CN109045304B - 一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体，所述纳米载体由介孔二氧化硅纳米颗粒、包载在介孔二氧化硅纳米粒孔道内部的Polymerase I抑制剂、涂覆在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的多巴胺及修饰在介孔二氧化硅纳米粒表面的能特异性靶向核仁素的核酸适配体构成。首先制备得到介孔二氧硅纳米颗粒，再制备负载Polymerase I抑制剂的纳米颗粒，然后用多巴胺封堵二氧硅纳米颗粒孔道，最后用链接有核酸适配体的聚乙二醇对二氧化硅纳米颗粒进行化学修饰；本发明制备得到的纳米载体具有高的药物包封率，好的生物组织相容性和核仁靶向性，在制备抗肿瘤药物方面具有较大的应用前景。

Description

一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料生物技术领域。更具体地，涉及一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
核酸适配体（Aptamer）,一般由30-50个碱基组成的单链寡聚核苷酸（RNA）或单链寡聚脱氧核苷酸（DNA）。它能特异结合蛋白，小分子，离子和细胞等多种靶分子。核酸适配体有Szostak 和Gold等人发明的，具有许多其他抗体难以媲美的优势。目前，利用SELEX技术可以筛选出特异性与靶蛋白亲和力结合的核酸适配体（Aptamer）。经过十几年的发展，SELEX技术已发展为一种重要的工具和研究手段，绝大多数核酸适配体都是通过SELEX筛选获得的，这种技术主要由4个重要步骤：包括建库、筛选、分离、PCR扩增，对所需核酸适配体能否筛选成功有重要的影响，其中PCR是一个比较关键的环节,在此环节中以筛选得到的核酸为模板，在DNA酶的作用下进行扩增。理论上来说，通过SELEX技术可以获得任何靶目标的核酸适配体，截止日前，利用SELEX技术已获得了很多与人类疾病密切相关的核酸适配体，例如，血管内皮生长因子（VEGF）、凝血酶、hnRNPA1蛋白、核仁素等核酸适配体。
CX-5461是第一个被发现的polymerase I（Pol I）转录酶特异性抑制剂。CX-5461能够通过抑制SL1和rDNA的相互作用，进而抑制转录前复合体的形成，抑制rRNA（ribosomalRNA）转录。此外，研究表面低浓度的CX-5461不会抑制polymerase II介导的mRNA合成，也不会抑制DNA的复制。这说明CX-5461有效的在核仁部位累积对其药物效果的发挥具有重要作用。然而目前却还未见可有效促进CX-5461的在核仁部位累积的药物或方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有Polymerase I抑制剂在应用中无法有效发挥药效的缺陷和不足，提供一种基于核酸适配体的靶向递送Pol I抑制剂的纳米载体。利用具有核仁素靶向的核酸适配体修饰包载Pol I抑制剂的介孔二氧化硅纳米颗粒，从而将Pol I抑制剂高效率和靶向地递送到核仁中，提高药效。
本发明的第一个目的是提供一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体。
本发明的第二个目的是提供所述纳米载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述纳米载体的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体，由介孔二氧化硅纳米颗粒、包载在介孔二氧化硅纳米粒孔道内部的Polymerase I抑制剂、涂覆在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的多巴胺及修饰在介孔二氧化硅纳米粒表面的聚乙二醇构成；所述聚乙二醇连接有靶向核仁的核酸适配体。
所述介孔二氧硅纳米颗粒可高效包载同Polymerase I抑制剂，PDA可以有效封堵二氧硅纳米颗粒孔道，而连接有靶向核仁的核酸适配体的PEG修饰可以提高纳米粒子的生物相容性和核仁靶向性，可以有效将Polymerase I抑制剂靶向输送到核仁部位，发挥其抗肿瘤效果。
优选地，所述Polymerase I抑制剂为CX-5461以及类似物或衍生物。
具体地，所述纳米载体的结构通式为：MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt，其结构呈现圆球状，直径大小约100纳米；BET表面积为923.6 m2/g，孔体积平均是1.31 cm3/g，BJH计算的孔直径大约为3.11 nm。
优选地，所述核酸适配体为AS1411，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，末端修饰有巯基（SH）。
AS1411序列：5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-SH-3'（SEQ ID NO：1）。
上述携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体的制备方法为先制备得到介孔二氧硅纳米颗粒，再制备负载Polymerase I抑制剂的纳米颗粒，然后用多巴胺封堵二氧硅纳米颗粒孔道，最后用链接有核酸适配体的聚乙二醇对二氧化硅纳米颗粒进行化学修饰，制备得到携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体。
优选地，所述介孔二氧硅纳米颗粒通过溶解凝胶法制备得到。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
S1.溶解凝胶法制备得到介孔二氧硅纳米颗粒；
S2.将介孔二氧硅纳米颗粒、Polymerase I抑制剂与NaOH溶液混合，调节溶液pH值约8.5，吸附过夜，再加入多巴胺，反应4～6 h；
S3.向H2N-PEG-Mal中加入靶向核仁的核酸适配体，再加入TCEP常温下反应2～4h，得到连接核酸适配体的聚乙二醇；
S4.将S3得到的产物加入到S2中，反应2～4 h，离心，用PBS洗涤若干次，离心，即得。
优选地，S2介孔二氧硅纳米颗粒、Polymerase I抑制剂、NaOH溶液与多巴胺的质量体积比为10 mg：2 mg：3 mL：2 mg。
更优选地，所述Polymerase I抑制剂为CX-5461以及类似物或衍生物。
更优选地，所述核酸适配体为AS1411。
本发明还请求保护所述纳米载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体，纳米载体的粒径约100纳米，纳米BET表面积是923.6 m2/g，孔体积平均是1.31 cm3/g, BJH计算的孔直径大约为3.11 nm；所述纳米载体具有高的药物包封率，好的生物组织相容性和核仁靶向性，可将Polymerase I抑制剂靶向输送到核仁，显著提高药物的治疗效果，在制备抗肿瘤药物中具有较大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1 MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米靶向载体的制备流程图。
图2为实施例1 MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米粒透射电镜检测图。
图3为实施例1 MSNs- CX-5461@PDA-PEG-Apt BET纳米硅孔径分析图。
图4为实施例1 MSNs- CX-5461@PDA-PEG-Apt纳米靶向载体傅里叶红外光谱检测图。
图5为凝胶电泳验证实施例1 MSNs- CX-5461@PDA-PEG-Ap核酸适配体AS1411连接成功。
图6为MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料对核仁靶向性。
图7为MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料MTT检测细胞活性。
图8为MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料克隆形成检测。
图9为MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料治疗后肿瘤体积测定。
图10为MSNs- CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料治疗后肿瘤重量测定。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt纳米靶向载体的制备
1、制备方法
（1）利用正硅酸四乙酯（TEOS）在C16TAB和NH4F溶液中，通过磁力搅拌下加热回流水解制备得到纳米硅球；
（2）然后使用浓盐酸和无水乙醇混合液洗涤，去除纳米硅球介孔内的表面活性剂，为保证模板剂剂能够完全除去，此过程重复3次；
（3）最终真空干燥后得到介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs），MSNs为白色粉末，在水中具有很好的分散性，无絮集结块现象，并且长时间放置，也表现的十分稳定，不易产生沉淀；
（4）将10 mg MSNs，2 mg CX-5461，3 mL NaOH混合，调节溶液pH值约8.5，吸附过夜。第二天加入2 mg多巴胺（Dopamine），反应5 h；
（5）将核酸适配体Apt-SH（10 OD）加入H2N-PEG-Mal（1mg），再加入TCEP（20µg）常温下反应3小时；
（6）然后把（5）得到的产物加入到（4）中，反应3小时。离心，用PBS（pH 7.4）洗涤3次。离心，最后装到2个1.5 mL的小离心管中，冷冻保存；即得到带负载CX-5461核仁靶向纳米载体MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt。
2、MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt纳米靶向载体的表征
（1）透射电镜（TEM）检测：为了观察MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt的形态和大小，我们执行了投射电镜研究。结果如图2所示，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt呈现圆球状，直径大小约100纳米。
（2）纳米硅孔径分析：通过Brunauer–Emmett–Teller（BET）容量法分析了纳米粒的表面区，同时利用Barrett Joyner Halenda（BJH）方法对孔大小和体积进行了分析。结果如图3所示，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt的BET表面积是923.6 m2/g，孔体积平均是1.31 cm3/g，BJH计算的孔直径大约为3.11 nm。
（3）傅里叶红外光谱检测（FT-IR）：傅立叶变换红外光谱仪一般用于进行红外吸收曲线测定，同时通过特征红外吸收峰以及标准谱图库检索对样品中有机化合物进行官能团进行解析，从而辅助判断样品主体物质。结果如图4所示，所有的纳米粒子都含有1043.6cm-1和956.5 cm-1的峰，对应着Si-O键。当加入PDA后，在3390～3150 cm-1处出现了N-H/O-H34的峰。进一步，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt纳米粒在1351 cm-1和872 cm-1 处出现峰值，代表H2N-PEG-APt被成功偶联到了纳米硅球上了。
3、凝胶电泳验证核酸适配体AS1411连接成功
（1）配置3%的琼脂糖凝胶，精密称取0.3g的琼脂糖（agrose ），以稀释的电极缓冲液Tris-EDTA（TEA）为溶剂，用沸水浴或微波炉配制3%浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，***梳子，自然冷却。即为3%的琼脂糖凝胶。
（2）上样：按Marker、核酸适配体（aptamer）、MSNs@PDA-PEG、MSNs@PDA-PEG-APt上样，为跑胶做好准备。
（3）在平胶框中加入适量的Tris-EDTA（TEA）缓冲液，在60V下跑胶，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。
（4）染色和拍照
用荧光染料溴乙锭（EB）染色后，在紫外光下观察DNA条带，拍照。结果如图5所示，链接上aptamer的MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt纳米粒子经过EB染色后，显示出了强的荧光，说明aptamer连接成功。
实施例2 MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt纳米材料对核仁的靶向性检测
1、方法
（1）用高糖的DMEM，在37℃，5% CO2下培养Hela细胞，用12孔板的培养皿，每个孔放入一个灭过菌的盖玻片，用细胞种板，第二天细胞汇合度达到70%-90%。
（2）第二天分别用FITC标记的MSNs@PDA-PEG和MSNs@PDA-PEG-APt的两种纳米材料处理，在0.5和2.5小时时分别取样，然后进行后续激光共聚焦实验。
（3）激光共聚焦显微镜检测：细胞用PBS洗3遍；用4%的多聚甲醛或甲醇固定15min，吸掉多聚甲醛用PBS洗3次；0.1% Triton-100打孔，约7-10min,用PBS洗3次；用3%的BSA（现配：精确称取1.5g的BSA，用50mL的PBS溶解）封闭2h；用DAPI染核（加1µg/mL的DAPI50-100 µL，刚好覆盖住玻片），10min；在玻片上加20-50µL的封片剂，盖上处理好的盖玻片；在激光共聚焦显微镜下，观察拍照。
2、结果
结果如图6所示，未链接Apatamer的MSNs@PDA-PEG主要定位在细胞质中，而链接上aptamer的MSNs@PDA-PEG-APt纳米材料显著增加了在核质和核仁中靶向效果（箭头所示位置为核仁）。
实施例3 体外细胞增殖测定生物活性实验
（1）MTT实验：用高糖的DMEM，在37℃，5% CO2下培养Hela细胞；待细胞状态良好，用96孔板种板；第二天用制备好的药物或材料来处理，在不同时间点取样（12h，24h，48h）；每孔加入5mg/mL的MTT，培养4h；去掉培养基，每孔加150µL的DMSO，在摇床上，10min；在酶标仪上测OD值（490nm波长），结果如图7所示，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt组对细胞的抑制效果远远大于其他组的处理。
（2）克隆形成实验：用高糖的DMEM，在37℃，5% CO2下培养Hela细胞；用六孔板来种板，用细胞计数板来计数，每个孔里大概种2000个细胞；第二天加入制备好的药物或材料；养7-14天，观察长出克隆的情况；用PBS洗2次，用甲醇固定15min；弃固定液，用水冲洗干净；用0.1%的结晶紫染色；晾干，拍照。结果如图8所示，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt组对细胞的抑制效果显然大于其他组别的处理。
实施例4 体内抑制肿瘤效果实验
（1）首先建立裸鼠肿瘤模型：从广东动物中心购买30只裸鼠，饲养一个星期左右，然后在裸鼠腋下接种Hela细胞，两个星期以后等种的瘤长的差不多大，对种好瘤的裸鼠进行随机分组，分为五组，每组5只，分别用：Saline（生理盐水）、CX-5461、MSNs-CX-5461@PDA、MSNs-CX-5461@PDA-PEG、MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt来尾静脉注射。平均每隔2天注射一次。
（2）肿瘤体积计算方法如下：在第一天药物注射时开始记录并随时观察并记录每组裸鼠的生存情况，每2天测量肿瘤大小并对其进行体重称量，约7次。
肿瘤体积计算方法如下：肿瘤体积计算公式：长×宽×宽/2.
结果如图9所示，MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt对肿瘤的生长具有最好的抑制效果。
（3）肿瘤重量测定：对裸鼠进行药物注射后第30天对全部植了宫颈瘤的裸鼠进行解剖，取出其肿瘤组织，并测量每个肿瘤组织的质量和体积，并对其进行数据处理，结果如图10所示，显示制备的新型MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt处理组平均肿瘤重量最低；表明上述制备得到的MSNs-CX-5461@PDA-PEG-APt可显著挺高CX-5461的药效。

Claims (7)

1.一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体，其特征在于，由介孔二氧化硅纳米颗粒、包载在介孔二氧化硅纳米颗粒孔道内部的Polymerase I抑制剂、涂覆在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的多巴胺及修饰在介孔二氧化硅纳米颗粒表面的聚乙二醇构成；所述聚乙二醇连接有靶向核仁的核酸适配体；
所述Polymerase I抑制剂为CX-5461；
所述核酸适配体为AS1411，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的纳米载体，其特征在于，所述纳米载体的结构通式为：MSNsCX-5461@PDA-PEG-APt。
3.根据权利要求1所述的纳米载体，其特征在于，所述聚乙二醇为H2N-PEG-Mal。
4.权利要求1～3任一项所述携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，先制备得到介孔二氧化硅纳米颗粒，再制备负载Polymerase I抑制剂的纳米颗粒，然后用多巴胺封堵二氧化硅纳米颗粒孔道，最后用连接有核酸适配体的聚乙二醇对二氧化硅纳米颗粒进行化学修饰。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.溶解凝胶法制备得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
S2.将介孔二氧化硅纳米颗粒、Polymerase I抑制剂与NaOH溶液混合，调节溶液pH值约8.5，吸附过夜，再加入多巴胺，反应4～6h；
S3.向H2N-PEG-Mal中加入靶向核仁的核酸适配体，再加入TCEP常温下反应2～4h，得到连接核酸适配体的聚乙二醇；
S4.将S3得到的产物加入到S2中，反应2～4h，离心，用PBS洗涤若干次，离心，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S2所述介孔二氧化硅纳米颗粒、Polymerase I抑制剂、NaOH溶液与多巴胺的质量体积比为10mg：2mg：3mL：2mg。
7.权利要求1～3任一项所述纳米载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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