CN109055368B - 一种人类静脉血栓风险基因f5和pai-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人类静脉血栓风险基因f5和pai-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI‑1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒包括用于扩增与人类静脉血栓风险相关的基因F5和PAI‑1多态性的检测试剂、阳性对照品及阴性对照品组成，所述用于F5基因多态性的检测试剂包含用于扩增F5基因rs6025位点的引物序列、PNA序列和PCR反应液，所述用于PAI‑1基因多态性的检测试剂包括用于扩增PAI‑1基因rs1799762位点的引物序列、PNA序列和PCR反应液。本发明所述试剂盒具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

Description

一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学临床检测技术领域，具体涉及一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
血栓的形成是机体对血管壁损伤产生的正常保护性反应，当促凝刺激超过机体抑制血栓形成的自然保护能力时，血栓过度生长、超出生理范围而对机体造成伤害。静脉中形成血块(血栓)即为静脉血栓，形成静脉血栓的危险因素主要分为两类：一类是获得性危险因素；另一类是遗传性危险因素，例如抗蛋白S缺乏(Ⅰ型)、凝血因子ⅤLeiden(FVL)、异常纤维蛋白原血症及其他凝血相关病症。其中，FVL是VTE形成的最为普遍的遗传性危险因素，有FVL的人群常以反复发生动静脉血栓为主要临床表现。血浆高浓度PAI-1(组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂)的风险也逐渐被人们认知，4G等位基因风险指数较5G显著提升。
凝血因子Ⅴ(F5)基因位于1号染色体(1q23)，基因跨越70Kb，由25个外显子组成。凝血因子Ⅴ是凝血过程中重要的辅因子，它使凝血因子Xa激活凝血酶原，形成凝血酶。凝血酶切割纤维蛋白原形成纤维蛋白，纤维蛋白聚合形成构成血凝块的密集网状物。活化蛋白C(APC)是天然抗凝血剂，通过切割和降解凝血因子Ⅴ从而降低凝血的程度。F5第1691位核苷酸发生G→A的点突变(FVa)，使氨基酸序列上Arg506→Gln，导致APC无法灭活FVa，产生活化蛋白C抵抗现象(APCR)。突变后的FVa仍然保持促凝活性，凝血酶形成速度加快，导致高凝状态的形成。F5基因该SNP位点为rs6025(G>A)，也可以称为G1691A或1691(G>A)，基因型有AA、GA、GG。在2004年对丹麦人群中超过9,000位白种人成年人的研究中，AG和AA基因型分别比GG个体患静脉血栓栓塞的风险高2.7倍和18倍。血栓前状态的诊断对于血栓性疾病的预防治疗很重要，rs6025作为血栓高风险SNP对于预防诊断具有重要意义。
PAI-1蛋白是血浆中组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂，基因定位于7号染色体长臂7q21.3-22，长约12.2kb，正常血浆浓度的PAI-1通过抑制组织纤溶酶原激活物控制血浆纤维蛋白水解酶的水解作用来调节血液的凝血稳态。转录起始上游-675bp处存在的1个G***或缺失多态性rs1799762，即PAI-1 4G/5G***或缺失多态性，表现为3种基因型4G/4G,5G/5G和4G/5G。研究证明转录起始因子位点4G、5G等位基因均存在于不同人群中，5G基因与抑制蛋白结合后，覆盖了阻遏蛋白与其相结合的位点，空间结构的改变后干扰了PAI-1转录水平，而4G等位基因没有转录抑制位点，导致4G基因转录水平较5G基因高6倍，从而影响PAI-1血浆水平升高，血小板聚集趋势增加，增加形成静脉血栓的风险。有文献表明4G/4G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型(正常纤溶型)的6.35倍，4G/5G基因型者发生静脉血栓的风险是5G5G型的4.85倍。同样，rs1799762作为血栓高风险SNP对于预防诊断具有重要意义。
目前针对SNP检测的常用方法有很多种，包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、荧光定量PCR法、巢式PCR-探针法、原位杂交(ISH)等。最为常见的方法是测序法，该方法费用低，但耗时长、灵敏度不高；高分辨率熔解曲线法对设备要求比较高，不利于临床推广；传统的荧光PCR法在临床上应用较为广泛，但检测微量灵敏度不高。因此，我们建立一种操作方便、成本不高、较高灵敏度的荧光PCR法检测静脉血栓风险基因的多态性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
用于人类静脉血栓风险基因F5多态性检测的引物及PNA组，包括序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ IDNO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA。
用于人类静脉血栓风险基因PAI-1多态性检测的引物及PNA组，包括序列如SEQ IDNO.11所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.13所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.14所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.15所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.16所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ IDNO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA。
一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒，包括检测试剂1、检测试剂2、阳性对照品和阴性对照品；所述检测试剂1包含：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ IDNO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ IDNO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PCR反应液；
所述检测试剂2包括：序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.13所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.14所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.15所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.16所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PCR反应液；
所述阳性对照品包含：含F5基因rs6025-G、F5基因rs6025-A、PAI-1基因rs1799762-4G、PAI-1基因rs1799762-5G的重组质粒和含内参基因的重组质粒的混合物；
所述阴性对照为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒。
上述方案中，所述检测试剂1中，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述引物的浓度为100～400nM，序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.9所述引物的浓度为50～100nM，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所述PNA的浓度为50～100nM；所述检测试剂2中，序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所述引物的浓度为100～400nM，序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.9所述引物的浓度为50～100nM，序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.10所述PNA的浓度为50～100nM。
上述方案中，所述PCR反应液包括Premix qPCR MIX以及TE缓冲液。
上述方案中，所述阴性对照品为PUC-19质粒空载体。
上述人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒在制备用于人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测产品中的应用。所述试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：
(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；
(2)荧光定量检测：向反应管中加入待检测样本和检测试剂，同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；
(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。
上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。
上述方案中，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，采集荧光。
上述方案中，步骤(3)所述结果判定的准则为：①当阳性对照均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照均无FAM、VIC、ROX荧光起线，检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断F5基因rs6025的分型：VIC荧光信号起线，F5基因rs6025分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，F5基因rs6025分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，F5基因rs6025分型为杂合突变型；③根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断PAI-1基因rs1799762的分型：VIC荧光信号起线，PAI-1基因rs1799762分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，PAI-1基因rs1799762分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，PAI-1基因rs1799762分型为杂合突变型。
本发明试剂盒是基于ARMS-PNA-荧光定量PCR方法的基因多态性试剂盒，其技术原理如图1所示。本试剂盒所述检测试剂中包含3对普通扩增引物，5个带有荧光基团的鉴定引物，5个与鉴定引物配对的PNA序列。针对待检测基因的两条鉴定引物3’端为待测SNP位点碱基，5’端标记荧光基团，其中突变引物标记FAM荧光基团，野生引物标记VIC荧光基团。另外，内参基因的鉴定引物5’端标记ROX荧光基团。PNA(peptide nucleic acids，肽核酸)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，可以通过碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，当PNA与互补DNA完全匹配时，因其PNA为肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键能够阻止DNA扩增。PNA序列3’端标记淬灭基团BHQ，能够与鉴定引物匹配使未与模板链结合的鉴定引物无法释放荧光信号。扩增反应发生时，普通扩增引物将含有SNP位点的序列从基因组DNA中扩增出来，若鉴定引物脱离PNA序列与模板链结合，则鉴定引物会释放荧光信号，随着扩增循环数的增加，越来越多的鉴定引物与模板链结合，荧光信号逐渐放大；若鉴定引物与模板链不匹配则会与PNA序列保持配对无法释放荧光。同理，检测内参的鉴定引物会在反应中释放ROX荧光信号。最终检测结果中纯合野生型基因型呈现VIC和ROX荧光起线，纯合突变型基因型呈现FAM和ROX荧光起线，杂合型基因型呈现FAM、VIC和ROX荧光起线。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述试剂盒能够快速定性检测人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1的基因多态性，直接通过荧光线形判断结果，能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性进行基因分型；采用特异性荧光标记的鉴定引物、在一个PCR孔内、进行一个PCR反应即可完成基因的分型检测(不需要分孔分别进行突变、野生或内参的检测)，实现了每个基因的多态性分型只需通过一个多重PCR反应即可完成检测，大大降低了检测成本，提高了检测效率；
(2)本发明所述试剂盒的检测试剂是配制完成的成品，只需要加入待测样本即可进行PCR荧光反应，既节省了检测时间又提高了检测效率；同时本发明所述检测试剂中还含有内参基因引物，通过检测内参基因，可以使样本提取导致的假阴性和假阳性问题得以有效避免，保证检测结果的准确性；
(3)本发明所述试剂盒中通过携带荧光基团和标签序列的特异性鉴定引物可以被携带淬灭基团的PNA结合从而使荧光处于淬灭状态，在PCR反应过程中，携带荧光基团的鉴定引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；利用携带荧光的特异性鉴定引物结合携带淬灭基团的PNA、内控引物、内控鉴定引物、内控PNA，大大提高了基因分型的特异性和准确性，操作简便、结果可靠，能再1小时内完成检测分型；
(4)本发明所述试剂盒中含有4对普通扩增引物，能将含有SNP位点的序列从基因组DNA中扩增出来并进一步富集，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组DNA进行多态性检测；
(5)本发明所述试剂盒适用于普通荧光PCR仪，具有灵敏度和特异性高、假阳性低等优点，同时价格低廉、经济简便，利于医院临床上的应用推广。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。
图2为本发明所述试剂盒中针对F5基因的最低检测限(0.1ng/μL)检测结果。
图3为本发明所述试剂盒中针对PAI-1基因的最低检测限(0.1ng/μL)检测结果。
图4为利用本发明所述试剂盒检测F5基因rs6025纯合野生型扩增曲线。
图5为利用本发明所述试剂盒检测F5基因rs6025杂合突变型扩增曲线。
图6为利用本发明所述试剂盒检测F5基因rs6025纯合突变型扩增曲线。
图7为利用本发明所述试剂盒检测PAI-1基因rs1799762纯合野生型扩增曲线。
图8利用本发明所述试剂盒检测PAI-1基因rs1799762杂合突变型扩增曲线。
图9为利用本发明所述试剂盒检测PAI-1基因rs1799762纯合突变型扩增曲线。
图10为实施例4中F5基因rs6025位点纯合野生样本的检测结果图。
图11为实施例4中F5基因rs6025位点杂合突变样本的检测结果图。
图12为实施例4中PAI-1基因rs1799762位点纯合野生样本的检测结果图。
图13为实施例4中PAI-1基因rs1799762位点杂合突变样本的检测结果图。
图14为实施例4中PAI-1基因rs1799762位点纯合突变样本的检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒，包括检测试剂1、检测试剂2、阳性对照品和阴性对照品；所述检测试剂1针对F5基因rs6025多态性位点，包含：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ IDNO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ IDNO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PremixqPCR MIX和TE缓冲液；
所述检测试剂2包括：序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.13所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.14所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.15所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.16所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及Premix qPCR MIX和TE缓冲液；
所述阳性对照品包含：含F5基因rs6025-G、F5基因rs6025-A、PAI-1基因rs1799762-4G、PAI-1基因rs1799762-5G的重组质粒和含内参基因的重组质粒的混合物；
所述阴性对照为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒(PUC-19质粒空载体)。以上载体序列为本领域人员所熟知，此处不列举详细序列。
用于F5基因rs6025位点检测的引物和PNA序列，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2扩增产物为169bp，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.2扩增产物为84bp，SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.1扩增产物为128bp，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8扩增产物为138bp，SEQ ID NO.9与SEQ IDNO.8扩增产物为119bp。
上游扩增引物SEQ ID NO.1：5’-AGTGCTTAACAAGACCATAC-3’
下游扩增引物SEQ ID NO.2：5’-TAGCCAGAAGAAATTCTCAG-3’
野生鉴定引物SEQ ID NO.3：5’-VIC-AGCAGATCCCTGGACAGGCG-3’
突变鉴定引物SEQ ID NO.4：5’-FAM-AGGACAAAATACCTGTATTCCTT-3’
野生PNA序列SEQ ID NO.5：5’-CGCCTGTCCAGGGATCTGCT-BHQ-3’
突变PNA序列SEQ ID NO.6：5’-GAGGAATACAGGTATTTTGTCCT-BHQ-3’
内参上游引物SEQ ID NO.7：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’
内参下游引物SEQ ID NO.8：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’
内参鉴定引物SEQ ID NO.9：5’-ROX-TCCAGGGCGACGTAGCACAG-3’
内参PNA序列SEQ ID NO.10：5’-CTGTGCTACGTCGCCCTGGA-BHQ-3’
用于PAI-1基因rs1799762位点检测的引物和PNA序列，SEQ ID NO.11与SEQ IDNO.12扩增产物为126bp，SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.12扩增产物为71bp，SEQ ID NO.14与SEQ ID NO.11扩增产物为92bp，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8扩增产物为138bp，SEQ IDNO.9与SEQ ID NO.8扩增产物为119bp。
上游扩增引物SEQ ID NO.11：5’-TCCAACCTCAGCCAGACAAG-3’
下游扩增引物SEQ ID NO.12：5’-TCCCTCATCCCTGCCATGTG-3’
野生鉴定引物SEQ ID NO.13：5’-VIC-GAGTCTGGACACGTGGGGG-3’
突变鉴定引物SEQ ID NO.14：5’-FAM-ATGATACACGGCTGACTCCCCA-3’
野生PNA序列SEQ ID NO.15：5’-CCCCCACGTGTCCAGACTC-BHQ-3’
突变PNA序列SEQ ID NO.16：5’-TGGGGAGTCAGCCGTGTATCAT-BHQ-3’
内参上游引物SEQ ID NO.7：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’
内参下游引物SEQ ID NO.8：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’
内参鉴定引物SEQ ID NO.9：5’-ROX-TCCAGGGCGACGTAGCACAG-3’
内参PNA序列SEQ ID NO.10：5’-CTGTGCTACGTCGCCCTGGA-BHQ-3’
实施例2
一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒，包括检测试剂1、检测试剂2、阳性对照和阴性对照；所述检测试剂1、检测试剂2的各组成成分如下表1，所述试剂盒的组成由表2所示：
表1检测试剂组成
表2试剂盒组成
实施例3
使用实施例2制备的试剂盒检测样品的的最低检测限，具体包括如下操作步骤：
(1)使用天根生化生物技术公司全血DNA提取试剂盒提取5个人类外周血基因组DNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，得到人类基因组DNA待检测样本，将样本稀释至2ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL。
(2)取PCR八连管，分别在孔中加入20μL梯度稀释的样本；分别在每个孔中加入混合均匀的F5检测试剂30μL或PAI-1检测试剂30μL；将八连管震荡离心混匀反应液；
(3)将八连管放入ABI 7500荧光PCR仪中，进行扩增检测，PCR反应条件如表3：
表3 PCR反应程序
(4)分析结果：
分析5个样本的4个浓度梯度检测结果，F5与PAI-1结果基本一致：2～0.1ng/μL均能正确判读且Ct值≤17(试剂盒检测标准之一)，F5中有2个样本0.05ng/μL可以正确判读但Ct值>17，PAI-1中有4个样本0.05ng/μL可以正确判读但Ct值>17。重复检测20例样本0.1ng/μL均能正常分型且符合检测标准，将最低检测限定为0.1ng/μL，其中F5的样本浓度为0.1ng/μL的检测图结果如图2，PAI-1的样本浓度0.1ng/μL检测图结果如图3。
实施例4
使用实施例2制备的试剂盒检测待测样品，具体包括如下操作步骤：
(1)使用天根生化生物技术公司全血DNA提取试剂盒提取120个人类外周血基因组DNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，得到人类基因组DNA待检测样本(0.1～100ng/μL)；
(2)取PCR八连管，分别在孔中加入2μL待检测样本，一孔中加入2μL阳性对照品，一孔中加入2μL阴性对照品，补充18μL的ddH2O至20μL；每个孔中加入混合均匀的检测试剂30μL；将八连管震荡离心混匀反应液；
(3)将八连管放入ABI 7500荧光PCR仪中，进行扩增检测，PCR反应条件如表3：
(4)分析结果：
参考结果判读表(如表4所示)和结果判读参考图(如图4～9所示)，判读120个样本的基因型；
F5rs6025位点纯合野生样本119个，其中一个检测结果如图10；
F5rs6025位点杂合突变样本1个，检测结果如图11；
F5rs6025位点没有检测到纯合突变样本；
PAI-1rs1799762位点纯合野生样本30个，其中一个检测结果如图12；
PAI-1rs1799762位点杂合突变样本55个，其中一个检测结果如图13；
PAI-1rs1799762位点纯合突变样本35个，其中一个检测结果如图14。
表4结果判读
上述120例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。以上结果表明本试剂盒用于人类静脉血栓风险基因多态性检测结果可靠。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康录生物技术股份有限公司
<120>一种人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
<160> 16
<210> 1
<211> 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞1
agtgcttaac aagaccatac 20
<210> 2
<211> 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞2
tagccagaag aaattctcag 20
<210> 3
<211> 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞3
agcagatccc tggacaggcg 20
<210> 4
<211>23bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞4
aggacaaaat acctgtattc ctt 23
<210> 5
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞5
cgcctgtcca gggatctgct 20
<210> 6
<211>23bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞6
gaggaataca ggtattttgt cct 23
<210> 7
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞7
cgggacctga ctgactacct 20
<210> 8
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞8
ggccatctct tgctcgaagt 20
<210> 9
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞9
tccagggcga cgtagcacag 20
<210> 10
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞10
ctgtgctacg tcgccctgga 20
<210> 11
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞11
tccaacctca gccagacaag 20
<210> 12
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞12
tccctcatcc ctgccatgtg 20
<210> 13
<211>19bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞13
gagtctggac acgtggggg 19
<210> 14
<211>22bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞14
atgatacacg gctgactccc ca 22
<210> 15
<211>19bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞15
cccccacgtg tccagactc 19
<210> 16
<211>22bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞16
tggggagtca gccgtgtatc at 22

Claims (10)

1.引物及PNA组，其特征在于，包括：
(1)用于人类静脉血栓风险基因F5多态性检测的引物及PNA组，包括序列如SEQ IDNO.1
所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ IDNO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA；
(2)用于人类静脉血栓风险基因PAI-1多态性检测的引物及PNA组，包括序列如SEQ IDNO.11所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.13所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.14所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.15所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.16所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ IDNO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA。
2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括检测试剂1、检测试剂2、阳性对照品和阴性对照品；所述检测试剂1包含：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ IDNO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PCR反应液；
所述检测试剂2包括：序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.13所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ IDNO.14所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.15所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.16所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ IDNO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PCR反应液；
所述阳性对照品包含：含F5基因rs6025-G、F5基因rs6025-A、PAI-1基因rs1799762-4G、PAI-1基因rs1799762-5G的重组质粒和含内参基因的重组质粒的混合物；
所述阴性对照为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒。
3.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂1中，序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述引物的浓度为100～400nM，序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9所述引物的浓度为50～100nM，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所述PNA的浓度为50～100nM；所述检测试剂2中，序列如SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述引物的浓度为100～400nM，序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.9所述引物的浓度为50～100nM，序列如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.10所述PNA的浓度为50～100nM。
4.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Premix qPCRMIX以及TE缓冲液。
5.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为PUC-19质粒空载体。
6.权利要求2～5任一项所述检测试剂盒在制备用于检测人类静脉血栓风险基因F5和PAI-1多态性试剂盒产品中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，具体的检测方法包括如下步骤：
(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；
(2)荧光定量检测：向反应管中加入待检测样本和检测试剂，同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；
(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，采集荧光。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述结果判定的准则为：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断F5基因rs6025的分型：VIC荧光信号起线，F5基因rs6025分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，F5基因rs6025分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，F5基因rs6025分型为杂合突变型；③根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断PAI-1基因rs1799762的分型：VIC荧光信号起线，PAI-1基因rs1799762分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，PAI-1基因rs1799762分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，PAI-1基因rs1799762分型为杂合突变型。
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