CN109030451B - Cars显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置和方法，包括飞秒激光器(1)、斯托克斯光脉冲光路、泵浦光脉冲光路、光谱分析仪(12)、聚焦物镜(15)、三维电控载物台(16)、集光物镜(17)、短通滤光片(18)和信号检测及数据处理***(19)；计算残余泵浦光脉冲和用作斯托克斯光的光孤子之间的相对时延，即同路时延；根据残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲的干涉光谱振荡强度确定残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲重叠时所需可调空间光延时线的时延，即异路时延；根据同路时延和异路时延估算可调空间光延时线调节时CARS显微成像***中超短脉冲的时间重叠度。本发明有利于CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠的闭环反馈控制，提高了测量效率。
Description
技术领域
本发明涉及非线性光纤光学、脉冲时延控制及非接触光谱显微成像领域，特别是涉及一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量的装置和方法。
背景技术
相干反斯托克斯拉曼散射(CoherentAnti-Stokes Raman Scattering,CARS)显微成像技术是一种利用物质中分子的共振能级信息进行成像的非接触、无标记显微技术。CARS显微成像技术的本质是泵浦光、探测光、待测样品共振能级的四波混频效应，其中泵浦光和斯托克斯光的频差等于待测样品的目标化学键共振能级，当泵浦光和斯托克斯光同时聚焦至待测样品，且三者满足相位匹配条件时，将激发出待测样品的反斯托克斯拉曼散射信号，即CARS信号。由于CARS信号是相干信号并且相对于泵浦光和斯托克斯光蓝移，因此有利于滤除待测样品荧光背景的干扰，提高显微成像***的对比度。CARS信号是基于三阶非线性过程的四波混频效应而产生的，所以仅在聚焦点处的很小范围内产生，具有本质的三维层析能力。因此CARS显微成像技术在活体细胞生命活动、蛋白质形成、细胞脂膜传输等非接触显微成像领域具有广泛的应用。
目前，为了提高CARS显微成像***的性能，研究人员已经提出了诸如时间分辨、偏振控制、相干控制、傅里叶变换、频率调制、双光梳等技术。在CARS显微成像技术中，泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间重叠是至关重要的，通常使用光延时线或步进电机位移台实现两者之间的时间重叠，但是由于泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间宽度很窄，只有几百飞秒至几皮秒，因此直接通过光电探测器和示波器检测泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间重叠是非常困难的。同时，由于基于孤子自频移效应的CARS显微成像***中传输时延的波长相关性，在对待测样品的完整拉曼共振谱线进行测量时，需要根据泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的频差不断调节两者的相对时延以保证间重叠，因此泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲之间的时间重叠存在着调谐困难、调节时间长的缺点。
然而很少有文献讨论CARS显微成像***中超短脉冲的时间重叠问题，目前已有的光延时线调谐仍然是大范围扫描并根据是否出现CARS信号作为泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠的依据。因此现有的时延调节方式不利于CARS显微成像***中脉冲时间重叠的闭环反馈控制以及***的自动化测量，降低了其在实际应用中的使用价值。本发明涉及一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量的装置和方法，基于广义非线性薛定谔方程的理论计算和超短脉冲的干涉光谱，估算CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠时所需的时延，本发明的提出有利于CARS显微成像***中时延调节的高效自动化进行，提高***测量效率，减少***前期准备工作，促进CARS显微成像***在实际中的应用。
发明内容
本发明提出的一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置和方法，充分利用高非线性光子晶体光纤输出光中的残余泵浦光，将其用作中间媒介，实现时间重叠度测量。
本发明提出一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置，该装置包括飞秒激光器1、电控液晶波片2、偏振分束棱镜3、斯托克斯光脉冲光路、泵浦光脉冲光路、光谱分析仪12、第三反射镜13、长通滤光片14、聚焦物镜15、三维电控载物台16、集光物镜17、短通滤光片18和信号检测及数据处理***19；其中：
所述飞秒激光器1与电控液晶波片2的输入端连接，所述电控液晶波片2的输出端与所述偏振分束棱镜3连接，所述偏振分束棱镜3输出端分别是所述斯托克斯光脉冲光路和所述泵浦光脉冲光路，其中所述斯托克斯光脉冲光路由光纤耦合镜4、高非线性光子晶体光纤5、光纤准直扩束器6和合束器11依序连接构成；所述泵浦光脉冲光路由第一反射镜7、第一、第二直角反射棱镜81、82和高精度电控位移台83组成的可调空间光延时线8、第二反射镜9、二分之一波片10和合束器11依序连接构成；所述合束器11的输出分两路，一路与光谱分析仪12连接，另一路与第三反射镜13连接，所述第三反射镜13与长通滤光片14、聚焦物镜15、三维电控载物台16、集光物镜17、短通滤光片18和信号检测及数据处理***19依序连接；
所述飞秒激光器1输出脉宽为百飞秒量级、水平线偏振的飞秒脉冲，经电控液晶波片2后入射至偏振分束棱镜3，偏振分束棱镜3将入射光脉冲分为一路水平偏振光和一路竖直偏振光；
在所述斯托克斯光脉冲光路中，水平偏振光经光纤耦合镜4耦合进高非线性光子晶体光纤5，高非线性光子晶体光纤5由于孤子自频移效应产生光孤子用作CARS显微成像***的斯托克斯光脉冲，高非线性光子晶体光纤5的输出光经光纤准直扩束器6入射至合束器11在所述泵浦光脉冲光路由所述竖直偏振光经第一反射镜7入射至可调空间光延时线8，第一直角反射棱镜81将入射泵浦光脉冲反射至固定于高精度电控位移台83的第二直角反射镜82，同时将第二直角反射棱镜82反射回来的光脉冲通过其另一直角边反射输出，高精度电控位移台83用于改变泵浦光路的时间延迟，确保泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间重叠；可调空间光延时线8输出的泵浦光脉冲依次经第二反射镜9、二分之一波片10入射至合束器11；
所述光谱分析仪12用于接收由合束器11反射的高非线性光子晶体光纤5的输出光和透射的泵浦光脉冲，检测高非线性光子晶体光纤5输出光中的残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲的干涉光谱；
斯托克斯光脉冲经所述合束器11的透射光和泵浦光脉冲经所述合束器11的反射光合束后，经所述第三反射镜13和所述长通滤光片14入射至聚焦物镜15，所述三维电控载物台16上的待测样品透射的CARS信号由所述集光物镜17收集后，经所述短通滤光片18滤除杂散光，入射至所述信号检测和数据处理***19。
本发明的一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量方法，该方法至少包括以下步骤：
步骤1、计算孤子自频移效应所产生的光孤子和残余泵浦光脉冲的时间延时，即同路时延τ1：
τ1＝τsolution-τpump
其中，τsolution表示孤子的时延，τpump表示入射泵浦脉冲的时延；
步骤2、水平偏振的飞秒脉冲经电控液晶波片实现偏振方向的旋转，偏振方向旋转后的飞秒脉冲经偏振分束棱镜分为功率连续可调的水平偏振光脉冲和竖直偏振光脉冲；
步骤3、水平偏振光脉冲经光纤耦合镜进入高非线性光子晶体光纤，将由高非线性光子晶体光纤的孤子自频移效应产生的波长可调谐的光孤子作为斯托克斯光脉冲；竖直偏振光依次经第一反射镜、可调空间光延时线、第二反射镜和二分之一波片，实现泵浦光脉冲的时间延时调节和偏振由竖直方向旋转为水平方向调节；
步骤4、泵浦光脉冲经合束器的透射光脉冲和斯托克斯光脉冲经合束器的反射光脉冲入射至光谱分析仪，检测高非线性光子晶体光纤产生的残余泵浦光和泵浦光的干涉光谱，确定残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲时间重叠时可调空间光延时线的延时量，即异路时延τ2：
τ2＝τ(max[∫|I(λ,τ)-Iref(λ,τ)|dλ])
其中，I(λ,τ)表示干涉光谱幅值随波长λ和时延τ的变化，Iref(λ,τ)表示残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲相互远离时光谱分析仪接收到的参考光谱信息；
步骤5)、根据同路时延τ1和异路时延τ2，估算CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠所需的延时量τ：
τ＝τ1+τ2
并调节可调空间光延时线，使泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲实现时间重叠；
步骤6、将时间重叠的泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲经第三反射镜、长通滤光片和聚焦物镜后入射至待测样品，激发待测样品不同空间位置处的CARS信号；收集待测样品产生的CARS信号并经短通滤光片滤除杂散光后，分析CARS信号的强弱及空间分布，重构待测样品中特性化学键的空间分布。
与现有技术相比，本发明的一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置和方法有利于CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠的闭环反馈控制，提高***自动化程度和测量效率，减少***前期准备工作，促进CARS显微成像***在实际中的应用。
附图标记
图1为CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠估算原理图；
图2为基于广义非线性薛定谔方程计算的同路时延及其线性拟合结果；
图3为本发明的CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量的装置结构图。
附图标记：
1、飞秒激光器，2、电控液晶波片，3、偏振分束棱镜，4、光纤耦合镜，5、高非线性光子晶体光纤，6、光纤准直扩束镜，7、第一反射镜，8、可调空间光延时线，9、第二反射镜，10、二分之一波片，11、合束器，12、光谱分析仪，13、第三反射镜，14、长通滤光片，15、聚焦物镜，16、三维电控载物台，17、集光物镜，18、短通滤光片，19、信号检测及数据处理***；
81、第一直角反射棱镜，82、第二直角反射棱镜，83、高精度电控位移台。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步的详细描述。
如图1所示，为CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠估算原理图。飞秒脉冲输出分为两束，一束用于泵浦高非线性光子晶体光纤，由孤子自频移效应产生的光孤子用作CARS显微成像***的斯托克斯光，而高非线性光子晶体光纤输出的残余泵浦光脉冲用作***中时间重叠度测量的中间媒介，另一束飞秒脉冲用作CARS显微成像***的泵浦光脉冲。首先通过广义非线性薛定谔方程理论计算高非线性光子晶体光纤中残余泵浦光脉冲和光孤子的相对延时量，即同路时延τ1；然后根据残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲在可调空间光延时线扫描时的干涉光谱，根据干涉光谱的振荡强度确定残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲时间重叠时的时延量，即异路时延τ2；根据同路时延τ1和异路时延τ2，即可确定可调空间光延时线扫描时CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间重叠度。
其中，同路时延τ1计算公式如下(τ1＝τsoliton-τpump，τsoliton表示孤子的时延，τpump表示入射泵浦脉冲的时延)：
根据广义非线性薛定谔方程计算高非线性光子晶体光纤中光孤子和残余泵浦光脉冲的相对延时量，广义非线性薛定谔方程如下所示：
其中，A表示光波振幅，z表示传输距离，β2表示光纤的二阶色散参数，β3表示光纤的三阶色散参数，α表示光纤的衰减，γ表示光纤的非线性系数，TR表示拉曼响应，ω0表示入射光波的中心波长，T表示沿光纤径向移动的坐标系中的时间变量，vg表示群速度。
异路时延τ2计算公式：
τ2＝τ(max[∫|I(λ,τ)-Iref(λ,τ)|dλ])
根据残余泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的干涉光谱计算残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲时间重叠，其理论依据如下所示：
其中，I(λ,τ)表示干涉光谱幅值随波长λ和时延τ的变化，I0(λ)表示残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲的原始光谱，为简化分析，假设残余泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲具有相同形状和幅度的光谱。Iref(λ,τ)表示残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲相互远离时光谱分析仪接收到的参考光谱信息。
如图3所示，为本发明的CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置结构示意图。该装置包括飞秒激光器1、电控液晶波片2、偏振分束棱镜3、光纤耦合镜4、高非线性光子晶体光纤5、光纤准直扩束器6、第一反射镜7、可调空间光延时线8(由第一直角反射棱镜81、第二直角反射棱镜82和高精度电控位移台83组成)、第二反射镜9、二分之一波片10、合束器11、光谱分析仪12、第三反射镜13、长通滤光片14、聚焦物镜15、三维电控载物台16、集光物镜17、短通滤光片18以及信号检测及数据处理***19。
飞秒激光器1输出脉宽为百飞秒量级、水平线偏振的飞秒脉冲，经电控液晶波片2后入射至偏振分束棱镜3，偏振分束棱镜3将入射光脉冲分为一路水平偏振光和一路竖直偏振光：
水平偏振光经光纤耦合镜4耦合进高非线性光子晶体光纤5，高非线性光子晶体光纤5的输出光经光纤准直扩束器6入射至合束器11。
竖直偏振光经第一反射镜7入射至可调空间光延时线8，可调空间光延时线8由两个直角反射棱镜81、82和一个高精度电控位移台83组成，第一直角反射棱镜81将入射泵浦光脉冲反射至固定于高精度电控位移台83的第二直角反射镜82，同时将第二直角反射棱镜82反射回来的光脉冲通过其另一直角边反射输出，高精度电控位移台83用于改变泵浦光路的时间延迟。可调空间光延时线8输出的泵浦光脉冲依次经第二反射镜9、二分之一波片10入射至合束器11。
光谱分析仪12用于接收由合束器11反射的高非线性光子晶体光纤5的输出光和透射的泵浦光脉冲。
高非线性光子晶体光纤5输出光经合束器11的透射光和泵浦光经合束器11的反射光合束后，经第三反射镜13和长通滤光片14入射至聚焦物镜15，待测样品置于位于聚焦物镜焦点处的三维电控载物台16上，由待测样品透射的CARS信号由集光物镜17收集后，经短通滤光片18入射至由光电倍增管和数据采集卡组成的信号检测和数据处理***19。
本发明的一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量的方法，该方法主要包括以下步骤：
步骤1、根据广义非线性薛定谔方程和高非线性光子晶体光纤的参数，计算孤子自频移效应所产生的光孤子和残余泵浦光脉冲的时间延时，即同路时延τ1，其计算结果如图2所示。可以看出，当光孤子波长从800nm逐渐增加至1300nm时，同路时延τ1从1ps逐渐增加至45ps；
步骤2、飞秒脉冲激光器输出的水平线偏振的飞秒脉冲经电控液晶波片实现偏振方向的旋转，且其旋转角度与电控液晶波片所施加的调制电压有关。偏振方向旋转后的飞秒脉冲经偏振分束棱镜分为功率连续可调的水平偏振光脉冲和竖直偏振光脉冲；
步骤3、其中一束水平偏振光脉冲经光纤耦合镜进入高非线性光子晶体光纤，将由高非线性光子晶体光纤的孤子自频移效应产生的波长可调谐的光孤子作为斯托克斯光脉冲；另一束竖直偏振光依次经第一反射镜、可调空间光延时线、第二反射镜和二分之一波片，实现泵浦光脉冲的时间延时调节和偏振由竖直方向旋转为水平方向调节。
步骤4、泵浦光束经合束器的透射光脉冲和斯托克斯光束经合束器的反射光脉冲入射至光谱分析仪，检测高非线性光子晶体光纤产生的残余泵浦光和泵浦光的干涉光谱，根据干涉光谱的强度确定残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲时间重叠时可调空间光延时线的延时量，即异路时延τ2；
步骤5、根据所计算的同路时延τ1和所测量的异路时延τ2估算CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠所需的延时量，并相应的调节可调空间光延时线，使泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲实现时间重叠；
步骤6、将时间重叠的泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲经第三反射镜、长通滤光片和聚焦物镜后入射至待测样品。激发待测样品不同空间位置处的CARS信号。收集待测样品产生的CARS信号并经短通滤光片滤除杂散光后，分析CARS信号的强弱及空间分布，重构待测样品中特性化学键的空间分布。
Claims (2)
1.一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量装置，其特征在于，该装置包括飞秒激光器(1)、电控液晶波片(2)、偏振分束棱镜（3）、斯托克斯光脉冲光路、泵浦光脉冲光路、光谱分析仪(12)、第三反射镜(13)、长通滤光片(14)、聚焦物镜(15)、三维电控载物台(16)、集光物镜(17)、短通滤光片(18)和信号检测及数据处理***(19)；其中：
所述飞秒激光器(1)与电控液晶波片(2)的输入端连接，所述电控液晶波片(2)的输出端与所述偏振分束棱镜(3)连接，所述偏振分束棱镜(3)输出端分别是所述斯托克斯光脉冲光路和所述泵浦光脉冲光路，其中所述斯托克斯光脉冲光路由光纤耦合镜(4)、高非线性光子晶体光纤(5)、光纤准直扩束器(6)和合束器(11)依序连接构成；所述泵浦光脉冲光路由第一反射镜(7)、第一、第二直角反射棱镜(81)、(82)和高精度电控位移台(83)组成的可调空间光延时线(8)、第二反射镜(9)、二分之一波片(10)和合束器(11)依序连接构成；所述合束器(11)的输出分两路，一路与光谱分析仪(12)连接，另一路与第三反射镜(13)连接，所述第三反射镜(13)与长通滤光片(14)、聚焦物镜(15)、三维电控载物台(16)、集光物镜(17)、短通滤光片(18)和信号检测及数据处理***(19)依序连接；
所述飞秒激光器(1)输出脉宽为百飞秒量级、水平线偏振的飞秒脉冲，经电控液晶波片(2)后入射至偏振分束棱镜(3)，偏振分束棱镜(3)将入射光脉冲分为一路水平偏振光和一路竖直偏振光；
在所述斯托克斯光脉冲光路中，水平偏振光经光纤耦合镜(4)耦合进高非线性光子晶体光纤(5)，高非线性光子晶体光纤(5)由于孤子自频移效应产生光孤子用作CARS显微成像***的斯托克斯光脉冲，高非线性光子晶体光纤(5)的输出光经光纤准直扩束器(6)入射至合束器(11)；
在所述泵浦光脉冲光路由所述竖直偏振光经第一反射镜(7)入射至可调空间光延时线(8)，第一直角反射棱镜(81)将入射泵浦光脉冲反射至固定于高精度电控位移台(83)的第二直角反射镜(82)，同时将第二直角反射棱镜(82)反射回来的光脉冲通过其另一直角边反射输出，高精度电控位移台（83）用于改变泵浦光路的时间延迟，确保泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲的时间重叠；可调空间光延时线(8)输出的泵浦光脉冲依次经第二反射镜(9)、二分之一波片(10)入射至合束器(11)；
所述光谱分析仪(12)用于接收由合束器(11)反射的高非线性光子晶体光纤(5)的输出光和透射的泵浦光脉冲，检测高非线性光子晶体光纤(5)输出光中的残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲的干涉光谱；
斯托克斯光脉冲经所述合束器(11)的透射光和泵浦光脉冲经所述合束器(11)的反射光合束后，经所述第三反射镜(13)和所述长通滤光片(14)入射至聚焦物镜(15)，所述三维电控载物台(16)上的待测样品透射的CARS信号由所述集光物镜(17)收集后，经所述短通滤光片(18)滤除杂散光，入射至所述信号检测和数据处理***(19)。
2.一种CARS显微成像***中超短脉冲时间重叠度测量方法，其特征在于，该方法至少包括以下步骤：
步骤(1)、计算孤子自频移效应所产生的光孤子和残余泵浦光脉冲的时间延时，即同路时延τ1，
τ1＝τsolution-τpump
其中，τsolution表示孤子的时延，τpump表示入射泵浦脉冲的时延；
步骤(2)、水平偏振的飞秒脉冲经电控液晶波片实现偏振方向的旋转，偏振方向旋转后的飞秒脉冲经偏振分束棱镜分为功率连续可调的水平偏振光脉冲和竖直偏振光脉冲；
步骤(3)、水平偏振光脉冲经光纤耦合镜进入高非线性光子晶体光纤，将由高非线性光子晶体光纤的孤子自频移效应产生的波长可调谐的光孤子作为斯托克斯光脉冲；竖直偏振光依次经第一反射镜、可调空间光延时线、第二反射镜和二分之一波片，实现泵浦光脉冲的时间延时调节和偏振由竖直方向旋转为水平方向调节；
步骤(4)、泵浦光脉冲经合束器的透射光脉冲和斯托克斯光脉冲经合束器的反射光脉冲入射至光谱分析仪，检测高非线性光子晶体光纤产生的残余泵浦光和泵浦光的干涉光谱，确定残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲时间重叠时可调空间光延时线的延时量，即异路时延τ2，
τ2＝τ(max[∫|I(λ,τ)-Iref(λ,τ)|dλ])
其中，I(λ,τ)表示干涉光谱幅值随波长λ和时延τ的变化，Iref(λ,τ)表示残余泵浦光脉冲和泵浦光脉冲相互远离时光谱分析仪接收到的参考光谱信息；
步骤(5)、根据同路时延τ1和异路时延τ2，估算CARS显微成像***中泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲时间重叠所需的延时量τ：
τ＝τ1+τ2
并调节可调空间光延时线，使泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲实现时间重叠；
步骤(6)、将时间重叠的泵浦光脉冲和斯托克斯光脉冲经第三反射镜、长通滤光片和聚焦物镜后入射至待测样品，激发待测样品不同空间位置处的CARS信号；收集待测样品产生的CARS信号并经短通滤光片滤除杂散光后，分析CARS信号的强弱及空间分布，重构待测样品中特性化学键的空间分布。
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