别取系列浓度的姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇混合的标准溶液与待测样品对应的空白生物样品混合得混合液，并对混合液进行样品前处理得供试液，然后在所述HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，建立标准曲线。
优选的，所述样品检测步骤为取待测样品进行样品前处理得到供试液，然后在所述的HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，根据上述标准曲线和峰面积计算样品中姜黄素和紫杉醇的浓度。
优选的，所述样品前处理时指向混合液中加入柠檬酸缓冲液，混合均匀，加入8～12倍的体积的萃取溶剂，混匀并离心，取有机层，氮气挥干，加入复合溶剂，混匀，离心取上清液即为供试液。
优选的，所述复合溶剂为乙腈和磷酸缓冲液配制而成，两者体积比为75:25。
优选的，所述萃取溶剂为乙酸乙酯和甲醇配置而成，两者的体积比为90:10。
优选的，所述待测样品为家兔样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:10，所述待测样品为大鼠样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:2。
更优选的，样品前处理的具体方法如下：
取定量混合液置于5mL离心管中，加入25μL CA缓冲液(pH 3.6)，涡旋混合30s，加入定量萃取剂(乙酸乙酯：甲醇＝90：10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入萃取剂重复萃取一次，合并2次上清液。氮气吹干，加入200μL复溶剂[乙腈：磷酸(pH3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，离心10min(10000rpm/min)，取上清液20μL进行HPLC检测。
本发明的有益效果在于：
1.在无需联用质谱仪的条件下，本方法仅采用HPLC即实现了生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的同步测定，快速的提高了姜黄素和紫衫醇联合用药的药代动力学研究的效率，能快速促进了姜黄素和紫衫醇联合用药的开发进程，为研发的企业和科研机构大量的降低时间、人力和经济成本。
2.本方法无需使用超高效液相色谱，有效的简化了样品的前处理步骤；同时，由于HPLC的洗脱剂对纯度要求远低于超高效液相色谱，使得仪器的运行成本远低于使用超高效液相色谱。
3.本方法的具有高的灵敏度、准确度和稳定性，完全能够满足姜黄素、紫衫醇以及姜黄素和紫衫醇联合用药的原料药和制剂的药代动力学研究。
附图说明
图1为实施例1建立的检测大鼠血浆CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的血药浓度的标准曲线。
图2为实施例1建立的检测大鼠血浆的HPLC色谱图，其中，(1)为CU单品HPLC色谱图，(2)为PTX单品HPLC色谱图，(3)为CU联合PTX复合品HPLC色谱图。
图3为实施例2建立的大鼠血浆加标样品的HPLC色谱图，其中，(1)为CU单品加标样品HPLC色谱图，(2)为PTX单品加标样品HPLC色谱图，(3)为CU联合PTX复合品加标样品HPLC色谱图。
图4为实施例3建立的检测家兔血浆CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的血药浓度的标准曲线。
图5为实施例3建立的检测家兔血浆的HPLC色谱图，其中，(1)为CU单品HPLC色谱图，(2)为PTX单品HPLC色谱图，(3)为CU联合PTX复合品HPLC色谱图。
图6为实施例4建立的检测家兔血浆加标样品的HPLC色谱图，其中，(1)为CU单品加标样品HPLC色谱图，(2)为PTX单品加标样品HPLC色谱图，(3)为CU联合PTX复合品加标样品HPLC色谱图。。
图7为实施例5建立的检测大鼠心单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图8为实施例5建立的检测大鼠胃单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图9为实施例5建立的检测大鼠肝CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图10为实施例5建立的检测大鼠脾CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图11为实施例5建立的检测大鼠肺CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图12为实施例5建立的检测大鼠肾CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图13为实施例5建立的检测大鼠脑CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX的组织药物浓度的标准曲线。
图14为实施例6建立的检测大鼠心的HPLC色谱图，其中，(1)为CU单品HPLC色谱图，(2)为PTX单品HPLC色谱图，(3)为CU联合PTX复合品HPLC色谱图。。
图15为实施例7建立的检测大鼠单次尾静脉注射CU单品、PTX单品、CU与PTX复合品及其制剂中CU、PTX后血浆药时曲线图。
图16为实施例8建立的检测家兔耳缘静脉注射CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品(质量比为1:1和1:2)中CU、PTX后血浆药时曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不以任何形式限定本发明。除特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除特别说明，以下实施例所使用的试剂和材料均可通过商业途径购买获得。
本发明所述的HPLC为高效液相色谱技术的简称；CU为姜黄素简称；PTX为紫杉醇简称。
实施例1：建立测定大鼠血浆中CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX浓度的标准曲线
1、标准溶液配制：
(1)CU、PTX标准溶液配制：精密称取CU、PTX对照品4.00mg，分别置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解震荡摇匀，定容至50mL，即得80μg/mL的CU、PTX的储备液，再用甲醇稀释，分别制备浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.80、1.60、3.20、4.80、6.60、8.00μg/mL的CU、PTX标准溶液溶液。
(2)CU与PTX复合品对照溶液配制：取新配制的CU、PTX对照品储备液，用甲醇稀释，制备浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.80、1.60、3.20、4.80、6.60、8.00μg/mL的CU与PTX复合品对照品溶液。
2、标准曲线的建立
分别精密吸取50μL系列标准品溶液，加入5mL离心管中，分别加入大鼠空白血浆100μL，涡旋混合30s，加入25μL CA缓冲液(pH 3.6)，涡旋混合30s，加入0.5mL萃取剂(乙酸乙酯:甲醇＝90:10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入0.5mL萃取剂重复萃取一次，合并2次上清液。氮气吹干，加入200μL复溶剂[乙腈：磷酸(pH 3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，10000rpm/min高速离心10min，取上清液160μL，进行HPLC检测。
以不同浓度的CU、PTX血药浓度C为横坐标，以不同浓度的CU、PTX的峰面积Y为纵坐标，进行直线回归，得回归方程及R2。标准曲线结果如图1所示。
上述HPLC分析方法条件如下：
使用
Figure BDA0001727993310000061
5μm C18(4.6mm×250mm)色谱分析柱，0-9.5min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈：磷酸缓溶液＝55:45(v/v)；9.51-11.5min时，检测波长为227nm，流动相为乙腈；磷酸缓溶液＝40:60(v/v)；11.51-19.0min时，检测波长425nm，流动相为乙腈：磷酸缓溶液＝55:45(v/v)。柱温为30℃，流速为1mL/min。进样量为20μL。
实施例2：样品检测
1、加标大鼠血浆样本检测
(1)空白大鼠血浆预处理及供试液制备
从空白大鼠心脏采血约500μL。血样品置于肝素化EP管中，全血经54000rpm离心3min吸取上层血浆，即空白大鼠血浆，待用。
将CU、PTX及CU与PTX复合品对照溶液加入空白大鼠血浆，得到CU浓度为0.1124，0.9050，3.062μg/mL；PTX浓度为0.1005，0.4726，1.4204μg/mL；CU与PTX复合品中CU浓度为0.1872，0.7027，3.1453μg/mL，PTX的浓度0.1097，0.3086，1.2386μg/mL的加标血浆样品。
取加标血浆样品100μL，按照实施例1的血浆样品前处理方法进行处理后，取上清160μL移入进样瓶中。
(2)加标血浆样本检测
进样20μL，进行HPLC分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算CU单品、PTX单品及CU与PTX复合品中CU、PTX血浆样本浓度分别为：0.0952±0.0124，0.8549±0.08678，2.7337±0.1800；0.0752±0.0055，0.3875±0.0095，1.2640±0.1377；0.1439±0.0059，0.6851±0.0129，2.9135±0.1994、0.0800±0.0178，0.2866±0.0096，1.1258±0.0541，样本色谱图如图3所示。
表明本测定方法可以很准确的测定分析大鼠血浆中、PTX及CU与PTX复合品的浓度且色谱图中CU、PTX峰形平滑对称，无干扰峰，且CU和PTX两个峰相互分离，无干扰，色谱图稳定可靠，方法高效、稳定，可很好的满足大鼠血浆CU、PTX及CU与PTX联用药代动力学评估的需要。
2、体内样品检测：
(1)选取受试动物Sprague-DawLey大鼠。
给药前禁食12h，自由饮水。
注射剂的配制：精密称取CU或PTX的粉末，用无水乙醇：聚氧乙烯蓖麻油(EL-35)(1:1,v/v)超声溶解，配制成澄明液体后，再用孔径为0.22μm的无菌过滤器在超净工作台中过滤后使用，注射前现配。
实验设计：分组后，采用尾静脉方式给药后(给药方案见图15、16)，分别于5min、10min、15min、30min、45min、60min、120min、240min、480min、1440min时心脏采血。取出的全血(约500μL)放于含肝素钠离心管中，离心3min(5000rpm/min)，并取上清血浆待处理。
(2)大鼠血浆样品预处理方法：取大鼠血浆100μL，置于2mL离心管中，加入25μL(pH3.6)的柠檬酸缓冲液，涡旋30s后，加入0.5mL萃取剂(乙酸乙酯：甲醇＝90：10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入0.5mL萃取剂重复萃取操作一次，合并2次上清液。35℃，氮气吹干后，加入200μL复溶剂[磷酸：乙腈＝75:25(pH 3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，离心10min(10000rpm/min)，取上清液160μL于进样瓶中，HPLC进样检测。
结果如图2所示。
本检测方法不仅适用于体外样品加标检测，其在检测生物体内样品时，仍能保证谱图干净无杂峰，不受体内样品中其他代谢物的干扰。
实施例3：建立测定家兔血浆中CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX浓度的标准曲线
1、标准溶液配制：
(1)CU、PTX标准溶液配制：精密称取CU、PTX对照品4.00mg，分别置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解震荡摇匀，定容至50mL，即得80μg/mL的CU、PTX储备液，再用甲醇稀释，分别制备浓度分别为0.008、0.016、0.032、0.08、0.16、0.8、5、10、15、20、25、30μg/mL的CU、PTX标准品溶液。
(2)CU与PTX复合标准溶液配制：取新配制的CU、PTX对照品储备液，用甲醇稀释，制备浓度分别为0.008、0.016、0.032、0.08、0.16、0.64、0.8、5、10、15、20、25、30μg/mL的CU与PTX复合标准溶液。
2、建立标准曲线
分别精密吸取50μL标准溶液，加入5mL离心管中，分别加入家兔空白血浆500μL，涡旋混合30s，加入25μL CA缓冲液(pH 3.6)，涡旋混合30s，加入3mL萃取剂(乙酸乙酯:甲醇＝90:10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入3mL萃取剂重复萃取一次，合并2次上清液。氮气吹干，加入200μL复溶剂[乙腈：磷酸(pH 3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，离心10min(10000rpm/min)，取上清液160μL，进行
HPLC检测。
以不同浓度的CU、PTX血药浓度C为横坐标，以不同浓度的CU、PTX的峰面积Y为纵坐标，进行直线回归，得回归方程及R2。标准曲线结果如图4所示。
上述HPLC分析的方法条件如下：
使用反相色谱分析柱，0-9.5min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈：磷酸缓溶液＝55:45(v/v)；9.51-11.5min时，检测波长为227nm，流动相为乙腈；磷酸缓溶液＝40:60(v/v)；11.51-19.0min时，检测波长425nm，流动相为乙腈：磷酸缓溶液＝55:45(v/v)。柱温为30℃，流速为1mL/min。进样量为20μL。
实施例4：样品检测
1、家兔血浆加标样品检测
(1)空白家兔血浆预处理及供试液制备
从空白家兔心脏采血约1.5mL。血样品置于肝素化EP管中，全血经5000rpm离心3min吸取上层血浆，即空白大鼠血浆，待用。
将CU、PTX及CU与PTX复合品标准溶液加入空白家兔血浆，得到CU浓度为0.1124，0.9050，3.062μg/mL；PTX浓度为0.0586，0.4726，1.4204μg/mL；CU与PTX复合溶液中CU浓度为0.1872，0.7027，3.1453μg/mL，PTX的浓度0.0697，0.3086，1.2386μg/mL的加标血浆样品。
取加标血浆样品100μL，按照实施例3的血浆样品前处理方法进行处理后，取上清160μL移入进样瓶中。
(2)加标血浆样本检测
进样20μL，进行HPLC分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算CU单品、PTX单品及CU与PTX复合品中CU、PTX血浆样本浓度分别为：0.0875±0.0016，0.8421±0.0478，2.6819±0.0174；0.0444±0.0086，0.3778±0.0163，1.2824±0.0858；0.1394±0.0102，0.7906±0.0213，2.7781±0.2852、0.0456±0.0045，0.2759±0.0266，0.9773±0.0151，样本色谱图如图6所示。
表明本测定方法可以很准确的测定分析家兔血浆中、PTX及CU与PTX复合品的浓度且色谱图中CU、PTX峰形平滑对称，无干扰峰，且CU和PTX两个峰相互分离，无干扰，色谱图稳定可靠，方法高效、稳定，可很好的满足家兔血浆CU、PTX及CU与PTX联用药代动力学评估的需要。
2、建立HPLC分析方法的家兔血浆样本色谱图：
(1)选取受试动物家兔。
给药前禁食12h，自由饮水。
注射剂的配制：
聚氧乙烯蓖麻油EL-35：无水乙醇：氯化钠注射液(1:1:8，v/v/v)溶解CU和/或PTX，配制成相应给药剂量的澄明液体，临用前配制，用孔径为0.2μm的无菌过滤器过滤后使用。
实验设计：
分组后，经耳缘静脉注射给药后(给药方式参见图5、6)，分别于于0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、L h、2h、4h、6h、8h、12h、24h时取血。取出全血(约1.5mL)放于含肝素钠采血管中，5000rpm/min离心3min取血浆待处理。
(2)家兔血浆样品预处理方法：取家兔血浆500μL，置于5mL离心管中，加入25μL(pH3.6)hj的柠檬酸缓冲液，涡旋30s后，加入3mL萃取剂(乙酸乙酯：甲醇＝90：10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入0.5mL萃取剂重复萃取操作一次，合并2次上清液。35℃，氮气吹干后，加入200μL复溶剂[磷酸：乙腈＝75:25(pH 3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，转移至2mL离心管中，离心10min(10000rpm/min)，取上清液160μL于进样瓶中，HPLC进样检测。
结果如图5所示。
本检测方法不仅适用于体外样品加标检测，其在检测生物体内样品时，仍能保证谱图干净无杂峰，不受体内样品中其他代谢物的干扰。
实施例5：建立测定大鼠组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)中CU单品、PTX单品及CU联合PTX复合品中CU、PTX浓度的标准曲线
1、对照品溶液配制：
CU、PTX标准溶液配制：精密称取CU、PTX对照品4.00mg，分别置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解震荡摇匀，定容至50mL，即得80μg/mL的CU、PTX标准储备液，再用甲醇稀释，分别制备浓度分别为0.01、0.08、0.16、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4μg/mL的CU、PTX及CU与PTX复合标准溶液。
2、建立标准曲线
分别精密吸取50μL标准溶液，加入5mL离心管中，分别加入大鼠空白组织匀浆(组织：生理盐水＝1:1，w/v)100μL，涡旋混合30s，加入25μL CA缓冲液(pH 3.6)，涡旋混合30s，加入0.5mL萃取剂(乙酸乙酯:甲醇＝90:10)，涡旋3min，离心3min(8000rpm/min)，取上清液。再次加入0.5mL萃取剂重复萃取一次，合并2次上清液。氮气吹干，加入200μL复溶剂[乙腈：磷酸(pH 3.5)]，涡旋混合4min，超声4min，10000rpm/min高速离心10min，取上清液160μL，进行HPLC检测。
以不同浓度的CU、PTX血药浓度C为横坐标，以不同浓度的CU、PTX的峰面积Y为纵坐标，进行直线回归，得回归方程及R2。标准曲线结果如图7所示。
上述HPLC分析方法条件，按照实施例1大鼠血浆样品HPLC分析方法条件。
实施例6：加标样品检测
1、加标大鼠组织样本前处理
(1)取空白大鼠，断颈处死，取出心、肝、脾、肺、肾、脑，加入生理盐水(组织：生理盐水＝1:1；w/v)研磨成匀浆，得各组织空白生物样品。
将CU、PTX及CU与PTX复合标准溶液加入100μL的空白大鼠组织样品(此处以心为例)，分别得到CU、PTX及CU-PTX复合品浓度为0.4000，1.0000，3.0000μg/mL的加标血浆样品。
(2)取加标组织样品100μL，按照实施例2的大鼠血浆样品前处理方法进行处理后，取上清160μL移入进样瓶中。
2、加标血浆样本检测
进样20μL，进行HPLC分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算CU单品、PTX单品及CU与PTX复合品中CU、PTX血浆样本浓度分别为：0.3411±0.0021，1.0057±0.0089，3.1916±0.0740；0.3260±0.0054，0.8148±0.0250，2.7434±0.1303；0.2696±0.0053，0.6488±0.0274，1.9858±0.2104；0.4472±0.0067，1.0745±0.0651，2.7712±0.1062，样本色谱图如图8所示。
表明本测定方法可以很准确的测定分析大鼠血浆中、PTX及CU与PTX复合品的浓度且色谱图中CU、PTX峰形平滑对称，无干扰峰，且CU和PTX两个峰相互分离，无干扰，色谱图稳定可靠，方法高效、稳定，可很好的满足大鼠组织中CU、PTX及CU与PTX联用药代动力学评估的需要。
实施例7：样本检测
1、Sprague-DawLey大鼠单次尾静脉注射CU、PTX、CU与PTX复合品及其制剂后药动学研究血浆样品前处理。
(1)分组后，依据实验设计的给药方案给药后(给药方案参见图5、6)，分别于于0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、L h、2h、4h、6h、8h、12h、24h时取血。取出全血(约1.5mL)放于含肝素钠采血管中，5000rpm/min离心3min取血浆待处理。
(2)取上述待处理血浆样品100μL，按照实施例1的血浆样品前处理方法进行处理后，取上清160μL移入进样瓶中。
2、Sprague-DawLey大鼠单次尾静脉注射CU、PTX、CU与PTX复合品及其制剂后药动学研究血浆样品检测。进样20μL，进行HPLC分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算血药浓度。
结果显示，尾静脉注射Sprague-DawLey大鼠血浆中各时间点CU、PTX药物浓度如图9所示。由图可知，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，可为CU、PTX及其制剂单独给药或者联合给药后大鼠血药浓度的测定提供依据。
实施例8：样本检测
1、家兔单次耳缘静脉注射CU、PTX、CU与PTX复合品(质量比为1:1和1:2)后药动学研究血浆样品前处理。
(1)分组后，依据实验设计的给药方案给药后，依据实验设计采样时间方案，大鼠心脏采血约1.5mL。血样品置于肝素化EP管中，全血经5000rpm离心3min吸取上层血浆，待血浆样品预处理。
(2)取加标血浆样品500μL，按照实施例3的血浆样品前处理方法进行处理后，取上清160μL移入进样瓶中。
2、家兔耳缘静脉注射CU、PTX、CU与PTX复合品(质量比为1:1和1:2)药动学研究血浆样品检测。进样20μL，进行HPLC分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算血药浓度。
结果显示，耳缘静脉注射大鼠血浆中各时间点CU、PTX药物浓度如图10所示。由图可知，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，可为CU、PTX单独给药或者两者联合给药后家兔血药浓度的测定提供依据。

Claims (7)

1.一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法，依次包括标准曲线的建立和样品检测两个步骤，其特征在于，HPLC分析方法的条件为：采用4.6 mm × 250 mm的Luna ® 5 μm C18色谱分析柱，采用梯度洗脱变波长方法：0 ~ 9.5 min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为55:45；9.51 ~ 11.5min时，检测波长为227 nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为40:60；柱温30℃，流动相流速为1 mL / min；所述磷酸缓冲液是由磷酸和三乙胺配制的pH=3.5的混合液；
还包括待测样本制备步骤，具体操作如下：向血浆样品或者匀浆后的动物组织样品中加入柠檬酸缓冲液，混合均匀，加入8～12倍的体积的萃取溶剂，混匀并离心，取有机层，氮气挥干，加入复合溶剂，混匀，离心取上清液即为供试液；所述萃取溶剂为乙酸乙酯和甲醇配制而成，两者的体积比为90:10。
2.如权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述HPLC分析方法的条件还包括：在11.51 ~ 19.0 min时，检测波长为425 nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为55:45。
3.如权利要求1或2所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述标准曲线的建立包括以下步骤：
（1）对照品溶液的配制：将姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇分别溶于甲醇，制备成相同浓度的姜黄素储备液、紫杉醇储备液及姜黄素和紫杉醇混合储备液，再用甲醇稀释为系列梯度浓度的标准溶液；
（2）标准曲线的建立：分别取系列浓度的姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇混合的标准溶液与待测样品对应的空白生物样品混合得混合液，并对混合液进行样品前处理得供试液，然后在所述HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，建立标准曲线。
4.如权利要求3所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述样品检测步骤为取待测样品进行样品前处理得到供试液，然后在所述的HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，根据上述标准曲线和峰面积计算样品中姜黄素和紫杉醇的浓度。
5.如权利要求4所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述复合溶剂为乙腈和磷酸缓冲液配制而成，两者体积比为75:25。
6.如权利要求5所述的HPLC分析方法，其特征在于，样品前处理的具体方法如下：
取定量混合液置于5 mL 离心管中，加入25 μL pH 3.6的 CA 缓冲液，涡旋混合30 s，加入定量萃取剂，萃取剂是体积比为90：10的乙酸乙酯和甲醇，涡旋3 min，8000 rpm/min离心3 min，取上清液；再次加入萃取剂重复萃取一次，合并2 次上清液；氮气吹干，加入200 μL 复合溶剂，复合溶剂是乙腈和pH 3.5的磷酸，涡旋混合4 min，超声4 min，10000 rpm/min离心10 min，取上清液20 μL 进行HPLC 检测。
7.如权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述待测样品为家兔样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:10，所述待测样品为大鼠样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:2。
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