CN109096394B

CN109096394B - 一种抗葡萄球菌蛋白a的b亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

Info

Publication number: CN109096394B
Application number: CN201811106346.4A
Authority: CN
Inventors: 陈波; 罗紫豪
Original assignee: Chengdu Apak Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Apak Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN109096394A

Abstract

本发明公开了一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用，涉及基因工程抗体技术领域。本发明公开的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该纳米抗体具有与葡萄球菌蛋白A特异性结合的活性，其具有广阔的应用前景：(1)用于检测蛋白A残留及纯化，(2)作为蛋白纯化、检测的通用标签，用于蛋白的纯化，(3)用于蛋白A的B亚单位标签蛋白的纯化与检测；此外该纳米抗体还具有分子量小、亲和力高、结构和性能稳定等特点。

Description

一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

技术领域

本发明涉及纳米抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(Staphylococal ProteinA，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。SPA包括A、B、C、D、E等5个同源结构域，每个结构域都有与大多数哺乳动物IgG的Fc区独立结合的能力。目前的耐碱性SPA主要集中在B domain(B结构域或称B亚单位)。

B亚单位是含有58个氨基酸的多肽，一级结构中不含有二硫键，重折叠时间仅为3μs，具有较强的复性能力；荧光素、生物素等报告基团可精确交联或融合B亚单位特定定位置而不影响其亲和能力，因此可以作为一种蛋白标签，方便蛋白相互作用的研究。然而市面上还未有针对葡萄球菌蛋白A的B亚单位的亲和配体，虽然大多数哺乳动物的IgG FC端可以作为B亚单位的亲和配体，但是两者亲和力低，Fc耐逆性弱。其次蛋白A存在于生物制药(如抗体、重组蛋白、疫苗等)的纯化过程中常用的一些填料中。尽管葡萄球菌蛋白A是以共价键的形式连接在填料里，但葡萄球菌蛋白A还是很容易通过色谱洗脱生物药的过程中被一起浸出。生物药中被葡萄球菌蛋白A污染了则会对药物产生很多的负面影响，为了减少葡萄球菌蛋白A对生物药的影响，因此，在生物制药纯化过程中，葡萄球菌蛋白A的含量是很关键的一个参数，需要建立快速灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供一种偶联物。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述纳米抗体的方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测葡萄球菌蛋白A的试剂。

本发明的另一目的在于提供上述的纳米抗体的应用。

本发明的另一目的在于提供一种通用的蛋白纯化与检测的标签。

本发明是这样实现的：

羊驼血清中存在的一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)。单域重链抗体(single domain antibody，sdAb)是指仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，又称为VHH抗体(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，VHH antibody)或纳米抗体(Nanobody，Nb)。与传统抗体相比，单域抗体具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点，其次天然缺失轻链，洗脱时不会像传统抗体那样造成轻链脱落造成二次污染，因此可作为葡萄球菌蛋白A的新一代的亲和纯化配体，用于蛋白的纯化，蛋白A的检测等领域。抗B亚单位的纳米抗体具有高亲和力，高特异性，抗逆行强，非常适合B domin的亲和配体。但目前尚缺乏针对葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体。

本发明提供了一种纳米抗体，其来源自羊驼血清，是一种单域抗体，具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点。该纳米抗体可结合葡萄球菌蛋白A的B亚单位，其可作为葡萄球菌蛋白A的新一代的亲和纯化配体，用于蛋白例如葡萄球菌蛋白A的纯化、检测等领域中。

本发明的一方面涉及一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，本发明的纳米抗体的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.1所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，且具有与SEQ ID NO.1相同生物活性例如与葡萄球菌蛋白A特异性结合的活性或者是活性加强或者活性减弱的衍生序列。这类衍生序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子编码上述的抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

对本领域技术人员而言，根据密码子的简并性，容易在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的衍生序列，以使编码出本发明提供的SEQ ID NO.1所示的纳米抗体。因此，在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的编码出本发明提供的纳米抗体的衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种载体，其含有上述的分离的核酸分子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述载体包括但不限于克隆载体和表达载体。

本发明的另一方面涉及一种宿主细胞，其含有上述的载体。

本发明的另一方面涉及一种偶联物，该偶联物含有上述的纳米抗体。

本发明的另一方面涉及一种制备上述的纳米抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述制备方法还包括：从细胞培养物中纯化得到上述抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体。

在本发明公开了抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易通过基因工程技术、化学合成等方法得到本发明的抗葡萄球菌蛋白A纳米抗体，其相应的制备方法均属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种检测葡萄球菌蛋白A的试剂，其包括上述的纳米抗体，或者上述的偶联物。

本发明的另一方面涉及上述的抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体在检测葡萄球菌中的应用。

本发明的再一方面涉及上述的抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体在以葡萄球菌蛋白A的B亚单位为靶点检测葡萄球菌中的应用。

本发明的再一方面涉及上述的抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体作为蛋白的通用标签，用于蛋白的纯化，免疫共沉淀或亲和力检测中的应用。

本发明的再一方面涉及上述的抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体作为B亚单位的亲和纯化配体，用于B亚单位标签蛋白的纯化与检测中应用。

本发明的再一方面涉及上述的纳米抗体作为亲和配体在纯化葡萄球菌蛋白A的B亚单位中应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体具有与葡萄球菌蛋白A特异性结合的活性，尤其是与葡萄球菌蛋白A的B亚单位结合的活性，其具有广阔的应用前景，例如：(1)用于检测蛋白A残留及纯化，(2)作为蛋白纯化、检测的通用标签，用于蛋白的纯化和检测，(3)用于蛋白A的B亚单位标签蛋白的纯化与检测；此外该纳米抗体还具有分子量小、亲和力高、结构和性能稳定等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的洗脱液的电泳结果。

图2为本发明实施例4中的West-blot检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体的筛选

1免疫：

取健康成年羊驼，将葡萄球菌蛋白A的B亚单位与佐剂混合后，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，免疫程序如表1所示，第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

表1羊驼免疫程序

2羊驼淋巴细胞分离：

在15mL离心管中加入6mL淋巴细胞分离液，再加入等体积的全血样品，800g常温离心20min；

小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入2倍体积的PBS,800g,常温离心15min；

小心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；450g常温离心15min，去上清并计数，按10⁷个淋巴细胞加入2mL Trizol充***解，备用。

3总RNA提取：

向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡20s充分乳化，冰上静止10min；4℃，12000g离心10min，取上清转移至另一新鲜离心管中；

加入等体积的异丙醇，充分混匀后冰上静止10min；4℃12000g离心10min，弃上清，加入75％的乙醇，充分混匀；

4℃，12000g离心10min，去上清；室温干燥5min，加入适量RNase-free水溶解沉淀，待RAN沉淀完全溶解后于-80℃保存。

4cDNA合成：

反转录体系如下：

步骤1：按如下表中体系配制反应液

混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；

步骤2：按如下表中体系配制cDNA反应液；

混匀后，按如下条件反转录：25℃10min；50℃，50min；85℃，5min；离心后每管加入1μL RNase H 37℃，20min。

5抗体基因扩增

巢氏第一轮PCR体系如下：

5×HS buffer	10μL
		Alpvh-LD	1μL
CH<sub>2</sub>-R	1μL
		酶	0.5μL
dNTP	4μL
		cDNA	0.5/1/2/4μL
ddH<sub>2</sub>O	补齐至25μL

反应程序：94℃，5min；98℃10s，55℃15s，72℃1min，共30循环；反应结束后，凝胶电泳，割胶回收750bp左右的目的片段。

其中：Alpvh-LD序列(5’-3’)如下：CTTGGTGGTCCTGGCTGC；

CH₂-R序列(5’-3’)如下：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。

巢氏第二轮PCR体系如下

94℃，5min；98℃10s，57℃15s，72℃45s，共30循环。

其中，AlpVh-F1序列(5’-3’)如下:

CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC；

AlpVHH-R1(5’-3’):

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG；

AlpVHH-R2(5’-3’):

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG。

第二轮反应结束后，凝胶电泳，PCR产物回收试剂盒回收目的片段，目的片段约500bp，进行双酶切。

6文库构建：

6.1载体和目的片段酶切

目的片段双酶切体系(160μL体系)如下：

目的片段	15ug
		SfiI酶	5μL
ddH<sub>2</sub>O	4μL
		cutsmart	10μL
Total	160μL

50℃酶切过夜。

载体双酶切体系(160μL)如下：

pcomb3XSS	50μL(25μg)
		sfiI酶	5μL
ddH<sub>2</sub>O	90μL
		cutsmart	8μL

6.2载体与目的片段的连接

50μL连接体系如下：

16℃连接过夜，加入5μL(1/10量)的3M CH₃COONa(pH 5.2)和125μL(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃静置30-60min，12000g离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于15μL去离子水中。

7电转化：

(1)将感受态细胞TG1 100μL置于冰上融化，加入1μL连接产物轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)将上述混合液转入0.2cm的电击杯中，调节电击参数：电压为2.5kV，电场强度为2.5kV/cm，电击转化；

(3)立即向电击杯中加入1mL SOC培养基，悬浮细胞，37℃180r/min培养1h进行细胞复苏；

(4)将复苏培养物10倍梯度稀释后均匀涂布于SOB-AG平板，37℃倒置培养过夜。

8抗蛋白纳米抗体亲和淘选：

1)将葡萄球菌蛋白A的B亚单位用PBS稀释至终浓度为2μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；

2)弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；

3)PBS洗涤6次，加入100μL包装的噬菌体文库，噬菌体数量约为2×10¹¹cfu，37℃孵育1h；

4)吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，PBS洗涤3次；

5)加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用50μL Tris-HCl中和缓冲液中和；

7)取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。

8)将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表2。

表2亲和淘选条件

9特异性噬菌体克隆的鉴定：

1)从第三轮淘选洗脱物滴度的平板上(菌落数30～200个)，用灭菌牙签随机挑取48个单克隆接种于1mL 2×YT-GA中，进行扩增。

2)调节葡萄球菌蛋白A的B亚单位pH至14，100℃加热处理20min，将其失活然后稀释至2μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；

3)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 3％脱脂牛奶，37℃封闭2h；

4)PBST洗涤3次，加入100μL/孔的培养上清，37℃，孵育1h；

5)PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用3％脱脂牛奶，按1:5000稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；

6)PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。OD₄₅₀大于1.0的为阳性克隆。

7)挑取阳性克隆测序，基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码的纳米抗体的氨基序列如SEQ ID NO.1所示。

10抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体表达纯化：

(1)将筛选到的SEQ ID NO.2所示亚克隆至pET-22b⁺载体上，酶切位点为NcoI和NotI，命名为VHH-pET22b⁺。将重组质粒VHH-pET22b⁺转化大肠杆菌Rosetta DE3表达菌株中，挑取单克隆菌株接种于4mL LB-Amp培养基，37℃250rpm培养4～5h；

(2)按照1％(V/V)接种于100mL LB-Amp-0.2％Glu培养基(用500mL摇瓶)，37℃250rpm培养至OD600约0.5；

(3)加入终浓度0.1mM IPTG，30℃220rpm诱导过夜；

(4)12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，-20℃保存备用；

(5)取上述菌，加结合Buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl)重悬；每100mL菌液用30mL结合Buffer；

(6)超声破碎菌体；超声条件为：25～35min、超声5s间隔7s、功率35％；

(7)12000rpm 4℃离心20min，取上清，过0.45μm滤膜以用于纯化。

11抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体的纯化：

(1)纯化过程中使用到的所有试剂均需要提前过0.45μm滤膜，以防柱子发生堵塞；

(2)加8～10个柱体积超纯水清洗Ni柱；

(3)加8～10个柱体积结合Buffer(50mM NaH₂PO₄+500mM NaCl)平衡柱子；

(4)将过膜后的样品加入到Ni柱中，收集流出液；

(5)加8～10个柱体积结合Buffer平和柱子；

(6)依次用含50mM，100mM，250mM和500mM咪唑的结合Buffer洗脱纳米抗体，其中，各咪唑浓度的洗脱体积依次为5mL、4mL、4mL和6mL；收集洗脱液。电泳，结果见图1。图中，M：蛋白marker，泳道1：纯化的纳米抗体。可以看出，该纳米抗体的分子量在15KD左右，与预测大小相符。

(7)加5mL 500mM咪唑溶液彻底清洗柱子；

(8)加8～10个柱体积结合Buffer清洗(平衡)Ni柱；

(9)8～10柱体积超纯水清洗Ni柱；

(10)20％乙醇保存柱子。

实施例2

本实施例提供了一种含抗葡萄球菌蛋白A纳米抗体的偶联物，可用于纯化蛋白A的B亚单位及带有B亚单位的标签蛋白。该偶联物包括实施例1提供的抗葡萄球菌蛋白A的纳米抗体和偶联部，偶联部为琼脂糖微球上的NHS。该偶联物的制备方法如下：

将NHS活化的琼脂糖用0.1M HCl洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液10mMNa₂HPO₄，pH 7.4洗涤10次，加入纯化的抗葡萄球菌蛋白A纳米抗体4mg/mLNHS活化的琼脂糖微球，4℃过夜反应，使纳米抗体共价偶联到NHS活化的琼脂糖微球。用偶联的缓冲液洗涤3次，加入1M Tris buffer pH 8.8，封闭未反应的活性基团。用10mM Na₂HPO₄，pH 7.4洗涤3次，既得到葡萄球菌蛋白A的B亚单位的免疫亲和吸附材料即含抗葡萄球菌蛋白A纳米抗体的偶联物，吸附材料加入20％乙醇，4℃保存。该免疫亲和吸附材料可以纯化及检测带有B亚单位标签的蛋白。

实施例3

本实施例提供了一种新的通用蛋白纯化及检测标签，可对带有B亚单位的蛋白例如葡萄球菌蛋白A进行方便的纯化。具体方案如下：

将SEQ ID NO.2的序列克隆到质粒pet-25b(+)的Not I与XhoI酶切位点之间，然后将目的基因***到多克隆位点NcoI与NotI之间，测序正确后，转入到BL21DE3菌株中进行表达。然后破碎细胞，采用葡萄球菌蛋白A进行亲和纯化，纯化的蛋白采用pH2.2 Gly-HCL进行洗脱，即可得到目标蛋白。该蛋白可以通过葡萄球菌蛋白A(HRP conjugated)进行检测。

实施例4

蛋白之间的亲和力检测通用标签

本实施例提供了一种方便且通用的方法研究蛋白与蛋白之间的亲和力检测方法。具体方案如下:

研究的蛋白中的一种采用实施例2中的方法，加上标签，然后通过葡萄球菌蛋白A金膜固定到固相载体上，通过SPR仪器，检测与另外一种或多种蛋白的相互作用力。

West-blot检测抗体特异性

将2ng葡萄球菌蛋白A转膜至PVDF上，封闭后加入0.2μg/mL表达纯化的纳米抗体，室温孵育2h，然后加入1:5000抗纳米抗体二抗，室温孵育45min。然后电泳，结果见图2，由图2可知SEQ ID NO.1所示的纳米抗体能够特异结合葡萄球菌蛋白A。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都阿帕克生物科技有限公司

<120> 一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Thr Trp Ser

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Phe Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Ser Thr Leu Ala Thr Met Ser Glu Arg Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro Gln

115 120 125

<210> 2

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggttaaac tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60

tcttgcgctg cttctggttt cgttttcacc tggtctggta tgtcttgggt tcgtcaggct 120

ccgggtaaag aactggaatg gctgtctggt atctctttcc gtggtgacac ctactacgct 180

gactctgtta aaggtcgttt caccatctct cgtgacaacg ctaaaaacac cctgtacctg 240

cagctgaact ctctgaaaac cgaagacacc gctatgtact actgcgctaa aggttctacc 300

ctggctacca tgtctgaacg tggtcagggt acccaggtta ccgtttcttc tgctcaccac 360

tctgaagacc cgcag 375

Claims

1.一种抗葡萄球菌蛋白A的B亚单位的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的的纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子。

5.一种偶联物，其特征在于，其含有权利要求1所述的纳米抗体。

6.一种制备权利要求1所述的纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养含有权利要求4所述的载体的细胞。

7.一种检测葡萄球菌蛋白A的试剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的纳米抗体，或者权利要求5所述的偶联物。

8.权利要求1所述的纳米抗体作为通用标签在蛋白纯化、免疫共沉淀和亲和力检测中的应用。

9.权利要求1所述的纳米抗体作为亲和配体在纯化葡萄球菌蛋白A的B亚单位中应用。