CN109055263A - 降解重金属富集植株的微生物组合及降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，尤其涉及降解重金属富集植株的微生物组合及降解方法，所述微生物组合为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)‑白腐菌(P.chrysosporium)‑里氏木霉(T.ressei)‑强启动菌株QD‑1（Pterula sp.strain QD‑1），其中枯草芽孢杆菌:白腐菌:里氏木霉:强启动菌株=0.5‑1.5：0.5‑1.5:0.5‑1.5:0.5‑1.5。成本低、能耗少、绿色安全的微生物降解减容，对富集植物的降解效果和重金属浸出有着好的效果，极大程度、高效地降解木质纤维素以期实现生物质的高效降解和高量减容；菌株具有较好铀耐受性，菌株间无拮抗性。

Description

降解重金属富集植株的微生物组合及降解方法
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种降解重金属富集植株的微生物组合及降解方法。
背景技术
重金属材料在人类工业技术的发展中，一直是一种不可或缺的资源。随着现今越来越多的高新技术产业的形成，虽然产生了多种重金属替代材料，但是重金属资源的开采量以及需求量并未减少，反而人类对重金属矿产资源的开采大大增加。在重金属资源利用的过程中，包括矿区开采、尾矿堆放和矿石提炼以及后续加工利用均会造成局部重金属浓度过高，从而对周围环境产生影响，污染区域会随着雨水和流域逐渐扩大。
重金属污染的主要来源是由人为活动造成的，包括：工业垃圾的产生、化肥农药的滥用、污水灌溉和大气沉降等。重金属以其特殊的化学特性，对环境、生物的污染具有持久性和生物毒性。重金属可直接改变土壤水体化学组成，直接或间接破坏生态结构，并通过土壤水体-作物***迁移累积，进而影响人体健康。
随着现今工业的发展和核能的利用，导致铀矿以及各种金属矿的大量开采，从而造成大量的重金属污染。金属矿的开采和冶炼是造成重金属污染环境最主要的原因，因在此过程中会产生大量的重金属尾矿和废料，造成水体和地表环境的污染，进而影响到生态的变化。对于铀污染，世界上主要的铀污染场地主要包括：矿石开采和冶炼场地、退役的核电站、核武器试验场等。铀的毒性表现为化学毒性和放射毒性，铀主要发射能量较低的α射线从而造成内辐射。铀的半衰期长达上亿年，被铀污染的场地若不妥善治理，会对人类和动物的健康产生潜在的、长期的危害，因此有必要修复被铀污染的土地。另外，铀会伴生多种重金属，如铅、锶、镉。因此，铀污染区域多为复合重金属污染，使得污染修复异常复杂。
常规的物理和化学方法虽然可以用来处理水-土介质中的重金属，但因其成本高，易造成二次污染，处理过程对人体危害大，因而不易实地操作；相比起来，生物修复表现出更多的优点。迄今为止，重金属污染环境生物修复研究多局限在实验室内进行，仅有少数实验进入大田阶段。
植物修复技术是当前重金属污染修复领域的研究热点，然而有关修复后产生的重金属富集植物处置技术的研究相对缺乏。
但利用富集植物修复重金属污染会产生大量的重金属富集生物质，如若处置不当，则会引起二次污染。Blaylock等利用螯合剂EDTA强化印度芥菜(Brassica juncea)修复Pb污染土壤，结果发现每6周就能收获地上部干重高达6t/hm2，Pb的含量高达10000-15000mg/kg。 Chen等研究蜈蚣草(Pteris vittata L.)可作为修复As污染土壤的超富集植物，其鲜重可达36 t/hm2。重金属富集生物质处置技术作为植物提取修复技术的重要组成部分，该技术的短板被认为是制约植物修复工程化和商业化应用的重要原因之一。因此，重金属富集生物质安全处置技术是今后植物修复技术亟需解决的重要科学问题之一。
植物中的组成物质大部分都是纤维素、半纤维素和木质素，一般生物质中，纤维素成分大约在40％-50％之间，半纤维素约占10％-30％，以及木质素为20％-30％。而这些物质又难以被微生物降解利用，其中最难被微生物利用的是木质素。最大程度、最高效地降解木质纤维素以期实现生物质的高效降解和高量减容是目前所需。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种降解重金属富集植株的微生物组合及降解方法，细菌- 真菌组合，成本低、能耗少、绿色安全的微生物降解减容，对富集植物的降解效果和重金属浸出有着好的效果，大程度、高效地降解木质纤维素以期实现生物质的高效降解和高量减容；菌株有较好的铀耐受性，且菌株间无明显的拮抗性。
解决以上技术问题的一种降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述微生物组合为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)-白腐菌(P.chrysosporium)-里氏木霉(T.ressei)-强启动菌株QD-1 (Pterula sp.strain QD-1)，其中枯草芽孢杆菌:白腐菌:里氏木霉:强启动菌株＝0.5-1.5:0.5- 1.5:0.5-1.5:0.5-1.5。
所述枯草芽孢杆菌:白腐菌:里氏木霉:强启动菌株＝0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。
所述枯草芽孢杆菌:白腐菌:里氏木霉:强启动菌株＝1:1:1:1。
所述微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0；所述植物为黑麦草和水稻秸秆。
所述白腐菌、里氏木霉和强启动菌株三种菌分开用PDA培养基培养，所述细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；所述微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。
所述PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂0g或20g(液体培养基不加)，蒸馏水1L；培养基pH为6.8-7.2，优化方案中pH为7；所述细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂0g或20g(液体培养基不加)，蒸馏水 1L，pH 7.2-7.4。
所述马铃薯去皮，切块煮沸20min，4层纱布过滤，加入葡萄糖和/或琼脂，定容至1L。
所述菌种有驯化的过程，包括以下步骤：
菌悬液的制备：将已经培养了20h的菌株制成对数期种子液准备诱变。
紫外线诱变：实验前将超净工作台周围遮光，使光波被紫外灯照射30min的时间后处于稳定状态，在空平皿中加入4mL培养到20h的菌液并将其在距离紫外灯24cm的位置给予50min的照射，每隔一段时间对平皿进行转动。
在无菌环境中将诱变处理完毕的孢子悬液梯度稀释到10-4、10-5、10-6于分别含20、 50、100mg U的刚果红筛选培养基平板上涂布，在37℃(恒温)的条件下对被牛皮纸和黑塑料袋处理好的菌液做好记号后进行培养，筛选出的菌株为优势菌株。
本发明中降解重金属富集植株的降解方法，包括以下步骤：
(1)重金属富集植物蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
所述降解过程中，温度25-40℃，初始pH值6-7.5，富集植物截段长度1-2.5cm，初始含水量40-70％，尿素添加量1-2.5g/kg；优化方案中温度40℃，初始pH值7.5，富集植物截段长度1.5cm，初始含水量70％，尿素添加量2.5g/kg。
所述降解过程在中试降解池中反应，中试降解池包括设有降解池、通气管道、空气泵、挡板和通风口，降解池内为中空，挡板设在降解池内并靠近降解池底面；通风管道固定于挡板一侧面，通风口设于降解池顶端并靠近挡板侧；空气泵设于降解池外，通气管道穿过通风口与空气泵连接。
所述中试降解池长、宽、高分别为480mm、475mm、225mm；其容积为53.956dm3；所述挡板上还铺设有一层孔径边长为1mm的网格条，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间；所述挡板离降解池底面15mm处，预留空间占降解池总体积的6.3％。
本发明中植物可为黑麦草、水稻秸秆、木屑与滤纸等。
复合菌群降解木质纤维素的微生态原理主要有三种，包括菌群酶系互补、酶反馈作用的减弱以及复合微生物间的互利共生。天然木质纤维素原料中，木质素、纤维素和半纤维素本身的降解就很困难。并且纤维素被包围在木质素和半纤维素形成的结合层中，使得微生物酶解纤维素的难度进一步增加。由于单一的细菌、真菌和放线菌的组分酶种类较少或配比不均衡，所以单菌对木质纤维素的降解作用都比不上微生物复合群体的共同作用。
本发明中利用微生物处理重金属富集植物，真菌和细菌进行配伍，其中微生物间的竞争导致该物质的优势降解微生物的降解效果产生影响，第一是利用微生物的降解能力，对大量的富集植物进行减容处理；第二是利用微生物对富集植物的破坏能力，使得重金属从植物中分离。铀富集植物通过微生物的降解作用使生物质中的有机质得到降解和稳定，即有机质稳定化和殖化的过程。利用微生物处理富集生物质的优点有以下两点；第一，可以有效地降低生物质中的重金属含量；第二，可以降低富集生物质的重量和体积，便于运输和后续处理。既可减少生物质的干物质重量，又可降低重金属在固体生物质中的残留量。
本发明中菌株组合对U、Pb、Co、Cr、Cd、Sr，6种重金属的浸出率均在75％以上， Cr、Cd、Sr和Co的浸出率均在90％以上；相比于单一菌株对重金属的浸出率，6种重金属的平均浸出率均有所提高，其中U和Pb的浸出率分别提高了约16％，其余4种重金属Cd、 Cr、Sr和Co的浸出率不同程度上地提高了约3％-7％。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1为本发明中菌株组合对富集黑麦草中重金属的浸出效果图
(注：T2为细菌-真菌组合对重金属的浸出效果；CK1表示对富集黑麦草灭菌和不加菌的处理；CK2表示对富集黑麦草不灭菌和不加菌的处理)
图2为本发明中优化条件下菌株组合对富集黑麦草的降解效果图
(注：T2为细菌-真菌组合；CK1表示对富集黑麦草灭菌和不加菌的处理；CK2表示对富集黑麦草不灭菌和不加菌的处理)
图3为本发明中中试降解池中菌株组合对富集黑麦草的降解效果图
图4和图5为本发明中菌株组合降解富集黑麦草的SEM-EDX分析图
(注：A、C分别表示CK、T2组合处理组)
图6为本发明中菌株对富集黑麦草的总降解率图
(注：KC，枯草芽孢杆菌；强启动菌株QD-1；LS，里氏木霉；BF，白腐菌)
图7为本发明中三株真菌对富集黑麦草降解30d后的效果图
(注：A、B、C分别表示QD-1、里氏木霉、白腐菌对富集黑麦草30d的降解效果图)
图8为本发明中菌株分别对富集黑麦草中纤维素、半纤维素和木质素的降解效率图
(注：KC，枯草芽孢杆菌；强启动菌株QD-I；LS，里氏木霉；BF，白腐菌)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
黑麦草：经过污染土壤和废水修复后，黑麦草通过105℃条件下干燥30min，75℃烘干至恒重，根和茎叶均截断至1.5cm左右，保存备用。
试验菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为实验室保存菌株或从市场上购买回的菌株。白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)、里氏木霉(Trichoderma ressei)购买于中国微生物菌种保藏中心；强启动菌株QD-1(Pterula sp.strain QD-1)筛选于黑麦草腐烂基质中，为丝状真菌，通过18SrDNA-26SrDNA ITS序列分析的方法对参试的QD-1菌株进行了种属鉴定，初步确定该菌为Pterula sp.，命名为Pterula sp.strain QD-1。现将其保存于中国微生物菌种保藏中心(CGMCC No.12237)。其中没有特别说明的培养基为常规培养基。
实施例1
一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)-白腐菌 (P.chrysosporium)-里氏木霉(T.ressei)-强启动菌株QD-1(Pterula sp.strainQD- 1)，其中枯草芽孢杆菌:白腐菌:里氏木霉:强启动菌株＝0.5：0.5:1.5:1.5。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L；培养基pH为6.8。
马铃薯去皮，切块煮沸20min，4层纱布过滤，加入葡萄糖和/或琼脂，定容至1L。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH 7.4。
菌株驯化过程如下：
菌悬液的制备：将已经培养了20h的菌株制成对数期种子液准备诱变。
紫外线诱变：实验前将超净工作台周围遮光，使光波被紫外灯照射30min的时间后处于稳定状态，在空平皿中加入4mL培养到20h的菌液并将其在距离紫外灯24cm的位置给予50min的照射，每隔一段时间对平皿进行转动。
在无菌环境中将诱变处理完毕的孢子悬液梯度稀释到10-4、10-5、10-6于分别含20、 50、100mg U的刚果红筛选培养基平板上涂布，在37℃(恒温)的条件下对被牛皮纸和黑塑料袋处理好的菌液做好记号后进行培养，筛选出的菌株为优势菌株。
纤维素降解细菌和真菌的互作对纤维物质降解的影响，发现不同细菌与真菌共培养对木质纤维的降解效果有所不同，这种差异表现为共培养下的微生物间是抑制或促进作用；组合表现为促进作用的原因主要是某一菌株的代谢产物引起的，但是造成干物质降解率的增加还是由于纤维结合位点的作用；因此，本发明中组合有利于微生物的生长及对底物的发酵与利用。
实施例2
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)-白腐菌(P.chrysosporium)-里氏木霉(T.ressei)-强启动菌株 QD-1(Pterula sp.strain QD-1)，其中白腐菌:里氏木霉:QD-1＝1.5：1.5:0.5:0.5。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L；培养基pH为7.2。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH7.3。
实施例3
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，枯草芽孢杆菌:白腐菌: 里氏木霉:强启动菌株＝0.8：0.8:1.2:1.2。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；所述微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20g，蒸馏水1L；培养基pH为7。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH7.2。
实施例4
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，枯草芽孢杆菌:白腐菌: 里氏木霉:强启动菌株＝0.8：1.2:0.8:1.2。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；所述微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20g，蒸馏水1L；培养基pH为7。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH7.3。
实施例5
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，枯草芽孢杆菌:白腐菌: 里氏木霉:强启动菌株＝1:1:1:1。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L；培养基pH为7。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH7.4。
实施例6
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，枯草芽孢杆菌:白腐菌: 里氏木霉:强启动菌株＝0.9:1:1.1:1。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L；培养基pH为6.9。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1 L，pH7.3。
实施例7
其它内容如实施例1，一种降解铀富集黑麦草的微生物组合，枯草芽孢杆菌:白腐菌: 里氏木霉:强启动菌株＝0.7:1.3:0.9:1.2。
微生物组合菌浓度为OD600＝0.8，pH7.0。
白腐菌、里氏木霉和QD-1三种菌分开用PDA培养基培养，细菌由细菌培养基培养；放置于37℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L；培养基pH为7。
细菌培养基为LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH 7.2。
实施例8
其它内容如实施例5中内容，降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度40℃，初始pH值7.5，富集黑麦草截段长度2.5cm，初始含水量60％，尿素添加量2.5g/kg。
影响生物质降解效果的因素有很多，主要是指对降解微生物生长和产酶条件的影响因素，包括：微生物接种量、温度、含水率、通风、pH、C/N；通风可选择自然通风、定期翻堆、被动通风、强制通风和不通风等方式。对筛选的菌株组合进行了降解条件优化，优化因素包括温度、初始pH、黑麦草截段长度、初始含水量以及N源添加量(尿素)。
实施例9
其它内容如实施例5中内容，降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度25℃，初始pH值6，富集黑麦草截段长度2cm，初始含水量50％，尿素添加量1g/kg。
实施例10
其它内容如实施例1中内容，降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度30℃，初始pH值7，富集黑麦草截段长度1cm，初始含水量40％，尿素添加量2g/kg。
实施例11
其它内容如实施例4中内容，降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度35℃，初始pH值6.5，富集黑麦草截段长度2.5cm，初始含水量70％，尿素添加量1.5g/kg。
实施例12
其它内容如实施例5中内容，降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度38℃，初始pH值7.2，富集黑麦草截段长度2.3cm，初始含水量62％，尿素添加量2.3g/kg。
实施例13
降解铀富集黑麦草的微生物组合的降解方法，具体步骤如下：
(1)重金属富集黑麦草蒸汽灭菌；
(2)添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的微生物组合的菌悬液；
(3)降解，时间30天。
降解过程中温度40℃，初始pH值7.5，富集黑麦草截段长度2.5cm，初始含水量60％，尿素添加量2.5g/kg。
降解过程在中试降解池中反应，中试降解池包括设有降解池、通气管道、空气泵、挡板和通风口，降解池内为中空，挡板设在降解池内并靠近降解池底面；通风管道固定于挡板一侧面，通风口设于降解池顶端并靠近挡板侧；空气泵设于降解池外，通气管道穿过通风口与空气泵连接。强制通风通过风机对反应***通风供氧，在反应初期既提供充足的氧气，在高温期可控制温度、调节最适温度，在后期去除多余水分，加快堆体降温，同时操作简单、控控制方便。
中试降解池长、宽、高分别为480mm、475mm、225mm；其容积为53.956dm3；所述挡板上还铺设有一层孔径边长为1mm的网格条，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间；所述挡板离降解池底面15mm处，预留空间占降解池总体积的6.3％。
微生物对富集黑麦草的降解效果与微生物的生长状态息息相关。有机质种类、反应O2浓度、微生物种群和数量是影响有机质降解效率的主要因素。进入微生物细胞内的O2浓度决定呼吸作用的效率，直接影响有机质降解产物的种类和反应速率。生物质孔隙大小、物料粒径分布和含水率则影响O2的传质过程。较大的孔隙、较小的物料粒径及较低的含水率，可降低O2向水相扩散的阻力，提高O2传质效率，从而提高扩散进入细胞的O2浓度。
试验一：单一菌株对铀富集黑麦草的降解效果
处理方法：采用150mL三角瓶为降解容器，加入10g截段长度为1.5cm烘干的重金属富集黑麦草，封闭灭菌，加入90mL总量为10％的菌悬液，以加蒸馏水为对照组，每组平行3次，放置于37℃培养箱中培养30d。经过30d的降解后，取出降解残渣，用蒸馏水少量多次洗涤降解残渣至洗涤液清澈，降解容器清洗3次，滤纸过滤，收集洗涤液并测定其体积；残渣烘干至恒重，称量，通过测定降解前后黑麦草的失重，计算得到不同微生物对黑麦草降解的总降解率；分别通过ICP-MS测定黑麦草降解残渣和残液的重金属含量，计算得到不同微生物对重金属的浸出率。残渣进行纤维素、半纤维素和木质素含量的测定。总降解率和纤维素、半纤维素、木质素的降解率以及重金属浸出率的测定和计算方法如下(后面试验中测定方法相同)：
总降解率的测定方法
根据微生物降解重金属富集黑麦草前后的失重，可以直观的表现出微生物对重金属富集黑麦草的降解效果，经过以上处理方法处理后，降解率计算公式如：
Dr--重金属富集黑麦草的降解率(％)；M0--重金属富集黑麦草的初始干物质质量(g)；M1--重金属富集黑麦草降解后残余干物质质量(g)。
纤维素含量的测定采用蒽酮比色法，半纤维素含量的测定采用DNS比色法，木质素含量的测定采用乙酰溴比色法。
纤维素、半纤维素和木质素降解率的计算方法
分别经过重金属富集黑麦草降解前后纤维素、半纤维素和木质素含量的测定，纤维素、半纤维素、木质素的降解率计算公式如下。
Dr--三种物质的降解率(％)；C0--降解前黑麦草三种物质的含量(g/g)；M0-降解前样品质量(g)；C1--降解后黑麦草三种物质的含量(g/g)；M1--降解后样品质量(g)。
重金属浸出率的测定方法
样品处理过程如以上处理方法。重金属浸出率计算公式：
Lr--重金属浸出率(％)；C1--降解后残液重金属浓度(mg/L)；V1--降解后残液体积(L)；C2--降解后残渣重金属浓度(mg/kg)；M1--降解后残渣质量(kg)。
各项指标测定结果均以平均值±标准差表示，各指标均设置3个重复。采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计；运用DPS数据处理***对测定数据进行单因素方差分析和 LSD多重比较检验处理间差异程度统计分析，正交结果采用极差分析法；采用Origin 9.0软件进行绘图工作。
富集黑麦草初始成分及重金属含量分析
黑麦草的初始成分及重金属含量结果见表1。
表1富集黑麦草初始成分及重金属含量(干重)
试验采用微生物对富集黑麦草进行为期30d降解减容研究，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)、里氏木霉(T.ressei)和强启动菌株QD-1(Pterula sp.strain QD-1)3种真菌和1种细菌。富集黑麦草降解后的生物质失重率可表现出微生物的降解减容效果；测定富集黑麦草降解前后纤维素、半纤维素和木质素的含量变化以及降解残渣基团变化，可分析出不同微生物对重金属富集黑麦草降解的主要物质，从另一方面考察富集黑麦草的降解减容效果；另外，富集黑麦草降解后重金属的浸出率可有效地表现出重金属从固体生物质到降解残液的迁移效果。
菌株对富集黑麦草的总降解率
铀富集黑麦草经过灭菌后，分别接种4株降解菌株，根据菌株降解富集黑麦草前后的失重，可以直观的表现出菌株对富集黑麦草的总体降解效果，如图6。
各单一菌株对富集黑麦的降解率如图6所示。可以看出不同微生物对富集黑麦草单菌降解效果有所差异，其中降解效果较好的是2株真菌，为里氏木霉(T.ressei)和白腐菌(P. chrysosporium)，其降解率均达到60％以上；从图7可以直观地看出真菌对富集黑麦草的降解效果。另外一株真菌QD-I，是一种丝状真菌，其富集黑麦草降解率为52.55％。
菌株分别对富集黑麦草的纤维素、半纤维素和木质素的降解效果
经过30d的富集黑麦草降解过程，单一菌株对富集黑麦草中纤维素、半纤维素和木质素的降解效果如图8。从富集黑麦草的失重率来看，单一菌株对富集黑麦草的降解率在35％- 60％之间。从图8可以看出，每一种微生物对富集黑麦草中成分的影响变化差异较大。针对单一菌株对纤维素降解，降解效果最好的是里氏木霉，其降解率达到63.13％；其次是白腐菌对纤维素的降解，其降解率为57.68％。枯草芽孢杆菌对半纤维素的降解效果最好，其降解率达到55％。其余微生物对富集黑麦草纤维素的降解在38％左右。木质素是一种复杂的无定形高聚物，很难被酸与酶降解。总体来看，不同微生物对木质素的降解效果相比纤维素和半纤维素的降解效果均较差，其中最高的木质素降解率为QD-I菌株的31.15％。
菌株降解富集黑麦草后的重金属浸出效果
利用微生物处理重金属富集黑麦草的目的有两点；第一是利用微生物的降解能力，对大量的富集黑麦草进行减容处理；第二是利用微生物对富集黑麦草的破坏能力，使得重金属从黑麦草中分离。为取得富集黑麦草的微生物降解对重金属由生物质迁移到游离液态环境的情况，试验针对富集黑麦草的降解残渣与残液分别进行重金属含量测定，得到微生物对不同重金属浸出率的分析，如表2。
表2富集黑麦草微生物降解后的重金属浸出率(％)
(注：KC，枯草芽孢杆菌；强启动菌株QD-I；LS，里氏木霉；BF，白腐菌)
由上表2可以看出，不同重金属的浸出率存在显著差异。枯草芽孢杆菌对U的浸出率较高，QD-I对U的浸出率最高为68.33％，白腐菌的浸出率为56.12％。U在6重金属中，平均去除率最低，为61.65％；其余5种重金属的平均去除率均达到70％左右，Cr、Cd和Sr的去除率为80％以上。
试验二
其它操作内容如试验一中的内容，以两种组合为处理组，富集黑麦草灭菌且不加菌和黑麦草不灭菌且不加菌分别为对照组1(CK1)和对照组2(CK2)；统一处理条件为：降解温度37℃，降解时间30d，菌株添加比例均为1:1，菌悬液添加量为10％，黑麦草添加量10 g，截段长度1.5cm，液体添加量(含菌液)90mL。重金属富集黑麦草经过30d的降解过程，各处理组对黑麦草的降解率、纤维素、半纤维素和木质素的降解率如表3，以及对重金属的浸出率结果如图1。
表3菌株组合对富集黑麦草的降解效果
注：T2表示细菌-真菌组合处理；CK1表示富集黑麦草灭菌，不加菌处理；CK2表示富集黑麦草不灭菌，不加菌处理。
从表3菌株组合对富集黑麦草的降解效果来看，T2菌株组合对富集黑麦草的总降解率都在70％以上，对纤维素、半纤维素和木质素的降解；相对于单一微生物对黑麦草的降解效果，总体降解率提高了10％，在对纤维素的降解效果提高了约6％。
T2菌株组合对富集黑麦草中重金属的浸出率如图1所示。T2对U、Pb、Co、Cr、Cd、Sr，6种重金属的浸出率均在75％以上，Cr、Cd、Sr和Co的浸出率均在90％以上；相比于单一微生物对重金属的浸出率，6种重金属的平均浸出率均有所提高，其中U和Pb的浸出率分别提高了约16％，其余4种重金属不同程度上地提高了约3％-7％。
铀富集黑麦草经过微生物降解减容处理后，能够降解掉大量的木质纤维素成分，并使重金属有效地从固体中浸出，在一定程度上实现了重金属富集黑麦草的减量化和无害化处理，能综合提高富集黑麦草的降解效果和重金属浸出效果，使降解后的产物更利于后续处理。这对其进一步的资源化利用具有重要的意义，并为重金属富集生物质的微生物降解减容技术提供了一定的工程应用依据。
在自然界中不仅是高等真菌对木质纤维素的转化起重要作用，而且木质素纤维素的降解是由细菌、真菌及相应的微生物群落共同作用的结果。细菌在木质素纤维素降解过程中主要起着间接作用，能在一定程度上使木质素纤维素结构发生改性，成为水可溶的聚合产物，矿化木质素产生CO2。
在天然木质纤维素原料中，木质素、纤维素和半纤维素本身的降解就很困难。并且纤维素被包围在木质素和半纤维素形成的结合层中，使得微生物酶解纤维素的难度进一步增加。由于单一的细菌、真菌和放线菌的组分酶种类较少或配比不均衡，所以单菌对木质纤维素的降解作用都比不上微生物复合群体的共同作用。
试验三
在不考虑通风的情况下，采用正交实验研究分别从温度(A)、初始pH(B)、截段长度(C)、初始含水率(D)、尿素(N源，E)等几方面，考察富集黑麦草降解减容的最佳工艺参数，微生物组合的因素及水平设计见表4；
表4微生物组合正交实验设计因素和水平
重金属富集黑麦草(DW)通过高温高压蒸汽灭菌后，添加不同浓度和不同量的无菌尿素溶液，同时添加接种量为10％的菌悬液，T2组合添加比例为，枯草芽孢杆菌：白腐菌:里氏木霉:QD-1＝1:1:1，设置三组平行。按照设置的不同优化条件要求进行实验，降解周期为30d。采用失重率为考察指标，判定菌株组合在不同条件下对富集黑麦草的降解效果。
结果与分析
细菌-真菌组合对富集黑麦草的降解工艺分析
控制细菌-真菌组合的降解条件，温度(A)、初始pH(B)、黑麦草截段长度(C)、初始含水率(D)以及尿素添加量(E)，并设置4个水平，采用L16(45)正交实验确定细菌- 真菌组合最优降解条件。经过30d降解过程后，测定富集黑麦草降解率得到正交结果如表 4-4：
表4-4细菌-真菌组合降解条件正交优化结果
从表4-4可以看出，细菌-真菌组合在不同降解条件组合下，对富集黑麦草的降解率与真菌组合相比，细菌-真菌组合降解率受到降解条件的影响较小，其降解率除A2B3C4D1E2组合以外，其余条件组合的降解率均在60％以上，最高降解率为A4B1C4D2E3组合的69.85％，略低于真菌组合A4B4C1D3E2处理组的72.59％。
表4-5细菌-真菌组合条件优化极差分析结果
由表4-5的细菌-真菌组合条件优化极差分析结果可知，最优条件组合为A4B4C2D4E4，即温度为40℃，初始pH值为7.5，富集黑麦草截段长度为1.5cm，初始含水量为70％，尿素添加量在2.5g/kg。通过对极差对比分析发现，5个因素的影响程度依次为A＞B＞D＞E＞ C。
优化条件下菌株组合对富集黑麦草的降解效果
通过正交实验确定了两种降解菌株组合对富集黑麦草的优化降解条件。T2组合的优化降解条件为：温度40℃，初始pH 7.5，富集黑麦草截段长度1.5cm，初始含水量70％，尿素添加量2.5g/kg，需要验证降解微生物组合在优化条件下对富集黑麦草的降解效果。
在T2组合优化条件下，考察其对富集黑麦草的降解效果。同样从黑麦草的降解率、纤维素、半纤维素和木质素的降解率以及黑麦草中重金属的浸出率对富集黑麦草的降解效果进行考察，如图2。表示T2组合在优化条件下对富集黑麦草的降解效果，分别从富集黑麦草的降解率和纤维素、半纤维素以及木质素的降解率进行分析。由图2中可以看出，菌种组合对纤维素降解率均高于半纤维素降解率和木质素，达到70％以上，木质素的降解水平较低，整体降解率在40％左右。
降解材料类型、降解环境氧浓度、温度、pH、水分以及微生物都是是影响生物质降解速率的主要因素，其中微生物种群数量和生长状态是影响生物质降解的决定性因素，一切条件都是以微生物为中心点而变化。降解环境氧浓度决定了降解微生物的呼吸效率，从而对微生物的生长状态、传质效率和新陈代谢产物造成影响。另外，降解生物质的孔隙大小、粒径分布、含水率则影响氧的传质过程和环境温度的变化。在降解过程中，基质中某些可溶性物质，如可溶性糖类、脂肪和蛋白等均可直接被微生物分解利用，而像纤维素、半纤维素和木质素等物质则需要微生物经过产生酶类水解转化才能被利用。可溶性物质和降解性物质在微生物细胞内进行分解与合成代谢，分解代谢则产生一些CO2、H2O和NH3等物质，而合成代谢生成细胞物质进而促进微生物繁殖，二者过程相辅相成。随着微生物的代谢过程，生物质组分和水分发生变化，随之降解材料的孔隙结构和力学特性也发生变化，从而基质产生沉降现象，达到生物质降解减容的效果。
在微生物对生物质的降解减容过程中，温度变化有一定的规律。一般是随着降解时间的增加，温度不断上升，直至达到最高温度，在维持一段时间后开始下降。环境pH同样会影响到生物质降解效果，并且由于微生物的种类或种群的不同，而需要的pH值也不同。温度、含水率以及降解环境pH等因素对微生物降解生物质的效果有显著的影响。
优化条件下微生物组合对富集黑麦草降解效果分析
在优化降解条件下，细菌-真菌组合(T2)在条件优化后，对富集黑麦草的降解率为76.72％，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为76.37％、68.38％、44.21％，对U、Cr、Cd、Co和Sr的浸出率分别为79.93％、97.64％、95.27％、94.80％和96.41％。
试验三
中试降解池：长、宽、高分别为480mm、475mm、225mm；其容积为53.956dm3；
通气管道：外径，8.58mm；内径，4.18mm；
空气泵：ACO电磁式，功率为80W，压力0.03MPa，输气量为88L/min。
挡板：长、宽、高分别为460mm、360mm、8mm，穿透行列22*11，直径为5mm的孔洞，通风面积为190cm2，约占降解池底部面积的11.5％。
氧气是需氧微生物在生长过程中所必须的环境条件。本研究采用通风泵向中试降解池中通入自然空气，通气管道埋置于富集黑麦草降解环境的下方，空气由下至上流通。
中试降解池以高为15mm的底座支撑挡板，预留空间约占降解池总体积的6.3％，通风管固定于挡板侧面，并于靠近挡板侧开通风口。挡板上铺一层孔径边长为1mm的网格材料，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间。
组合菌株降解富集黑麦草中试实验
设置真菌组合(T1)和对照等处理，对照组不加菌株，利用塑料筐、硅胶管、塑料板和通风泵组成中试降解池，每组重金属富集黑麦草的添加量为干重600g，茎叶与根部重量比为1:1；降解池初始装料体积约为降解池的71％；降解条件按照表7的参数进行试验。
表7微生物组合降解富集黑麦草的优化条件
经过中试降解过程后，富集黑麦草的降解率计算分析，纤维素、半纤维素和木质素的分析以及富集黑麦草的重金属浸出率计算分析。
结果与分析：菌株对富集黑麦草的中试降解效果：
菌株组合分别在优化降解条件下，对重金属富集黑麦草在持续通风和中途补充水分的情况下进行为期30d的中试降解实验。完成30d的降解过程后，通过对样品处理取样，分别测定总降解率、纤维素、半纤维素和木质素的降解率以及重金属的浸出率，以考察菌株组合对富集黑麦草的降解效果。
由图3可以看出，在中试降解池中T2组合对重金属富集黑麦草的总降解率、纤维素、半纤维素的降解，以及在中试降解环境对重金属富集黑麦草的降解效果表现良好，T2的总降解率将接近80％，纤维素和木质素的降解率分别达到74.46％和51.84％。。
试验四
菌株组合降解富集黑麦草的SEM-EDX分析
为了表征菌株组合在中试降解环境下对富集黑麦草的降解微观形态，采用电子扫描显微镜-能谱仪(SEM-EDX)对富集黑麦草降解残渣进行分析。
对富集黑麦草降解前后进行了SEM-EDX观察，观察结果如图4和图5所示。由图4可以看出，在富集黑麦草降解前，黑麦草的表面由致密的层状结构组成，并有较为完整的皱褶纹路，表面沾染一些残渣碎片，对观察结果存在一定影响。由图5，可以看出富集黑麦草经过T1组合菌株降解后，黑麦草表面结构疏松多孔，皱褶纹路被破坏，并形成大小不一的缺口，产生了大量的残渣碎片，一些黑麦草组成结构如表皮、维管束等均遭到破坏，这可能与微生物的降解作用造成植物组成结构中的纤维素、半纤维素和木质素结构的降解破坏有较大关系。另外，由每组的EDX扫描结果可以看出，富集黑麦草降解残渣中均存在微量的U。
中试降解环境和灭菌环境的差异在于，中试降解环境是一个开放的环境，降解材料量大，并定期通风补水；而灭菌环境是一个相对比较封闭的环境，空气流动小，降解空间较小。通过对比菌株组合在两种环境中对富集黑麦草的降解效果，可以分析出环境差异对富集黑麦草降解的影响。
开放环境下，黑麦草得降解过程采取通风和补水措施，对菌株组合的降解效果有着显著地提高。菌株组合在优化条件下的灭菌环境中，总降解率、纤维素、半纤维素和木质素降解率最高分别为76.72％、76.37％、68.38％和44.21％；在中试环境下，总降解率、纤维素、半纤维素和木质素降解率最高分别为79.70％、74.46％、74.44％和51.84％。通过对比菌株组合在两种环境中对黑麦草的降解效果发现，在中试降解环境下，菌株组合对富集黑麦草的总降解率、半纤维素和木质素的降解率分别有不同程度的提高。对U、Pb的最高浸出率分别为 78.26％、88.42％，Co和Cd的浸出率在94％左右，Cr、Sr的浸出率均达到95％以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1. 降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述微生物组合为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)-白腐菌(P. chrysosporium)-里氏木霉(T. ressei)-强启动菌株QD-1(Pterula sp. strain QD-1)，其中枯草芽孢杆菌: 白腐菌:里氏木霉:强启动菌株=0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5。
2.根据权利要求1所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌: 白腐菌:里氏木霉:强启动菌株=0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。
3.根据权利要求1所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌: 白腐菌:里氏木霉:强启动菌株=1:1:1:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述微生物组合菌浓度为OD600= 0.8，pH7.0；所述植物为黑麦草、水稻秸秆、木屑和滤纸。
5.根据权利要求1所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述白腐菌、里氏木霉和强启动菌株三种菌分开用PDA培养基培养，所述细菌由细菌培养基培养；放置于37 ℃恒温摇床中150rpm培养48h，然后分开取菌液进行复配；所述微生物组合用匀浆机将菌球打散，并再以无菌PDA培养基调节菌浓度。
6.根据权利要求5所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂0 g或20 g，蒸馏水1 L；培养基pH为6.8-7.2，优化方案中pH为7；所述细菌培养基为LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂０g或20g，蒸馏水1 L ，pH 7.2-7.4。
7.根据权利要求1所述的降解重金属富集植株的微生物组合，其特征在于：所述菌种有驯化的过程，包括以下步骤：
（1）菌悬液的制备：将已经培养了的菌株制成对数期种子液准备诱变；
（2）紫外线诱变：实验前将超净工作台周围遮光，使光波被紫外灯照射后处于稳定状态，在空平皿中加入4 mL培养到20 h的菌液并将其在距离紫外灯24 cm的位置给予50 min的照射，每隔一段时间对平皿进行转动；
（3）在无菌环境中将诱变处理完毕的孢子悬液梯度稀释到10-4、10-5、10-6于分别含20、50、100mg U的刚果红筛选培养基平板上涂布，在恒温的条件下对被牛皮纸和黑塑料袋处理好的菌液做好记号后进行培养，筛选出的菌株为优势菌株。
8.根据权利要求1所述的一种降解重金属富集植株的降解方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）重金属富集植物蒸汽灭菌；
（2）添加无菌尿素溶液，同时添加接种量为10%的微生物组合的菌悬液；
（3）降解，时间30天。
9.根据权利要求7所述的一种降解重金属富集植株的降解方法，其特征在于：
所述降解过程中，温度25-40℃，初始pH值6-7.5，富集植物截段长度1-2.5 cm，初始含水量40-70%，尿素添加量1-2.5 g/kg；优化方案中温度40℃，初始pH值7.5，富集植物截段长度1.5 cm，初始含水量70%，尿素添加量2.5 g/kg。
10.根据权利要求6所述的一种降解重金属富集植株的降解方法，其特征在于：所述降解过程在中试降解池中反应，中试降解池包括设有降解池、通气管道、空气泵、挡板和通风口，降解池内为中空，挡板设在降解池内并靠近降解池底面；通风管道固定于挡板一侧面，通风口设于降解池顶端并靠近挡板侧；空气泵设于降解池外，通气管道穿过通风口与空气泵连接；优化方案中所述中试降解池长、宽、高分别为480 mm、475 mm、225 mm；其容积为53.956 dm3；进一步优化方案中所述挡板上还铺设有一层孔径边长为1 mm的网格条，以防止实验材料从通风口进入底部预留空间；优化方案中所述挡板离降解池底面15 mm处，预留空间占降解池总体积的6.3%。
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