CN109055439A - 采用木质纤维素制备乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

针对现有技术中纤维素乙醇制备技术中所存在酶制剂成本高、乙醇产量低的问题，本发明提供了采用木质纤维素制备乙醇的方法。所述方法包括预处理、糖化、酵母菌发酵和乙醇蒸馏等步骤。本发明采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，与依赖于游离酶制剂的现有技术相比，实现了用酶成本的显著降低。本发明所述方法，不但原料来源广泛、成本低廉，而且纤维素糖化效率为80％‑90％，糖醇转化率超过理论值的80％，即可达到0.65g/g葡萄糖，乙醇产量可达20‑98g/L，乙醇得率可达0.12‑0.27g/g木质纤维素原料。因此，该方法降低了酶制剂的成本，保证了高的乙醇产量，为工业化的进程奠定了基础。

Description

采用木质纤维素制备乙醇的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素的生物转化方法，具体涉及一种以木质 纤维素为原料制备纤维素乙醇的方法。
背景技术
木质纤维素类生物质是地球上蕴藏最为丰富的可再生生物质资源，将其转化为能源、化 学品或材料具有巨大的应用和发展前景。我国是农业大国，每年的农作物秸秆产量超过9亿 吨。近年来，由于秸秆焚烧引起的环境污染与交通安全事故等问题，促使国家推出一系列秸 秆综合利用的规划、方案与措施。例如，《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020)》 明确提出纤维原料的高效综合利用，特别是提高农林废弃生物质原料转化和利用效率的建议 和要求。所以，推动农业废弃生物质综合利用的产业化，对我国绿色循环经济的建立和社会 的可持续发展具有重要的意义。
生物燃料乙醇是可再生能源的重要组成部分。生物燃料乙醇的使用，不仅对保障国家能 源安全、促进经济发展具有积极作用，对降低PM2.5等大气污染物的排放也有重要作用。2017 年9月13日，国家***联合十五部门印发了《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用 乙醇汽油的实施方案》，重点提出适度发展粮食燃料乙醇，科学合理把握粮食燃料乙醇总量， 大力发展纤维素燃料乙醇等先进生物液体燃料。到2020年，在全国范围内推广使用车用乙醇 汽油，基本实现全覆盖。到2025年，努力在中国实现纤维素乙醇的商业化生产。然而目前， 与光伏、风电、水电等可再生能源相比，中国可再生液体燃料的发展则明显滞后；2016年实 际消费量仅约300万吨，不到全国成品油消费的1％，已成为当前能源转型的突出短板，亟待 加快发展。造成这一现状的原因有二：(1)生物质糖化所用的酶制剂技术被发达国家公司垄 断，由此而造成的酶的高成本成为制约木质纤维素工业化应用的关键问题；(2)技术上的困 难阻碍了木质纤维素生物转化技术的发展和应用。因此，开发低成本、高效率的糖化技术， 对发展中国家尤为必要。
木质纤维素制备乙醇包括纤维素酶的生产、纤维素酶解与乙醇发酵等步骤，根据这些关 键环节之间的关系，可以将现有技术体系分为分步水解发酵工艺(SHF)、同步糖化发酵工艺 (SSF)以及整合生物加工技术(CBP)三种。其中，SHF和SSF都需要首先在独立的反应器中进 行真菌来源的游离纤维素酶体系的生产，然后对预处理后原料进行纤维素的酶水解及发酵。 国内外多个机构和大公司在纤维素乙醇生物制备方面开展了长期的研究，主要利用基于真菌 来源游离酶制剂的木质纤维素糖化策略先得到可发酵糖，然后发酵生产乙醇(如，专利 201110304843.7、201210572124.8、201710181161.9、201711472264.7、201710004115.1、 201410765651.X、201710198921.7、201510081638.7、201710897535.7)。但是，由于酶制剂 的成本问题(约占纤维素乙醇总成本的1/4-1/3)没有解决，所以，没有得到大规模的工业应 用。由于成本问题，最早涉及酶制剂或/和纤维素乙醇领域的美国杜邦公司、意大利Beta Renewable公司、美国Abengoa公司、巴西Granbio公司已将相关的业务出售或转让。酶制剂 成本对于纤维素乙醇产业发展的重要性由此可见一斑。对于我国纤维素乙醇产业来说，不仅 存在酶制剂成本高昂的问题，核心酶解技术还被发达国家及跨国公司把持，因此仍未见纤维 素乙醇的大规模商业化生产和运营。CBP将纤维素酶的生产与酶解发酵等各个相对独立的技 术环节整合为同一步骤，在同一反应器中进行。该策略具有简化流程、降低设备要求等优势， 但由于多个步骤在同一反应器中同时进行，也需要对反应条件进行妥协平衡，难以同时获得 高的产酶、酶解和发酵水平。美国国家可再生能源实验室、达特茅斯学院等国外多个机构探 索利用包括热纤梭菌在内的纤维素降解细菌或真菌将纤维素底物直接转化为乙醇，但目前仍 存在产量低，难以产业化的问题。
因此，将纤维素酶的生产和酶解步骤进行有机整合，实现木质纤维素的整合生物糖化， 然后进行下游乙醇发酵步骤，是最适合的纤维素乙醇制备的工艺路线。
整合生物糖化方法的核心在于采用高效的全菌催化剂，即一种具有木质纤维素底物降解 能力、可以高效将纤维素底物水解转化为可发酵糖的微生物。目前，木质纤维素全菌催化糖 化主要利用基于热纤梭菌这一产纤维小体的高温厌氧菌作为全菌催化剂。纤维小体是一种具 有复杂结构和组分的胞外多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。纤 维小体包括脚架蛋白等非催化单元以及具有不同催化活性的酶单元，并通过多级脚架蛋白和 不同纤维小体酶类具有的多类型组装模块间特异性的非共价相互作用，将不同的功能组分组 装成为分子量超过兆道尔顿的超分子多酶复合体。纤维小体组分和结构还具有时空调控特性， 以适应木质纤维素的复杂成分，从而保证了其高效降解活力。此外，纤维小体还通过脚架蛋 白或纤维素酶上所具有的纤维素结合模块和挂壁模块与底物及细胞组成三元复合体，纤维小 体和细胞间的协同作用可以进一步提高了木质纤维素的糖化效率(专利文件EP2013355)。
尽管纤维小体及其生产菌株在木质纤维素糖化应用中具有巨大潜力，但其工业化应用仍 受到多种因素的限制。当木质纤维素复杂底物中非纤维素成分(如，半纤维素、果胶、淀粉、 蛋白质、木质素)含量较高时，糖化效率显著降低。前人主要通过向水解体系里额外添加非 纤维小体蛋白来提高纤维小体的活力和对底物的适应力。然而，由于外源添加的蛋白的活性 及稳定性会随着糖化过程的进行而降低，因此，酶的消耗需要提高酶添加量或添加次数。此 外，这些非纤维小体蛋白作为游离酶添加到糖化体系中，不能与纤维小体相互作用，会显著 降低与体系中其他酶的协同作用，不可避免造成大于需求量的酶的额外添加，导致酶制剂成 本的居高不下。
发明内容
针对现有技术中纤维素乙醇制备技术中所存在酶制剂成本高、乙醇产量低的问题，本发 明提供了采用木质纤维素制备乙醇的方法，该方法大大降低了酶制剂的成本，同时保证了高 的乙醇产量，从而为工业化的进程奠定了基础。
本发明的技术方案：
用于纤维素乙醇制备的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含 量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:10，将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌 氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条 件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖液中葡萄糖浓度为100-180g/L时，直接用 于酵母菌发酵。当糖液中葡萄糖浓度为35-100g/L时，通过离心将含有木质纤维素灰分及菌 体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。 含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀可作为纤维素酶制剂用于新一轮糖化。
所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙 0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、 pH 6.5-7.5。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加5-20g/L氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在25-42℃的温度条件、5.5-6.5的pH条件下发酵36-120h，至 葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。发酵过程中采用流加氨水的方式控制pH。所述 的补加的氮源为玉米浆、酵母提取物和蛋白胨中的一种或多种的组合。
(4)乙醇蒸馏：将步骤(3)得到的乙醇发酵液离心处理，将酵母菌体细胞与发酵后培 养基进行固液分离，利用蒸馏法从发酵后培养基中获得纤维素乙醇。酵母菌体细胞可以用于 制备酵母饲料。
其中，步骤(2)所述的纤维素酶制剂，是通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互 作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到的；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、 纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌 氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。所述的纤维小体中的组 分为脚架蛋白、有催化功能的酶、组装模块。
所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性 连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行 连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。
优选的是，所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列； 以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQID NO: 1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中：SEQ ID NO:15:Genbank序 列号CRZ35393.1；SEQ ID NO:16:由基因组CP001393.1中1968724至1973904核酸序列编 码；SEQ ID NO:17:Genbank序列号为KC763474.1；SEQ ID NO:18:由基因组CP001393.1 中2531445至2532785核酸序列编码。
优选的是，所述厌氧细菌为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，黄色溶纤梭菌 (Clostridium clariflavum)，嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)，解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)，黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)。其中，所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接，具体为： 非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间 特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所 带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中。所述与非纤维小体蛋白和纤维 小体组分共价相互作用的多肽片段为SEQ ID NO:4中所示的碱基序列或SEQ ID NO:5中所 示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的一个片 段(多肽片段I或II，即SEQ ID NO:4或5)的编码基因；
2)根据1)，通过基因克隆的方法，连接纤维小体组分蛋白与共价相互作用的多肽片段 对中的另一个片段(多肽片段II或I，即SEQ ID NO:5或4)的编码基因。
3)根据1)，将非纤维小体蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达 质粒；
4)根据2)，将纤维小体组分蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌同 源重组质粒，并根据基因组序列设计同源臂。
5)将4)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现重组基因 序列对基因组上原始纤维小体组分蛋白序列的替换，从而构建重组菌株，实现纤维小体组分 蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
6)将3)中获得的质粒转化到5)中获得的重组菌株中，实现非纤维小体蛋白与多肽片 段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，基因组表达的纤维小体组分蛋白与质粒表达的非纤维小体蛋白 通过所融合的多肽片段I及II间的特异性共价相互作用实现共价交联，并组装在纤维小体复 合体中。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接，具体为：非纤 维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块 间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中。所述融合 表达为：非纤维小体蛋白的编码基因***到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结 构域序列中间的基因组上。
所述各自呼应的模块为粘连模块与对接模块。所述对接模块为SEQ ID NO:6、SEQID NO: 9-13、SEQ ID NO:14中所示的碱基序列，粘连模块为SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。 具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与I型对接模块(SEQ ID NO:6)的编码 基因，或
2)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与II型粘连模块(SEQ ID NO:7)的编码 基因
3)将1)或2)获得非纤维小体蛋白与组装模块的重组基因序列连接到产纤维小体细菌 表达质粒
4)将3)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，实现非纤维小体蛋白与I型对接模 块或II型粘连模块在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的I型对接模块或II型 粘连模块实现与纤维小体脚架蛋白进行特异性非共价相互作用，从而组装在纤维小体复合体 中。
所述直接融合表达的具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，将非纤维小体蛋白的编码基因连接到产纤维小体细菌同源重组 质粒中，并根据基因组序列设计同源臂。
2)将1)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现非纤维小 体蛋白的编码基因***到基因组上纤维小体组分蛋白的序列的N端或C端或结构域序列中 间，从而构建重组菌株，实现非纤维小体蛋白与纤维小体组分蛋白在产纤维小体细菌胞内的 融合表达。
最终获得的重组菌株中，非纤维小体蛋白利用与其融合表达的纤维小体组分蛋白的组装 模块结合到纤维小体复合体中。
优选的是，步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉 米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和 磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于 11％，半纤维素含量不高于12％。
优选的是，步骤(2)糖化的温度条件为55-60℃。
优选的是，步骤(3)酵母菌发酵的温度条件为30-35℃。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的以木质纤维素为原料发酵生产乙醇的方法，采用基于产纤维小体细菌 的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，与依赖于游离酶制剂的现有技术相比，实现了用酶 成本的显著降低。
(2)本发明所述的以木质纤维素为原料发酵生产乙醇的方法，纤维素糖化效率为80％-90％，糖醇转化率超过理论值的80％，即可达到0.65g/g葡萄糖，乙醇产量可达20-98g/L， 乙醇得率可达0.12-0.27g/g木质纤维素原料。与现有技术相比，具有更高的乙醇产量和得率。
(3)本发明所述的以木质纤维素为原料发酵生产乙醇的方法，原料来源广泛且成本低廉， 所有步骤在同一反应器中进行，为纤维素乙醇的商业化生产提供了技术支持，填补了现有技 术的空白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
通过无缝克隆，将tdk表达盒(包含gapDH基因的启动子)以及pyrF表达盒(包含pyrF 自身启动子)克隆到质粒pHK(Mohr,G.,Hong,W.,Zhang,J.,Cui,G.-Z.,Yang,Y.,Cui,Q.,et al. (2013)A targetron system for gene targeting in thermophiles and itsapplication in Clostridium thermocellum,PLoS One 8:e69032.)的抗生素基因cat的下游，并通过引物的设计，在tdk与 pyrF表达盒之间增加NheI和XbaI酶切位点，在pyrF下游添加EagI和MluI酶切位点，用于 同源臂片段的克隆，从而构建得到pHK-HR质粒。
选择热纤梭菌纤维小体中的纤维素酶Cel9K(外切纤维素酶，由基因组CP002416.1中 2113813至2111293核酸序列编码)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先， 将β-1,4-葡萄糖苷酶BglA(Genbank序列号为AFO70070.1)编码基因作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组质粒pHK-HR-BglA。 上游同源臂HR-up序列为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1) 中2111347到2112870核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2109848到 2111354核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中2111347到2111659核酸序列。 其次，将构建好的质粒转化到ΔpyrF中，并按照三步筛选获得底盘菌株。具体筛选方法为：
1)将同源重组质粒pHK-HR转化进入pyrF缺失的菌株中，利用含甲砜氯霉素的GS-2半 固体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,酵母提取物6.0g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,pH 7.4)平 板进行筛选，以获得质粒转化子。
2)获得的转化子在MJ液体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L, MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L, MOPS钠盐10g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,盐酸吡哆 胺2mg/L,生物素0.2mg/L,对氨基苯甲酸0.4mg/L，维生素B12 0.2_mg/L，pH 7.4)中转接 三代后，涂布含10μg/mL 5-氟脱氧尿苷(FUDR)的MJ半固体培养基进行第一次同源重组 筛选。在这一步骤中，由于Tdk可以将FUDR转化为对细胞有毒的F-dUMP，同时底盘细胞在MJ培养基中必须依靠质粒上的pyrF基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。 根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此 时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。
3)经第一次同源重组后获得的重组子先在GS-2液体培养基中传代3次，并用相同的培 养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/mL 5-氟乳清酸(FOA)的GS-2半固体培养基 进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，PyrF的反向筛选作用会促使上 游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrF表达框从基因组中去除。第二次同源重组 后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除、 敲入或者替换。分别获得同源重组菌株ΔpyrF-I或ΔpyrF-II，分别表达Cel48S与多肽片段I 或多肽片段II的融合蛋白。
选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶Cel48S(由基因组CP002416.1中3228088至 3230229核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点，将多肽片段I(SEQ ID NO:4)或多肽片 段II(SEQ ID NO:5)两个片段的编码序列作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点分别克隆到同源重组质粒pHK-HR中，分别构建获得同源重组质粒pHK-HR-I或pHK-HR-II。 上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中3230200到3230700核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中3229699到3230199核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中3230200到3230500核酸序列。将构 建好的质粒再分别转化到上述构建的底盘菌株中，并按照上述三步筛选方法获得同源重组菌株ΔpyrF::BglA-I或ΔpyrF::BglA-II。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将多肽片段II或多肽片段I连接到木聚糖酶XynA (SEQ ID NO:1)的3’端。利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标 序列克隆到表达质粒pHK上。将含有XynA与多肽片段I的重组序列的表达质粒转化到 ΔpyrF::BglA-II；将含有XynA与多肽片段II的重组序列的表达质粒转化到ΔpyrF::BglA-I，从 而实现Cel48S和XynA能够通过多肽片段I和II间特异性共价相互作用进行结合。通过提取 获得热纤梭菌重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的XynA可以外泌到胞外， 并与具有共价结合模块的Cel48S相互作用，组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以 5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用 于木质纤维素的生物糖化。
实施例2：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例1不同的是，将多肽片段II或多肽片段I连接到纤维小体内切酶CelZ(SEQID NO:15)的3’端。将构建的重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例3：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel9-48(SEQ ID NO:16)与热 纤梭菌的II型粘连模块CohIIct的序列(SEQ ID NO:7)或I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中CohIIct或DocIct的序列连接至Cel9-48序列的3’端，获得 Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列。
以Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆 到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1160为靶向替换序列，构建同源重 组质粒pHK-HR-cel9-48。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中 序列号为CP002416.1)中1380180到1380679核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1380634到1381133核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中1380833到1381133核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到实施例1构建的底盘菌株中，并按照实施例1的三步筛选方法获得同源重组菌株1和2。通过提取重组菌株的纤维小体发现，Cel9-48 与组装模块的融合蛋白可以外泌到胞外，并通过非共价交联的相互作用方式组装到纤维小体 复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对 数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例4：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将膨胀因子Epn(SEQ ID NO:2)编码基因作为目标序列，选择热纤梭菌纤维小体的脚架 蛋白SdbA(由基因组CP002416.1中1108113至1109912核酸序列编码)的5’端作为靶向敲 入位点构建同源重组质粒pHK-HR-epn。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中1107610到1108109核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1109916到1110415核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因 组中1107809到1108109核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将木聚糖酶XynA(SEQ ID NO:1)与II型粘连模 块CohII的序列(SEQ ID NO:7)直接连接起来，其中CohII的序列连接至XynA序列的3’端，从而获得XynA-CohII的序列。以XynA-CohII序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶 切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1878为靶向替换序列， 构建同源重组质粒pHK-HR-xynA。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI 数据库中序列号为CP002416.1)中2194853到2195353核酸序列，下游同源臂HR-down为 DSM1313基因组中2196312到2196811核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组 中2195053到2195353核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与热纤梭 菌的I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中DocIct的序列连接至 PelA序列的3’端，获得PelA-DocIct目标序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起 来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上，获得表达质粒pHK-PcelS-PelA-DocIct。 由于pHK上带有来源于热纤梭菌的纤维素酶Cel48S的启动子及信号肽序列(SEQID NO:8)， 表达的目标基因可以外泌到细胞胞外。
将同源重组质粒pHK-HR-xynA转化到实施例3构建的重组菌株1中，并按照实施例1所 述筛选方法获得同源重组菌株3。再将同源重组质粒pHK-HR-epn转化到重组菌株3中，同样的按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株重组菌株4。最后，将质粒 pHK-PcelS-PelA-DocIct转化到重组菌株4中，从而获得同时表达具有II型粘连模块的XynA、 具有I型对接模块的Cel9-48和PelA以及融合蛋白Epn-SdbA的热纤梭菌重组菌株5。
通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的木聚糖酶XynA、纤维素外切酶Cel9-48、果 胶酶PelA都通过直接性连接的方式结合在热纤梭菌纤维小体上、膨胀因子Epn通过与脚架蛋 白SdbA的融合表达也可以外泌并组装到纤维小体复合体中。将重组菌株5在以5克每升纤 维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维 素的生物糖化。
实施例5：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将实施例4构建的重组菌株5，在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数 后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木 质纤维素的生物糖化。
实施例6：通过直接性连接的方法，构建基于黄色溶纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel48S与黄色溶纤梭菌的I型对 接模块序列DocIccl(SEQ ID NO:9)连接起来，其中DocIccl的序列连接至Cel48S序列的3’ 端，从而获得Cel48S-DocIccl序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序 列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上。构建好的质粒转化到黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum DSM 19732)中获得表达的具有DocIccl的Cel48S重组菌株。通过提取重组菌株 的纤维小体发现，表达的具有DocIccl的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄色溶纤梭菌纤 维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平 台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素 的生物糖化。
实施例7：通过直接性连接的方法，构建基于白色瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与白色瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIra (SEQ ID NO:10)连接起来，从而获得Cel48S-DocIra序列。构建好的质粒转化到白色瘤胃 球菌(Ruminococcus albus SY3)中获得表达的具有DocIra的Cel48S的重组菌株。通过提取 重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIra的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到白色瘤 胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数 后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木 质纤维素的生物糖化。
实施例8：通过直接性连接的方法，构建基于黄化瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与黄化瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIrf (SEQ ID NO:11)连接起来，从而获得Cel48S-DocIrf序列。构建好的质粒转化到黄化瘤胃 球菌(Ruminococcus flavefaciens)中获得表达的具有DocIrf的Cel48S的重组菌株。通过提取 重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIrf的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄化瘤胃 球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后 期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质 纤维素的生物糖化。
实施例9：通过直接性连接的方法，构建基于溶纤维假拟杆菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与溶纤维假拟杆菌的I型对接模块序列 DocIpc(SEQ ID NO:13)连接起来，从而获得Cel48S-DocIpc序列。构建好的质粒转化到溶 纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens DSM 2933)中获得表达的具有DocIpc的 Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIpc的Cel48S可以 外泌到胞外，并组装到溶纤维假拟杆菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为 碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液 可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例10：通过直接性连接的方法，构建基于嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将蛋白酶ProL(SEQ ID NO:3)编码基因作为目标序列，选择嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素 酶Clocel_2823(由基因组CP002160.1中3464080至3466140核酸序列编码)的5’端作为靶 向敲入位点。利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组 质粒pHK-HR-ProL。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridiumcellulovorans 743B 基因组中(NCBI数据库中序列号为CP002160.1)中3466141到3466640、3465641到3466140 以及3466141到3466441核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失的743B突变株 中，并按照实施例1的方法筛选获得蛋白酶ProL与纤维素酶Clocel_2823融合表达的同源重 组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体 复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期， 然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖 化。
实施例11：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将淀粉酶AmyA(SEQ ID NO:17)编码基因作为目标序列，选择解 纤维梭菌纤维小体的纤维素酶Ccel_0729(由基因组CP001348.1中843122至845197核酸序 列编码)的5’端作为靶向敲入位点。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridium cellulolyticum H10基因组中(NCBI数据库中序列号为NC_011898)中842441到842941、 842942到843441以及842641到842941核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失 的H10突变株中，筛选获得淀粉酶AmyA与纤维素酶Ccel_0729融合表达的同源重组菌。通 过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。 将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过 低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例12：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维醋弧菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与解纤维醋弧菌的I型对 接模块序列DocIac(SEQ ID NO:14)连接起来，从而获得PelA-DocIac序列。构建好的质粒 转化到解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)中。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表 达的PelA可以外泌到胞外，并通过具有的DocIac组装到解纤维醋弧菌纤维小体复合体中。 将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过 低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例13：采用木质纤维素制备乙醇
(1)预处理：对玉米秸秆按照文献(中国造纸，2015,34,1-6)中采用的磺化法进行预 处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:6，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移 至厌氧发酵罐的6L培养基中，然后将实施例1制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物 中，在55℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的浓度 为74g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓缩 至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙 0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、 pH 6.5-7.5。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加10g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在25℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵48h，至葡萄糖浓度 达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。发酵过程中采用流加氨水的方式控制pH。所述的补加的氮源 为玉米浆。
(4)乙醇蒸馏：将步骤(3)得到的乙醇发酵液离心处理，将酵母菌体细胞与发酵后培 养基进行固液分离，利用蒸馏法从发酵后培养基中获得纤维素乙醇。酵母菌体细胞用于制备 酵母饲料。
实施例14：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对小麦秸秆按照专利CN201610133959中采用的水热与磺化法联合预处理 法进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3.5，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物 转移至厌氧发酵罐的350L培养基中，然后将实施例2制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维 素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液，所述糖液中葡萄糖 的浓度为150g/L。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加20g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵80h，至葡萄糖浓度 达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。所述的补加的氮源为酵母提取物和蛋白胨。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例15：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对灌木枝条按照文献(Bin Li,et al.Recent progress on thepretreatment and fractionation of lignocelluloses for Biorefinery atQIBEBT.Journal of Bioresources and Bioproducts,2017,2(1),4-9)中的碱法预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于15％， 半纤维素含量不高于7.5％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移 至厌氧发酵罐的5L培养基中，然后将实施例3制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物 中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的浓度 为99g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓缩至 葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加15g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵48h，至葡萄糖浓度 达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。所述的补加的氮源为玉米浆和蛋白胨。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例16：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对木片按照文献(Biotechnology for Biofuels，2014，7:116)中的碱法与 水热相结合的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％ 的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:8，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转 移至厌氧发酵罐的800L培养基中，然后将实施例4制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素 底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的 浓度为63g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓 缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加8g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵108h，至葡萄糖浓 度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。发酵过程中采用流加氨水的方式控制pH。所述的补加的氮源为酵母提取物。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例17：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对稻草按照文献(纤维素科学与技术，2002，3，47-52)中的汽爆预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于14.5％的木质纤维素底 物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的1000L培养基中，然后将实施例5制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在58℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的浓度为57g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸 发浓缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加8g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在35℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵120h，至葡萄糖浓 度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例18：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照文献(Bioresource Technology，2004，91，93-100)中的水热 预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素 底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移 至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例6制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物 中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的浓度 为179g/L。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加20g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在35℃的温度条件、6.0的pH条件下发酵115h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例19：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％， 半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转 移至厌氧发酵罐的1L培养基中，然后将实施例7制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底 物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的浓 度为65g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓缩 至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加5g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵36h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。发酵过程中采用流加氨水的方式控制pH。所述的补加的氮源为玉米浆和蛋白胨。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例20：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％， 半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例8制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素 底物中，在65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的 浓度为35g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓 缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加8g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵42h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。所述的补加的氮源为酵母提取物和蛋白胨。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例21：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例14预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％， 半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:4.5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转 移至厌氧发酵罐的4.5L培养基中，然后将实施例9制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素 底物中，在34℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的 浓度为124g/L。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加20g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在32℃的温度条件、5.5的pH条件下发酵115h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例22：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照文献(生物加工过程，2010，3，66-72)中的稀酸水解预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于9％，半纤维素含量不高于18％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将0.4kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转 移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例10制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素 底物中，在42℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖的 浓度为72g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸发浓 缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加10g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在32℃的温度条件、5.5的pH条件下发酵80h，至葡萄糖浓度 达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例23：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于 7％，半纤维素含量不高于9％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:7.5，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物 转移至厌氧发酵罐的1.5L培养基中，然后将实施例11制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤 维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄 糖的浓度为87g/L，离心，将含有木质纤维素灰分及菌体的固体沉淀与糖液分离；糖液通过蒸 发浓缩至葡萄糖浓度不低于120g/L，用于酵母菌发酵。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加5g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵36h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。所述的补加的氮源为酵母提取物。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
实施例24：采用木质纤维素制备乙醇
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高 于5％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转 移至厌氧发酵罐的0.6L培养基中，然后将实施例12制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维 素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖液中葡萄糖 的浓度为112g/L。
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加15g/L的氮源，高温高压灭菌；然 后接入活化的酵母菌种子液，在42℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵50h，至葡萄糖浓度 达到1-5g/L，获得乙醇发酵液。所述的补加的氮源为玉米浆和蛋白胨。
(4)乙醇蒸馏：与实施例13相同。
表1.实施例13-24采用木质纤维素制备乙醇的结果列表
由表1可知，实施例13-24中采用木质纤维素制备乙醇的方法，纤维素糖化率为80.90-90.80％，糖醇转化率为0.45-0.65g/g，乙醇产量为20.19-98.56g/L，乙醇得率为0.10-0.27 g/g原料)。其中，糖醇转化率可达到0.65g/g葡萄糖，超过了理论值的80％。而乙醇产量可 达98g/L，乙醇得率可达0.27g/g木质纤维素原料。与现有技术相比，具有更高的乙醇产量和 得率。这说明，本发明所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，不但具有原料来源广泛且廉 价的优势，而且采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，实现了用 酶成本的显著降低，为纤维素乙醇的商业化生产提供了技术支持，填补了现有技术的空白。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 采用木质纤维素制备乙醇的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> 热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor sp. )
<400> 1
Ala Ile Thr Leu Thr Ser Asn Ala Ser Gly Thr Tyr Asp Gly Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Ser Gly Asn Thr Thr Met Thr Val Asp Thr
20 25 30
Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Leu Phe
35 40 45
Arg Thr Gly Lys Lys Phe Asn Thr Ala Trp Asn Gln Leu Gly Thr Val
50 55 60
Lys Ile Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu
65 70 75 80
Cys Ile Tyr Gly Trp Ser Lys Asn Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Thr
100 105 110
Val Thr Ile Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Val
115 120 125
Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Thr Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser
130 135 140
Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Asp His
145 150 155 160
Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly Thr Ile Asp Gln
165 170 175
Ile Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Ile
180 185 190
Thr Gln Asn Thr Phe Ser Ile Thr Ser Asp Ser Ser Gly Ser Thr Thr
195 200 205
Pro Thr Thr Thr
210
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)
<400> 2
Met Asn Phe Lys Lys Ile Arg Leu Phe Thr Ala Ile Leu Ile Ile Ala
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Ser Tyr Asn Phe Ile Ser Ser Ala Gln Leu Gln Val
20 25 30
Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Asn Val Asp Ser Ile Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Met Lys Ser Phe Ile Leu Lys Ile Ile Asn Thr Leu Pro Ala Glu Asp
50 55 60
Ser Leu Leu Ala Gly Asp Leu Asp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Ser Ile
65 70 75 80
Asp Cys Ala Leu Met Lys Gln Tyr Leu Leu Gly Met Ile Lys Val Phe
85 90 95
Pro Lys Thr Gln Ser Pro Ala Pro Thr Pro Thr Asn Thr Pro Leu Pro
100 105 110
Glu Tyr Ser Glu Pro Tyr Pro Gly Trp Asp Lys Ile Arg Ser Gly Tyr
115 120 125
Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Val Gly Gly Ile Ala Leu Leu Asp
130 135 140
Pro Ile Pro Glu Asp Met Glu Ile Val Ala Val Asn Lys Pro Asp Phe
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Gly Val Gln Ala Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Leu Glu Val
165 170 175
Thr Gly Pro Lys Gly Thr Thr Val Val Tyr Val Thr Asp Cys Tyr Thr
180 185 190
Glu Ala Pro Glu Gly Ala Leu Asp Leu Cys Gly Ile Ser Cys Asp Lys
195 200 205
Ile Gly Asp Thr Asn Val Pro Gly Gly Lys Ile Asp Val Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Ile Pro Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Ile Tyr Arg Ile Leu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Ser Lys Trp Trp Phe Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr
245 250 255
Pro Val Met Lys Met Glu Tyr Phe Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Ile
260 265 270
Pro Lys Asp Arg Cys Asn Tyr Phe Val Ile Asn Asn Leu Asp Thr Ser
275 280 285
Asn Leu Lys Ile Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val Val Thr Asp
290 295 300
Ile Ile Asp Pro Ile Pro Asp Asn Leu Met Asn Gly Cys Phe Ile Gln
305 310 315 320
Gly Asn Val Gln Phe Pro Asp
325
<210> 3
<211> 440
<212> PRT
<213> 溶蛋白杆菌(Coprothermobacter proteolyticus)
<400> 3
Met Lys Lys Ile Leu Leu Thr Leu Val Ile Ala Val Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Phe Ala Gly Val Lys Ser Ala Glu Leu Leu Phe Val Ser Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Thr Asn Gln Glu Asp Pro Glu Asn Glu Ile Ile Val Gly Tyr
35 40 45
Lys Glu Asn Thr Asp Val Ala Val Leu Ser Lys Gln Val Glu Lys Thr
50 55 60
Thr Gly Ala Lys Leu Ser Arg Lys Gly Leu Lys Asn Phe Ala Val Phe
65 70 75 80
Lys Leu Pro Gln Gly Lys Ala Ala Asp Val Val Met Asn Gln Leu Lys
85 90 95
Asn Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Pro Asn Tyr Ile Ala His Ala
100 105 110
Phe Asp Val Pro Asn Asp Thr Phe Phe Asn Pro Tyr Gln Trp Asn Phe
115 120 125
Tyr Asp Tyr Gly Met Thr Ser Asn Gly Tyr Val Ser Asn Tyr Gly Ile
130 135 140
Gln Ala Val Ser Ala Trp Asn Ile Thr Lys Gly Ala Gly Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ile Ile Asp Thr Gly Val Ala Tyr Glu Asn Tyr Gly Ala Tyr Thr
165 170 175
Lys Ala Pro Asp Leu Ala Asn Thr Leu Phe Asp Thr Ala Asn Ala Tyr
180 185 190
Asp Phe Val Asn Asn Asp Thr His Ala Asn Asp Asp Asn Ser His Gly
195 200 205
Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Gln Ser Thr Asn Asn Gly Met Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ile Ala Tyr Gln Ala Thr Ile Leu Pro Ile Lys Val Leu
225 230 235 240
Asp Ser Glu Gly Ser Gly Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Asn Gly Ile Ile
245 250 255
Trp Ala Ala Asp Lys Gly Ala Arg Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
260 265 270
Ser Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Asn Ala Ile Gln Tyr Ala Tyr Asn
275 280 285
Lys Gly Val Val Ile Val Cys Ala Ser Gly Asn Asp Arg Arg Ser Thr
290 295 300
Val Ser Tyr Pro Ala Ala Tyr Thr Gln Cys Ile Ala Val Gly Ser Thr
305 310 315 320
Arg Phe Asp Gly Thr Arg Ala Arg Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser Ala Leu
325 330 335
Asp Ile Val Ala Pro Gly Gly Asp Thr Ser Val Asp Gln Asn His Asp
340 345 350
Gly Tyr Gly Asp Gly Ile Leu Gln Gln Thr Phe Ala Glu Gly Ser Pro
355 360 365
Thr Asp Phe Ala Tyr Tyr Phe Phe Gln Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
370 375 380
His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Leu Ser Ala His Pro Thr Tyr
385 390 395 400
Thr Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Leu Gln Ser Thr Ala Lys Asp Leu
405 410 415
Gly Thr Ala Gly Trp Asp Lys Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Val Asn Ala
420 425 430
Tyr Ala Ala Val Asn Trp Thr Pro
435 440
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 4
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 97
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 5
Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser
35 40 45
Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly
50 55 60
Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn
85 90 95
Gly
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 6
Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser Thr Asp Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Lys Arg Tyr Val Leu Arg Ser Gly Ile Ser Ile Asn Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Asp Leu Asn Glu Asp Gly Arg Val Asn Ser Thr Asp Leu Gly
35 40 45
Ile Leu Lys Arg Tyr Ile Leu
50 55
<210> 7
<211> 160
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 7
Ser Ser Ile Glu Leu Lys Phe Asp Arg Asn Lys Gly Glu Val Gly Asp
1 5 10 15
Ile Leu Ile Gly Thr Val Arg Ile Asn Asn Ile Lys Asn Phe Ala Gly
20 25 30
Phe Gln Val Asn Ile Val Tyr Asp Pro Lys Val Leu Met Ala Val Asp
35 40 45
Pro Glu Thr Gly Lys Glu Phe Thr Ser Ser Thr Phe Pro Pro Gly Arg
50 55 60
Thr Val Leu Lys Asn Asn Ala Tyr Gly Pro Ile Gln Ile Ala Asp Asn
65 70 75 80
Asp Pro Glu Lys Gly Ile Leu Asn Phe Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile
85 90 95
Ala Gly Tyr Lys Glu Thr Gly Val Thr Glu Glu Ser Gly Ile Ile Ala
100 105 110
Lys Ile Gly Phe Lys Ile Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys Phe
115 120 125
Gln Asp Thr Leu Ser Met Pro Gly Ala Ile Leu Gly Thr Gln Leu Phe
130 135 140
Asp Trp Asp Gly Glu Val Ile Thr Gly Tyr Glu Val Ile Gln Pro Asp
145 150 155 160
<210> 8
<211> 891
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 8
tagtactatt aaagtcagac ttggttaaat ataaatttta tgacttgcat acaaacttga 60
tgtgtattat aataaaaata caaaacaaaa tagcaataat ttactcagtt atttttgaaa 120
tgggggtagt attaatatcg tataatgggg ttgcatatct gctgtctttc gaaaaaagca 180
caagaacttc aaatgtttcc atagtgaaat ttaaaaattg gagatttctt tgttgccccc 240
tcaaaaagta tatttttttc gaagatatat atatggaatt tattgattaa tttaagttat 300
taattttggc cttttagggt cgttgaaaac tgaatatgtt aagttgtttt gcgtgattca 360
gctgcatttg acgtaagact tcgccggtct gtttaaattc ccataataag atgtatttat 420
tgtagtaata atctggcatc tacaaatttc agtatttgca atagtctctg ttcaaaaaag 480
caattgtctt ttaaaccttt cagtattgtc ttcgtggcag tttcttttgt tatacgtcgt 540
tccgacaaaa aaatgtaaat ttatgtcaaa tgcgcggctg atttgataaa aaagtttgtt 600
aacacaaatt tattatgtta acacaagtat tttttgggtc cagcttagtt ttatgatgaa 660
aataatgcgt aaaatttatc cgcaaaaagg gggaatgaat ttattgcggg taggttgcat 720
tatttcatca tataacttaa aaagaataaa aaagtatatt tgaaagggga agatggagag 780
atggtaaaaa gcagaaagat ttctattctg ttggcagttg caatgctggt atccataatg 840
atacccacaa ctgcattcgc aggtcctaca aaggcaccta caaaagatgg g 891
<210> 9
<211> 59
<212> PRT
<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)
<400> 9
Tyr Gly Asp Leu Asn Gly Asp Lys Leu Val Asn Ser Ile Asp Phe Ala
1 5 10 15
Leu Leu Lys Ile Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Lys Glu Phe Pro Tyr Glu
20 25 30
Tyr Gly Ile Lys Ser Ala Asp Leu Asn Arg Asn Gly Glu Val Asp Ser
35 40 45
Ile Asp Phe Ala Ile Leu Arg Ser Phe Leu Leu
50 55
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> 白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)
<400> 10
Arg Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Val Val Asn Val Thr Asp Val Ala
1 5 10 15
Lys Ile Ala Ala His Val Lys Gly Lys Lys Ile Leu Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Leu Lys Asn Ala Asp Val Asn Phe Asp Gly Ser Val Asn Ile Thr Asp
35 40 45
Ile Thr Arg Ile Ala Ala Phe Val Lys
50 55
<210> 11
<211> 56
<212> PRT
<213> 黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)
<400> 11
Tyr Gly Asp Ala Asn Cys Asp Gly Asn Val Ser Ile Ala Asp Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Gln His Leu Gly Asn Arg Asp Lys Tyr Gly Leu Arg Ala
20 25 30
Gln Gly Met Leu Asn Ala Asp Val Asp Gly Gln Ser Gly Val Thr Ala
35 40 45
Asn Asp Ala Leu Val Leu Gln Lys
50 55
<210> 12
<211> 54
<212> PRT
<213> 解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)
<400> 12
Tyr Gly Asp Tyr Asn Asn Asp Gly Ser Ile Asp Ala Leu Asp Phe Ser
1 5 10 15
Ser Phe Lys Met Tyr Leu Met Asn Pro Val Arg Thr Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Leu Asp Leu Asn Ser Asp Asn Thr Val Asp Ala Ile Asp Phe Ala Ile
35 40 45
Met Lys Gln Tyr Leu Leu
50
<210> 13
<211> 57
<212> PRT
<213> 溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)
<400> 13
Tyr Gly Asp Val Thr Gly Asp Gln Leu Val Thr Asp Ala Asp Lys Thr
1 5 10 15
Lys Val Ser Asn Tyr Ile Leu Gly Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Ala Ala Ala Asp Val Asn Gly Asp Gln Val Val Asn Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Thr Leu Ile Asn Arg His Ile Leu
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> 解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)
<400> 14
Lys Gly Asp Val Asp Leu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Phe Gly
1 5 10 15
Lys Met Arg Leu Cys Leu Leu Gly Lys Ser Pro Ala Phe Thr Gly Gln
20 25 30
Ala Leu Asp Asn Ala Asp Leu Asn Asp Asp Gly Ala Phe Asn Ser Ile
35 40 45
Asp Phe Gly Tyr Met Arg Lys Lys Leu Leu
50 55

Claims (10)

1.采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:10，将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；当糖液中葡萄糖浓度为100-180g/L时，用于酵母菌发酵；当糖液中葡萄糖浓度为35-100g/L时，离心将固体沉淀与糖液分离，并将糖液浓缩至葡萄糖浓度不小于120g/L，用于酵母菌发酵；
(3)酵母菌发酵：糖化结束后，向厌氧发酵罐中补加5-20g/L的氮源，高温高压灭菌；然后接入活化的酵母菌种子液，在25-42℃的温度条件、5.5-6.5的pH条件下发酵36-120h，至葡萄糖浓度达到1-5g/L，获得乙醇发酵液；
(4)乙醇蒸馏：将步骤(3)得到的乙醇发酵液离心处理，将酵母菌体细胞与发酵后培养基进行固液分离，利用蒸馏法从发酵后培养基中获得纤维素乙醇。
2.根据权利要求1所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：所述纤维素酶制剂通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。
3.根据权利要求2所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：所述厌氧细菌为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌；所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。
4.根据权利要求2或3所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。
6.根据权利要求5所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接为：非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中；
所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中；所述融合表达为：非纤维小体蛋白的编码基因***到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结构域序列中间的基因组上。
7.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：步骤(2)所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH6.5-7.5；步骤(2)糖液分离之后得到的固体沉淀作为纤维素酶制剂，用于新一轮糖化。
8.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：步骤(3)补加的所述氮源为玉米浆、酵母提取物和蛋白胨中的一种或多种的组合；所述pH控制采用流加氨水的方式实现。
9.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求6所述的采用木质纤维素制备乙醇的方法，其特征在于：步骤(1)中预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于12％；步骤(2)糖化的温度条件为55-60℃；步骤(3)酵母菌发酵的温度条件为30-35℃；步骤(4)分离得到的酵母菌体细胞可以用于制备酵母饲料。
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