CN109096374B - 一种抑制肺癌转移的合成寡肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制肺癌转移的合成寡肽。肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。本发明提供的寡肽可以通过抑制NGAL基因表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以制成防治肺癌转移、治疗肺癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，涉及一种抑制肺癌转移的合成寡肽。
背景技术
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。
侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。
发明内容
本发明旨在提供一种抑制肺癌转移的合成寡肽。
本发明技术方案如下：
一种寡肽，其特征在于：序列如Sequence NO.4所示。
上述寡肽用作NGAL基因表达抑制剂的用途。
上述寡肽用于制备防治肺癌转移的药物的用途。
上述寡肽用于制备治疗肺癌的药物的用途。
有益效果：
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。本发明提供的寡肽可以通过抑制NGAL基因表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以制成防治肺癌转移、治疗肺癌的药物。
附图说明
图1为寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响；
图2为寡肽1～5对肺癌A549细胞增殖的影响；
图3为寡肽1～5对肺癌A549细胞迁移能力的影响；
图4为寡肽1～5对肺癌A549细胞侵袭能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
寡肽1～5委托外包机构合成，纯度不低于95％，序列如下：
寡肽1：RCRVFYKPWVRHQMRGRYN(Sequence NO.1)；
寡肽2：HPWYRKWNYRVRWRGWFMR(Sequence NO.2)；
寡肽3：QDRKWSYKSSYFRKRGRSRT(Sequence NO.3)；
寡肽4：PHPEGEFRTKMEYRWEYRVR(Sequence NO.4)；
寡肽5：PHPEDEFATKFEYRWGYRVR(Sequence NO.5)。
胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gbico公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒及定量PCR试剂盒购自TAKARA公司；Tanswell侵袭小室购自millpore公司。
NGAL、GAPDH的RT-PCR引物委托外包机构合成。
二、实验方法
1、细胞培养
肺癌A549细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基置37℃、5％CO2条件下培养。
2、分组及给药
取对数生长期的肺癌A549细胞，随机分组给药：
对照组：使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养；
寡肽1组：在对照组基础上添加5μM寡肽1培养；
寡肽2组：在对照组基础上添加5μM寡肽2培养；
寡肽3组：在对照组基础上添加5μM寡肽3培养；
寡肽4组：在对照组基础上添加5μM寡肽4培养；
寡肽5组：在对照组基础上添加5μM寡肽5培养。
3、寡肽对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响
将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化、计数，2×105个/孔铺于24孔板，待细胞贴壁后，按照上述分组方法分组并更换为对应的培养基培养，每组设3个平行孔，继续培养48h，弃去上清，收集细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计分别测定RNA浓度，根据吸光度OD260和OD280比值判定纯度。分别取5μg细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，以cDNA为模板应用。反应条件为：94℃预热3min，然后94℃30s，52℃30s，72℃50s，扩增29个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过Image J图像分析软件分析各电泳条带的灰度值，以目的条带的灰度值与GAPDH内参照条带的灰度值的比值表示目的基因mRNA的相对表达量。NGAL的上游引物为5′-GAAGACAAAGACCCGCAAAAG-3′，其下游引物序列为5′-CTGGCAACCTGGAACAAAAG-3′。内参GAPDH的上游引物序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTGCTGTA-3′。
4、MTT法检测寡肽对肺癌A549细胞的增殖抑制作用
将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化、计数，4×104个/孔铺于96孔板，待细胞贴壁后，按照上述分组方法分组并更换为对应的培养基培养，每组设6个平行孔，继续培养48h，弃去上清，各孔加入无血清培养基溶解的MTT，孵育4h，以二甲基亚砜溶解后于酶标仪570nm处测量吸光度值。
5、细胞迁移能力检测
将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化，离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。
培养48h后，消化收集细胞，用无血清DMEM培养基制成细胞悬液，以2.5×104个/孔的密度接种于6孔板，当细胞呈单层贴壁且接近100％融合时，使用10μl无菌移液器头在6孔板中划痕，清洗悬浮脱落细胞后，用无血清培养液，放置于37℃、5％CO2培养箱内，分别于划痕后0和48h在倒置光学显微镜下拍照，计算其划痕愈合率，实验重复3次。划痕愈合率＝(0h划痕距离－48h后划痕距离)/0h划痕距离×100％。
6、细胞侵袭能力检测
将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化，离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。
培养48h后，消化收集细胞，用无血清DMEM培养基制备细胞悬液，以2.5×105/孔的密度铺于Transwell小室上层腔室。然后，将含体积分数20％胎牛血清的DMEM培养基加入Transwell小室下层腔室。培养24h后，用棉签从Transwell小室上层腔室移走非侵袭的细胞，取Transwell小室，以PBS洗涤3遍，甲醇固定30min，采用0.1％结晶紫染色30min，于倒置光学显微镜观察计数。随机选取5个视野计数。
7、统计学分析
采用SPSS 19.0统计学软件，实验重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。P<0.05为差异有显著性意义。
三、实验结果
1、寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响
结果见表1和图1，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞中NGAL基因的表达水平，而寡肽5对肺癌A549细胞中NGAL基因的表达无明显抑制作用。
表1寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是lipocalin家族的一个成员。研究发现，NGAL在肺癌组织中高表达，有可能是治疗肺癌的一个潜在靶点(参考文献：肺鳞癌及腺癌中NGAL表达的免疫组化研究，实验与检验医学，2014年01期)。
2、寡肽1～5对肺癌A549细胞增殖的影响
结果见表2和图2，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖，而寡肽5对肺癌A549细胞的增殖无明显抑制作用。
表2寡肽1～5对肺癌A549细胞增殖的影响
3、寡肽1～5对肺癌A549细胞迁移能力的影响
结果见表3和图3，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞的迁移能力，而寡肽5对肺癌A549细胞的迁移能力无明显抑制作用。
表3寡肽1～5对肺癌A549细胞迁移能力的影响
4、寡肽1～5对肺癌A549细胞侵袭能力的影响
结果见表4和图4，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞的侵袭能力，而寡肽5对肺癌A549细胞的侵袭能力无明显抑制作用。
表4寡肽1～5对肺癌A549细胞侵袭能力的影响
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。本发明提供的寡肽可以通过抑制NGAL基因表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以制成防治肺癌转移、治疗肺癌的药物。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
序列表
<110> 淮安安莱生物科技有限公司
<120> 一种抑制肺癌转移的合成寡肽
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Cys Arg Val Phe Tyr Lys Pro Trp Val Arg His Gln Met Arg Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Asn
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Pro Trp Tyr Arg Lys Trp Asn Tyr Arg Val Arg Trp Arg Gly Trp
1 5 10 15
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<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
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20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
Tyr Arg Val Arg
20
Claims (2)
1.一种寡肽，其特征在于：序列如Sequence NO. 4所示。
2.权利要求1所述的寡肽用于制备治疗肺癌的药物的用途。
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