CN109097029B - 一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的合成及其对利福平比率荧光检测的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的合成方法：首先采用水热还原法制备氨基保护的硅纳米粒子；然后采用搅拌还原法制备羧基保护的金纳米簇；最后将硅纳米粒子和金纳米簇进行自组装，合成比率荧光探针。本发明室温下自组装合成硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针，过程简单、易操作、条件温和、耗时短。本发明提供的硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针能够准确采用比率荧光方法检测利福平，将所述硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针用于检测人血清中的痕量利福平，结果表明其回收率为97.0%～103.5%，且相对标准差(RSDs)均低于4%。

Description

一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的合成及其对利福 平比率荧光检测的应用
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，尤其涉及一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的合成及其对利福平比率荧光检测的应用。
背景技术
利福平(RIF)，又名利发霉素、甲哌利福霉素、甲哌力复霉素、威福仙、仙道伦、力复平或利米定。化学名称为3-[[（4-甲基-1-哌嗪基）亚氨基]甲基]-利福霉索。RIF是一种所属利福霉素家族的广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用。RIF与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止。该抗生素对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。RIF对需氧革兰阳性菌具有良好抗菌作用，包括葡萄球菌产酶株及甲氧西林耐药株、肺炎链球菌、其他链球菌属、肠球菌属、李斯特菌属、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌、白喉杆菌、厌氧球菌等。然而RIF作为结核病的有效药物，长期服用也会对人体肝肾功能造成损伤，过量服用RIF会引起精神迟钝和各类皮肤综合症。有原发肝病者，酗酒者或同服其他肝毒性药物者可能引起死亡。RIF在人体内的运输主要依赖于血液中的血清蛋白，所以开发在人血清中能够高选择性、高灵敏度检测RIF的方法是十分必要的。
目前检测RIF痕量的方法主要有高效液相色谱法、电化学法、核磁共振波谱法和分光光度法。但是这些方法大多需要昂贵的设备或者是需要大量时间来进行前期准备工作。目前荧光检测技术具有选择性好、灵敏度高、易操作、经济实用等优点，已经被广泛用于痕量检测、荧光标记等领域。传统的荧光探针主要由有机染料分子构成，具有荧光亮度低，光稳定性和耐光漂白能力差等缺点，限制了荧光检测技术的进一步发展与应用。近年来出现的纳米荧光探针包括荧光硅纳米粒子(SiNPs)和金纳米簇(AuNCs)等，具有较高的荧光量子产率，良好的光稳定性和抗光漂白能力，生物相容性好、合成与修饰简单等优点，成为替代传统荧光探针的新型荧光探针。目前纳米荧光探针在检测过程中，通常基于单一荧光强度变化，这种方法易受到检测仪器以及测试环境的干扰。具有比率荧光特性的新型纳米比率荧光探针采用基于两种不同发射波长的荧光强度比值对目标物进行检测，利用比率荧光的自校准作用能够有效排除所述外部干扰因素。因此采用比率荧光探针可以更加准确地对人血清中RIF进行痕量检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种硅纳米粒子/金纳米簇（SiNPs/AuNCs）比率荧光探针的合成及其对RIF比率荧光检测的应用。本发明中比率荧光探针由两部分组成，分别为氨基保护的硅纳米粒子（SiNPs）和羧基保护的金纳米簇（AuNCs）。本发明中比率荧光探针直接通过具有不同发射波长的SiNPs与AuNCs进行自组装实现，过程简单、易操作，条件温和、耗时短；制备得到的SiNPs/AuNCs比率荧光探针能够通过比率荧光方法应用于RIF的痕量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种SiNPs/AuNCs比率荧光探针的合成方法，包括以下步骤。
（1）采用水热法制备氨基保护的SiNPs
（a）将水溶性硅源、还原剂和水混合，得到初混物；
（b）将所述步骤（a）中初混物在室温下搅拌10～20 min，得到反应前驱体；
（c）将所述步骤（b）中的反应前驱体放入体积为20 mL的特氟龙内衬的反应釜中，于 220～240℃下水热反应 1～3 h，得到氨基保护的SiNPs。
（2）采用搅拌还原法制备羧基保护的AuNCs
（a）将氯金酸（HAuCl4·3H2O）、巯基十一酸（MUA）及水混合，得到初混物；
（b）采用pH调节剂调节所述步骤（a）中初混物的 pH 值为 10～12，得到反应前驱体；
（c）将所述步骤（b）中的反应前驱体在室温下进行搅拌，反应 4～7 h，得到羧基保护的AuNCs。
（3）将所述步骤（1）和（2）中的SiNPs和AuNCs进行自组装，合成SiNPs/AuNCs比率荧光探针
（a）将SiNPs和AuNCs在缓冲溶液中混合，得到初混物；
（b）在室温下将所述步骤（a）中初混物混匀并孵育0.5～2 h，得到SiNPs/AuNCs比率荧光探针。
优选的，所述步骤（1）中所采用的水溶性硅源包括3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）或3-氨丙基三甲氧基硅烷 （APTMS）。
优选的，所述步骤（1）中所采用的还原剂包括抗坏血酸(AA)或柠檬酸钠。
优选的，所述步骤（1）中还原剂与水溶性硅源的摩尔比为1:（50～150），其中还原剂的物质的量浓度为100 mM。
优选的，所述步骤（2）中调节初混物 pH 值所采用的 pH 调节剂包括氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
优选的，所述pH 调节剂的浓度为 1.0～1.2 M。
优选的，所述步骤（2）中HAuCl4·3H2O与MUA的摩尔比为1:(4～8)，最终初混物中HAuCl4·3H2O的物质的量的浓度为500 μM。
优选的，所述步骤（3）中缓冲溶液包括HEPES、Tris-HCl以及PBS 缓冲溶液，pH值范围为7.0～8.0。
优选的，所述步骤（3）中SiNPs与AuNCs的质量比为200:1，其中优选的SiNPs质量浓度为4 mg/mL；AuNCs质量浓度为20 μg/mL。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的一种SiNPs/AuNCs比率荧光探针，包括SiNPs和AuNCs，过程简单、易操作，条件温和、耗时短。优选的基于所述步骤（3）合成的SiNPs/AuNCs比率荧光探针，采用激发波长为300～310 nm，发射波长在440～445 nm左右以及610～615 nm左右，具有比率荧光特征（如图3所示）。
本发明提供了一种SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF进行比率荧光检测的应用。AuNCs被MUA保护及修饰，MUA中含有的羧基功能团螯合RIF，导致SiNPs/AuNCs比率荧光探针中最强发射波长在610～615 nm左右的荧光（I 615）猝灭；而最强发射波长在440～445 nm左右的荧光（I 440）强度保持不变（如图4所示）。说明SiNPs/AuNCs比率荧光探针能够采用比率荧光方法即荧光强度比值（I 615/I 440）的变化可以实现对RIF的比率荧光检测。常见的阴、阳离子以及20种天然氨基酸对SiNPs/AuNCs比率荧光探针检测RIF没有影响，说明所述比率荧光探针能够对RIF实现特异性识别与检测。将所述复合纳米比率荧光探针用于检测人血清中痕量RIF，结果表明其回收率为97.0% ～103.5%，且相对标准差(RSDs) 均低于4%。
附图说明
图1为实施例 1 中 AA与APTES溶液摩尔比对SiNPs荧光强度影响的柱形图；
图2为实施例 2 中 HAuCl4·3H2O与MUA摩尔比对AuNCs荧光强度影响的柱形图；
图3为实施例3中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针发射荧光谱图；
图4为实施例 3中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值（I 615/I 440）随RIF浓度变化的荧光光谱图；
图5为实施例4中所述的加入20 μM RIF后的SiNPs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值（I 615/I 440），随孵育时间变化的曲线图；
图6为实施例 5中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值（I 615/I 440）随RIF浓度变化的关系曲线图；
图7 为实施例6中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF荧光响应在阴、阳离子中的选择性分析柱形图；
图8 为实施例7中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF荧光响应在20种天然氨基酸中的选择性分析柱形图。
具体实施方式
本发明提供了一种SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF进行比率荧光检测的应用，包括以下步骤：
（1）采用水热还原法制备氨基保护的SiNPs；
（2）采用搅拌还原法制备羧基保护的AuNCs；
（3）将所述步骤（1）和（2）中的SiNPs与AuNCs进行自组装，合成SiNPs/AuNCs比率荧光探针。
本发明所述步骤（1）中将水溶性硅源、还原剂和水混合，得到初混物。在本发明中所述还原剂与水溶性硅源的摩尔比优选为1:（50～150）；更优选为1:（75～150）；最优选为1:（75～100），其中还原剂的物质的量浓度为100 mM。在本发明中，所述的水溶性硅源包括3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）或3-氨丙基三甲氧基硅烷 （APTMS）。在本发明中，所述的还原剂包括抗坏血酸(AA)或柠檬酸钠。在本发明中，所述水优选为超纯水。
本发明对于所述水溶性硅源、还原剂和水的混合方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的物料混合的技术方案即可。在本发明中，本发明优选先将水溶性硅源和水混合，所得混合物再与还原剂混合，以保证物料充分混合。
得到初混物后，将所述初混物在室温下搅拌10～20 min，得到反应前驱体；将所述反应前驱体放入体积为20 mL特氟龙内衬的反应釜中，于 220～240 ℃下水热反应 1～3h，得到氨基保护的SiNPs。在本发明中，水热温度优选为220～240 ℃，更优选为225～240℃，最优选为235～240 ℃。反应时间优选为1～3 h，更优选为2～3 h，最优选为2.5～3 h。
本发明所述步骤（2）中将HAuCl4·3H2O、MUA及水混合，得到初混物。在本发明中，所述HAuCl4·3H2O与MUA的摩尔比优选为 1:（4～8）；更有选为1:（4～7）；最优选为1:（5～6），最终初混物中HAuCl4·3H2O的物质的量的浓度为500 μM。在本发明中，所述水优选为超纯水。
本发明对于所述HAuCl4·3H2O、MUA和水的混合方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的物料混合的技术方案即可。在本发明中，本发明优选先将HAuCl4·3H2O和水混合，所得混合物再与MUA混合，搅拌10～15 min，以保证物料充分混合。
得到初混物后，本发明调节所述初混物的 pH 值为10～12，得到反应前驱体。在本发明中，所述pH 调节剂包括氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。在本发明中，所述pH 调节剂的浓度优选为 1.0～1.2 M；更优选为1.0～1.1 M；最优选为1.0～1.05 M。
所述反应前驱体在室温下进行搅拌，反应 4～7 h，得到羧基保护的AuNCs。本发明中，反应时间优选为4～7 h，更优选为5～7 h，最优选为5～6 h。
本发明对于进行所述水热反应以及搅拌还原反应所采用的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的用于进行水热以及搅拌还原反应的设备即可。具体的，本发明采用特氟龙内衬的反应釜进行水热反应，采用DF-101S 集热式恒温搅拌器作为搅拌还原反应设备。
完成所述反应后，本发明优选对得到的反应物料进行后处理，得到固相SiNPs及AuNCs。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所得水热及搅拌还原反应物料依次进行透析和干燥，分别得到固相SiNPs及AuNCs。本发明优选采用 3500 Da分子量的透析袋进行所述透析；所述透析的时间优选为 20～28 h，更优选为 22～26 h，最优选为22～24h。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥；所述真空干燥的温度优选为35～45 ℃，更优选为 40 ℃；所述真空干燥的时间优选为 10～24 h，更优选为15～20 h；所述真空干燥的真空度优选为-0.1 MPa。
本发明所述步骤（3）中将所述固相SiNPs、AuNCs及缓冲溶液混合，得到初混物。 本发明中，所述SiNPs/AuNCs的质量比最优选为200:1，其中，SiNPs质量浓度为4 mg/mL;AuNCs质量浓度为20 μg/mL。本发明对于所述SiNPs、AuNCs和缓冲溶液的混合方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的物料混合的技术方案即可。在本发明中，本发明优选先将所述固相SiNPs和缓冲溶液混合；再与AuNCs进行混合。
在室温下将所述初混物混匀并孵育0.5～2 h,得到自组装的SiNPs/AuNCs比率荧光探针。本发明中，所述缓冲溶液包括HEPES、Tris-HCl以及PBS 缓冲溶液，pH值范围优选为7.0～8.0；更优选为7.0～7.5。混匀并放置时间优选为0.5～1 h；更优选为0.5～0.6 h。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的SiNPs/AuNCs比率荧光探针，包括SiNPs和AuNCs两种荧光材料。两种荧光纳米材料通过自组装技术形成具有两种不同发射波长的比率荧光探针。
本发明提供了上述技术方案所述的SiNPs/AuNCs比率荧光探针在比率荧光检测RIF中的应用。在本发明的实施例中，具体是在 HEPES 缓冲溶液（pH为7.4）中加入所述SiNPs/AuNCs比率荧光探针（其中SiNPs浓度为4 mg/mL；AuNCs浓度为20 μg/mL），然后分别加入不同浓度的RIF，在孵育18 min后，得到RIF浓度分别为0、0.1、0.5、1、2、3、5、10、20 μM的待测液体，在室温条件下进行荧光测试（激发波长为 300 nm）。以 615 nm和440 nm 处荧光强度比值（I 615/I 440）为纵坐标，RIF的物质的量浓度（C）为横坐标建立所述SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF检测的线性曲线（如图6所示）。所述线曲线具体为I 615/I 440=-0.034036C+3.9377。440 nm 和615 nm处的荧光强度比值（I 615/I 440）对于RIF的物质的量浓度（C）的线性响应在 0.1～5 μM（R2 =0.99952）之间，检测限为0.04 μM。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实例1
将不同物质的量的APTES与12 mL水混合，得到APTES溶液。分别加入30 μL的物质量浓度为100 mM 的AA，使AA与APTES的摩尔比分别为1:50、1:75、1:100以及1:150，搅拌10min；放入20 mL的特氟龙内衬的反应釜中，于240 ℃水热反应3 h，得到SiNPs荧光探针。
图1为AA与APTES溶液体积比对SiNPs荧光强度影响的柱形图。由图1可知，当AA与APTES的摩尔比为1:100时，SiNPs荧光探针的荧光强度最高。
实例2
将不同体积浓度为10 mM的HAuCl4·3H2O与10 mL的水混合，得到HAuCl4·3H2O溶液，分别加入不同量的MUA和100 μL的物质量浓度为1 M的NaOH，使HAuCl4·3H2O与MUA的摩尔比分别为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，搅拌5 h，得到AuNCs荧光探针。
图2为HAuCl4·3H2O与MUA溶液体积比对AuNCs荧光强度影响的柱形图，由图1可知，当HAuCl4·3H2O与MUA溶液的摩尔比为1:6时，AuNCs荧光强度最高。
实例3
将所述固相SiNPs 加入到HEPES缓冲溶液中(pH～7.4)，使其质量浓度为4 mg/mL，再加入固相AuNCs，使其质量浓度为20 μg/mL，混匀且孵育0.5 h，得到SiNPs/AuNCs比率荧光探针。
图3为所述SiNPs/AuNCs比率荧光探针发射荧光光谱图。由图3可知，在波长为300nm的激发光谱下，SiNPs/AuNCs比率荧光探针的发射光谱峰位分别在～440 nm及～615 nm。
实例4
SiNPs/AuNCs比率荧光探针(其中SiNPs浓度为4 mg/mL; AuNCs浓度为20 μg/mL)的HEPES缓冲溶液(pH～7.4)中加入20 μM RIF。得到不同孵育时间对SiNPs/AuNCs比率荧光探针的荧光强度的影响。
图5为所述的SiNPs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值（I 615/I 440）在加入20 μMRIF后，随孵育时间变化的曲线图。由图5可知，随着时间的增加，所述的SiNPs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值（I 615/I 440）逐渐减小最后在孵育18 min后达到稳定。
实例5
HEPES 缓冲溶液（pH为7.4）中加入所述SiNPs/AuNCs比率荧光探针（其中SiNPs浓度为4 mg/mL，AuNCs浓度为20 μg/mL），然后分别加入不同浓度的RIF，在孵育18 min后，得到RIF浓度分别为0、0.1、0.5、1、2、3、5、10、20 μM的待测液体，在室温条件下进行荧光测试（激发波长为 300 nm）。以 615 nm和440 nm 处荧光强度比值（I 615/I 440）为纵坐标，RIF的物质的量浓度（C）为横坐标建立所述SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF检测的线性曲线（如图7所示）。所述线曲线具体为I 615/I 440=-0.034036C+3.9377。440 nm 和615 nm处的荧光强度比值（I 615/I 440）对于RIF的物质的量浓度（C）的线性响应在 0.1～5 μM（R2 =0.99952)之间，检测限为0.04 μM。
实例6
将20 μM不同的常见离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、CO3 2-、PO4 3-）分别加入到的SiNPs/AuNCs比率荧光探针溶液（其中SiNPs浓度为4 mg/mL，AuNCs浓度为20 μg/mL）中，孵育18 min，得到不同离子对RIF选择性的影响。
图7 为实施例6中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF荧光响应在阴、阳离子中的选择性分析柱形图。由图7可知，各种常见阴、阳离子对RIF的选择性并没有显著影响。
实例7
将常见的20种天然氨基酸（甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、色氨酸Trp、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、蛋氨酸Met、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln、苏氨酸Thr、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His）分别加入到SiNPs/AuNCs比率荧光探针溶液中（其中SiNPs浓度为4 mg/mL，AuNCs浓度为20 μg/mL），其中氨基酸浓度为20 μM，孵育18 min，得到不同氨基酸对RIF选择性的影响。
图8 为实施例7中所制备的SiNPs/AuNCs比率荧光探针对RIF荧光响应在20种天然氨基酸中的选择性分析柱形图。由图8可知，20种天然氨基酸对RIF荧光响应没有显著影响。
实例8
将不同浓度的RIF（1.00、2.00、4.00 μM）分别加入到SiNPs/AuNCs比率荧光探针（其中SiNPs浓度为4 mg/mL，AuNCs浓度为20 μg/mL）的人血清进行实物检测，可以得到样品一中RIF浓度为0.97 μM，回收率为97 %，相对标准差为3.4 %。检测样品二中的RIF浓度为2.07 μM，回收率为103.5 %，相对标准差为2.6 %。检测样品三中RIF浓度为4.11 μM，回收率为102.8 %，相对标准差为2.1 %。且三者的相对标准差(RSDs) 均低于4 %。由此说明SiNPs/AuNCs比率荧光探针可以应用在实物检测中（如表1所示）。
表1采用SiO2NPs/AuNCs比率荧光探针来测量人血清中RIF的痕量数据
Figure 495887DEST_PATH_IMAGE001
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)采用水热还原法制备氨基保护的硅纳米粒子：(a)将水溶性硅源、还原剂和水混合，得到初混物；(b)将所述步骤(a)中初混物在室温下搅拌10～20min，得到反应前驱体；(c)将所述步骤(b)中的反应前驱体放入体积为20mL的特氟龙内衬的反应釜中，于220～240℃下水热反应1～3h，得到氨基保护的硅纳米粒子；
(2)采用搅拌还原法制备羧基保护的金纳米簇：(a)将氯金酸HAuCl4·3H2O、巯基十一酸MUA及水混合，得到初混物；(b)采用pH调节剂调节所述步骤(a)中初混物的pH值为10～12，得到反应前驱体；(c)将所述步骤(b)中的反应前驱体在室温下进行搅拌，反应4～7h，得到羧基保护的金纳米簇；
(3)将所述步骤(1)和(2)中的硅纳米粒子与金纳米簇进行自组装，合成硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针：(a)将硅纳米粒子和金纳米簇在缓冲溶液中混合，得到初混物；(b)在室温下将所述步骤(a)中初混物混匀并孵育0.5～2h，得到硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针；
所述步骤(1)中还原剂与水溶性硅源的摩尔比为1:(50～150)，其中还原剂的物质的量浓度为100mM；所述步骤(2)中HAuCl4·3H2O与MUA的摩尔比为1:(4～8)，最终初混物中HAuCl4·3H2O的物质的量的浓度为500μM；所述步骤(3)中硅纳米粒子与金纳米簇的质量比为200:1，其中硅纳米粒子质量浓度为4mg/mL；金纳米簇质量浓度为20μg/mL。
2.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水溶性硅源包括3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES或3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS；还原剂包括抗坏血酸AA或柠檬酸钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中调节初混物pH值所采用的pH调节剂包括氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；pH调节剂的浓度为1.0～1.2M。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中缓冲溶液包括HEPES、Tris-HCl以及PBS缓冲溶液；缓冲溶液pH值范围为7.0～8.0。
5.权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到的硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针，包括硅纳米粒子和螯合于硅纳米粒子表面的金纳米簇。
6.根据权利要求5所述的硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针，其特征在于，所述硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针，得到最强激发波长为300～310nm，最强发射波长在440～445nm以及610～615nm，具有比率荧光特征。
7.权利要求5或6所述的硅纳米粒子/金纳米簇比率荧光探针在比率荧光检测利福平中的应用。
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