CN109091685A - 一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法 - Google Patents

一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法。本发明提供的细菌病原体的灭活方法是一利用光动力疗法将细菌病原体进行灭活；所述光动力疗法的过程是，利用特定波长的光照射使光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的细菌病原体发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。目前，在治疗眼部病原体感染时，主要还是通过利用抗生素进行治疗；然而，抗生素的过多使用容易使到细菌产生耐药性，并影响治疗时间和效果，通过利用光动力疗法既可以达到杀灭眼部细菌病原体目的，又可以减少抗生素的使用，避免细菌耐药性的产生，有利于患者的健康。

Description

一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种对角膜炎提取病原体的灭活方法。
背景技术
光动力疗法(PDT)是一种治疗癌症和其他疾病的治疗方法，在许多国家已经获得了监管部门批准。它使用被称为光敏剂(PS)的无毒染料和适当波长的可见光，使PS分子激发到兴奋的单线态，这个激发态下的***进入到长寿命的三重态，它可以与分子氧反应产生细胞毒性物质，如单态氧、超氧化物和自由基。这些活性氧可以氧化许多生物分子，如蛋白质、核酸和脂质，导致细胞死亡。PDT可以灭活或杀死一系列微生物病原体，特别是几种耐药微生物病原体，如万古霉素耐药肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌。此外，有报道称使用PDT治疗某些动物模型的感染和一些临床试验，结果显示PDT能降低革兰氏阴性菌的毒力因子的活性。
感染性角膜炎是一种视觉威胁的疾病，可能由细菌、病毒、真菌、寄生虫等引起。在中国，有300万角膜盲患者，传染性角膜盲患者每年增加10万例。细菌性角膜炎是最常见的眼部感染之一，进展迅速且严重。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是引起细菌性角膜炎最常见的微生物。目前的抗菌治疗方法通常需要大量的抗生素剂量。然而，随着广谱抗生素的广泛使用，最近的研究显示越来越多的证据表明微生物对抗菌药物有耐药性。尽管使用广谱抗生素和一些更严重的后果，抗生素耐药性可能导致疾病进程的持续进展。因此，急需开发一种有效的替代抗菌技术来治疗眼部细菌性感染。
发明内容
针对目前治疗细菌性角膜炎，临床上还是通过应用抗生素进行治疗，其它疗法相对较为欠缺，治疗手段还受到较大限制，存在容易产生抗药性问题，本发明目的在于提供一种角膜炎提取细菌病原体的灭活方法。
本发明通过应用光动力疗法对细菌性角膜炎进行治疗；该方法通过利用可见光对光敏剂进行激发，使其处于激发态并与氧分子进行反应生成细胞毒性物质，这些毒性物质再与生物分子结合，达到杀灭细菌病原体细胞的目的；应用光动力疗法进行治疗，无需使用抗生素，避免抗生素抗药性的产生，又可以起到治疗作用，使患者恢复身体健康，更好满足临床治疗细菌性角膜炎的需求。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，所述的细菌病原体的灭活方法为通过利用光动力疗法在光动力作用与介导物质共同作用下对眼表面的细菌病原体进行灭活。
优选地，所述的光动力作用使用的光为带宽为20nm，波长为575nm～670nm的可见光。更优选地，所述的光动力作用使用的光为带宽为20nm，波长为600nm～650nm的可见光。优选地，所述的介导物质为具有膜破坏作用的亲水阳离子光敏剂。
更优选地，所述的具有膜破坏作用的亲水性阳离子光敏剂为甲苯胺蓝O。
优选地，所述的眼表面的细菌病原体为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌一种或两种；所述微生物会引起细菌性角膜炎。
优选地，所述的可见光为红色可见光或白色可见光中的一种。
更优选地，所述的可见光为红色可见光。
优选地，所述的可见光的光功率密度为0.550～7.500mW/cm2，辐射时间为20～45min。
更优选地，所述的可见光的光功率密度为5.750～7.350mW/cm2，辐射时间为25～40min。
优选地，所述的甲苯胺蓝O的浓度为45～80μM。
优选地，所述的角膜炎提取的细菌病原体的灭活方法，包含以下步骤：
S1.取上述细菌悬浮液100～200μL室温培养15～25min，将其置于96孔板中，使细菌密度维持在107CFU/mL左右，并往其中部分滴孔中加入甲苯胺蓝O 5～80μM；
S2.培养完成后，将加有甲苯胺蓝O的孔暴露在为光照流量为0.50～8.50J/cm2，光照密度为0.550～7.500mW/cm2的条件下，辐射时间20～45min；
S3.在37℃条件下培养48小时，培养完成后，利用菌落计数法对细菌存活进行了评估。
目前，临床上治疗细菌性角膜炎主要是通过应用抗生素进行治疗，但是治疗过程中大量使用抗生素存在产生抗药性的风险，不利于患者身体健康；
针对现在临床上治疗细菌性角膜炎进行治疗，存在抗生素用量过多，易导致细菌产生抗药性，不利于患者身体健康和恢复的风险，本发明目的通过提供一种角膜炎去细菌病原体的灭活方法，通过本方法进行治疗，可以避免服用抗生素治疗产生抗药性的问题，具有毒副作用少的优点，更有利于患者身体健康。
附图说明
图1为不同处理组辐射前和辐射后葡萄球菌生长情况。
图2为不同实验组存活菌群数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
菌株的分离和培养
本研究选择12株表皮葡萄球菌和12株金黄色葡萄球菌分离株，这些菌株由北京市眼科研究所微生物研究组所提供的细菌性角膜炎分离出的所有菌株。将储存在甘油管中的细菌菌种接种于血液培养皿中，并使其复苏2倍于对数生长期。然后用接种环刮除菌群，并将其放入细菌稀释剂中，混合制成1*108～2*108CFU/ml浓度的细菌悬浮液。
实验光源和光敏剂
光源由高功率发光二极管阵列组成，波长为625nm，带宽为20nm。LED光源由小型直流电源(MCH-k305d)供电。LED阵列的尺寸能够覆盖96孔板的一部分，并具有可调功率密度。光功率输出采用光功率计(VLP-2000)测量。本实验使用甲苯胺蓝O作为光敏剂。
实施例1
一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，包含以下步骤：
S1.取上述细菌悬浮液130μL室温培养18min，将其置于96孔板中，使样本细菌密度维持在107CFU/mL左右，并往里其中部分孔中加入甲苯胺蓝O 50μM；
S2培养完成后，将加有甲苯胺蓝O的孔暴露在红光环境下，光照流量为8.50J/cm2，光照密度为5.750mW/cm2，辐射时间为20min；
S3.在37℃条件下培养48小时，培养完成后，利用菌落计数法对细菌存活进行了评估。
实施例2
一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，包含以下步骤：
S1.取上述细菌悬浮液150μL室温培养20min，将其置于96孔板中，使样本细菌密度维持在107CFU/ml左右，并往里其中部分孔中加入甲苯胺蓝O 65μM；
S2.培养完成后，将加有甲苯胺蓝O的孔暴露在红光环境下，光照流量为5.25J/cm2，光照密度为6.700mW/cm2，辐射时间为30min；
S3.在37℃条件下培养48小时，培养完成后，利用菌落计数法对细菌存活进行了评估。
实施例3
一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，包含以下步骤：
S1.取上述细菌悬浮液150μL室温培养25min，将其置于96孔板中，使样本细菌密度维持在107CFU/mL左右，并往里其中部分孔中加入甲苯胺蓝O 75μM；
S2.培养完成后，将加有甲苯胺蓝O的孔暴露在红光环境下，光照流量为7.50J/cm2，光照密度为7.450mW/cm2，辐射时间为40min；
S3.在37℃条件下培养48小时，培养完成后，利用菌落计数法对细菌存活进行了评估。
1.光敏剂因素和光照因素对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体灭活效果的影响
研究光敏剂甲苯胺蓝O(TBO)和光照因素对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的影响。将细菌悬浮液(108CFU/mL)与不同浓度的甲苯胺蓝O(60μM)放置在96滴孔板中进行培养。对照组1的滴孔用60μM的PBS培养。静置在室温下在室温下培养20min，实验样品的种群密度保持在10 7CFU/mL。在培养后进行光照。光照流量为5.25J/cm2。以6.150mW/cm2的辐照度。所有样品的辐照时间为20min；对照组2的滴孔用60μM的TBO在室温条件下，黑暗环境中进行培养20min；种群密度保持在10 7CFU/ml。
在上述培养完成后，用统计学软件SPSS软件对数据进行统计，用描述性统计方法对多路分析中的数据进行了总结。结果表明，该方法是有效的。组间的统计学意义采用方差分析(方差分析)来确定。P<0.05认为有统计学意义，相关数据如表1所示。
表1光敏剂因素和光照因素对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体灭活效果的影响
组别 细菌数量变化 对细菌病原体细胞毒性
TBO(60μM)+红光照射 细菌数量明显减少 具有较强的细胞毒性
TBO(60μM)+黑暗 细菌数量无明显变化 没有显示出细胞毒性
PBS(60μM)+红光照射 细菌数量无明显变化 没有显示出细胞毒性
PBS(60μM)+黑暗 细菌数量无明显变化 没有显示出细胞毒性
不同处理组辐射前和辐射后葡萄球菌生长情况如图1所示，其中图1不同处理组(a、b、c、d)及48小时辐照后(e、f、g、h)的葡萄球菌表皮生长情况。TBO介导的PDT组(h)在辐照后表现出明显的生长抑制。(a,e)对照组，(b,f)单独TBO组，(c,g)单独光照射组，(d,h)TBO介导的PDT组。不同实验组存活菌群数量(T:TBO；L:红光)如图2所示。
上述实验数据表明，光敏剂在黑暗中或者在光照环境中没有光敏剂都不能使到细菌病原体数量减少；只有在光敏剂TBO与光照条件共同起作用下，才能起到杀灭表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体的作用。
2.光敏剂浓度因素对细菌病原体灭活效果的影响
研究光敏剂甲苯胺蓝O(TBO)浓度对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的影响。将细菌悬浮液(108CFU/ml)与不同浓度的甲苯胺蓝O(20μM、40μM、60μM、80μM)放置在96孔板中进行培养。静置在室温下在室温下培养20min，实验样品的种群密度保持在10 7CFU/mL。在培养后进行光照，光照流量为5.25J/cm2。以6.150mW/cm2的辐照度。所有样品的辐照时间为20min。
在上述培养完成后，用统计学软件SPSS软件对数据进行统计，用描述性统计方法对多路分析中的数据进行了总结。结果表明，该方法是有效的。组间的统计学意义采用方差分析(方差分析)来确定。P<0.05认为有统计学意义，相关数据如表2所示。
表2光敏剂浓度因素对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体灭活效果的影响
组别 细菌数量变化 对细菌病原体细胞毒性
TBO(20μM)光照(红光) 细菌数量有减少 有一定的细胞毒性
TBO(40μM)光照(红光) 细菌数量减少增多 细胞毒性进一步增强
TBO(60μM)光照(红光) 细菌减少数量更多 细胞毒性进一步增强
TBO(80μM)光照(红光) 细菌减少数量有所增加 细胞毒性进一步增强
由表2中的实验数显示，在同等光照条件下，随着光敏剂TBO浓度的增大，对于表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体的杀灭作用在不断增强，在80μM时TBO杀灭的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌细菌病原体数量最多，使细菌病原体失活的能力最强，但其杀灭细菌病原体的增长数量和能力增长速度明显减弱，这可能与细菌病原体的总数在随着TBO的浓度增大的过程中已经大量减少，使到后续的灭活作用增长受到制约；同时，对于细菌病原体的灭活作用的增强也受到光照因素的影响，是两者共同作用的结果；因而在上述细菌病原体浓度和光照条件下中，60μM的TBO浓度的灭菌效果较好。
3.光照剂量对细菌病原体灭活效果的影响
研究了光照射剂量对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的影响。细菌悬浮液分别用浓度为60μM甲苯胺蓝O如上所述进行培养。将一些细菌悬浮液在96孔板上培养，用光照能量分别为0.81J/cm2、1.28J/cm2、2.97J/cm2、6.33J/cm2和8.76J/cm2的红光照射20min。实验结束后，对细菌菌落数量进行了计算，并进行了细菌存活率的计算。
在上述培养完成后，用统计学软件SPSS软件对数据进行统计，用描述性统计方法对多路分析中的数据进行了总结。结果表明，该方法是有效的。组间的统计学意义采用方差分析(方差分析)来确定。P<0.05认为有统计学意义，相应情况如表3所示。
表3光照剂量对细菌病原体灭活效果的影响
也研究了光照射剂量对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的不同影响。随着光能的增加，表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的存活率逐渐降低。然而，在给定的光功率下，观察到表皮葡萄球菌的显著下降。低光剂量(1.28J/cm2)，表皮葡萄球菌的细胞存活率几乎比金黄色葡萄球菌低10倍。差异有统计学意义(P<0.05)。
同时研究了光照强度(用光功率密度表示)对细菌的灭活作用，将光照时长均设置为20min，改变照射光的功率密度，分别为0.675mW/cm2,1.065mW/cm2,2.474mW/cm2,5.273mW/cm2and 7.299mW/cm2，统计光照射后细菌的存活率。结果表明，随着光照强度的提高，细菌存活率迅速降低，随后进一步提高光照强度，细菌存活率也会进一步降低。
进一步研究了辐照时间对细菌的灭活作用，并将光功率密度保持在5.273mW/cm2。统计分别用红光照射5、10、20、30、40min后的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的存活率。当TBO浓度为60μM时，即使只有5min的照射，表皮葡萄球菌的存活率也降低到30％以下，而金黄色葡萄球菌的存活分数降低到50％。结果表明，大多数细菌的死亡几乎都发生在初始光照阶段。这种快速的失活效应可能对葡萄球菌性眼部感染的治疗具有重要意义，因为这种细菌具有很强的侵袭性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，其特征在于，所述的细菌病原体的灭活方法为通过利用光动力疗法在光动力作用与介导物质共同作用下对眼表面的细菌病原体进行灭活。
2.根据权利要求1所述的一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，其特征在于，所述的光动力作用使用的光为带宽为20nm，波长为575nm～670nm的可见光。
3.根据权利要求1所述的一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，其特征在于，所述的介导物质为具有膜破坏作用的亲水阳离子光敏剂。
4.根据权利要求3所述的一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，其特征在于，所述的亲水性阳离子光敏剂为甲苯胺蓝O。
5.根据权利要求1所述的一种对角膜炎提取细菌病原体的灭活方法，其特征在于，所述的眼表面的细菌病原体为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌一种或两种；所述微生物会引起细菌性角膜炎。
6.根据权利要求2所述的一种对角膜炎提取微生物病原体的灭活方法，其特征在于，所述的可见光为红色可见光或白色可见光中的一种。
7.根据权利要求6所述的一种对角膜炎提取微生物病原体的灭活方法，其特征在于，所述的可见光的光功率密度为0.550～7.500mW/cm2，辐射时间为20～45min。
8.根据权利要求4所述的一种对角膜炎提取微生物病原体的灭活方法，其特征在于，所述的甲苯胺蓝O的浓度为45～80μM。
9.根据权利要求1所述的一种对角膜炎提取微生物病原体的灭活方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取上述细菌悬浮液100～200mL室温培养15～25min，将其置于96孔板中，使细菌密度维持在107CFU/mL左右，并往其中部分滴孔中加入甲苯胺蓝O 5～80μM；
S2.培养完成后，将加有甲苯胺蓝O的孔暴露在为光照剂量为0.50～8.50J/cm2，光功率密度为0.550～7.500mW/cm2的条件下，20～45min；
S3.在37℃条件下培养48小时，培养完成后，利用菌落计数法对细菌存活进行了评估。
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