CN109022512B - 一种生物合成Hispidin的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物合成Hispidin的方法。本发明提供了一种生物合成Hispidin的方法，包括如下步骤：以火木层孔菌培养液的上清液作为生物合成体系，在所述生物合成体系中加入4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮或4‑羟基‑6‑甲基‑2‑吡喃酮和3,4‑二羟基苯甲醛进行反应，即得到Hispidin。本发明提供的hispidin的生物合成方法，污染少，得率高，得到最大产量的hispidin，浓度为25.86mg/L。

Description

一种生物合成Hispidin的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生物合成Hispidin的方法。
背景技术
Hispidin(6-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)(化合物结构见式1)是真菌中常见的具有抗氧化作用的多酚类化合物，于1961年首次从粗毛黄褐孔菌(Polyporus hispidus Bull.:Fr)分离得到。研究表明，hispidin广泛存在于药食两用菌中，具有抗糖尿病、抗病毒以及抗A549,SCL-1,Bel7402和Capan-1等肿瘤细胞活性，并有大量研究集中在抗肿瘤和抗氧化作用机制方面。以hispidin为关键前体物质合成的衍生物在大型药用真菌中普遍存在，大部分具有较强的抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等活性。鉴于hispidin衍生物结构独特及较强的抗氧化活性，这类成分一直吸引众多研究者们的关注，并有学者认为hispidin衍生物是药用真菌中抗氧化作用最重要的药效物质基础。
Figure GDA0003171150960000011
火木层孔菌(Phellinus igniarius)属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属，又称鲍氏层孔菌。其子实体——桑黄是我国传统药用真菌，味甘、辛、无毒，寄生于桑、柳、桦及杨等树的树干上，为多年生。桑黄除了具有传统的治疗淋病、崩漏、带下、排毒、和胃止泻等功效外，还具有抗癌、抗脂质过氧化、免疫调节、保肝、抗肝硬化和抗诱变等药用功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生物合成Hispidin的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮，得到Hispidin；
或用火木层孔菌或其培养液或其发酵液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛，得到Hispidin。
上述方法包括如下步骤：向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮或4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛进行反应，得到Hispidin。
上述方法中，所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.02-0.5mg/mL；
或，所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mg/mL或0.1mg/mL。
上述方法中，所述3,4-二羟基苯甲醛在其所在体系中的浓度为0.1mg/mL。
上述方法中，所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；
所述培养时间为15-25天。
所述培养时间为15天到20天。
上述方法中，所述反应的时间为20小时-10天。
上述方法中，所述反应的时间为60小时。
上述方法还包括如下步骤：
若采用火木层孔菌的培养液的上清液，则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin；
若采用火木层孔菌的培养液，则先将所述反应的产物过滤菌丝体，再用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin。
由上述方法制备的Hispidin也是本发明保护的范围。
本发明提供hispidin的生物合成方法，该方法污染少，得率高。
附图说明
图1为培养后的TLC分析结果。
图2为hispidin的HPLC图谱。
图3为hispidin的NMR图谱。
图4为Hispidin标准曲线。
图5为4-羟基-6-甲基吡喃酮标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中Hispidin的生物合成过程如下：
Figure GDA0003171150960000021
实施例1、生物合成Hispidin
采用培养火木层孔菌20天的液体培养液作为生物催化体系，加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛继续培养24h，经分离纯化和NMR鉴定后，得到活性化合物hispidin，且从1H NMR谱中质子积分可知trans/cis hispidin各占50％；具体见下面描述。
一、生物合成方法
1、生物合成体系的制备
采用液体马丁培养基【葡萄糖(20g/L)、蛋白胨+酵母粉(7g/L)、磷酸氢二钾(1g/L)、无水硫酸镁(0.5g/L)，pH自然】30℃摇床震荡培养火木层孔菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC NO.5.95)20天，培养液离心(常温4000rpm离心15分钟)后，取培养液上清20mL分装到50mL锥形瓶中作为生物合成体系。
2、生物合成
实验分为如下几组：
实验组：含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物：4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛，使4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度均达到约0.1mg/mL；
菌液对照组：含有上述1得到的20mL生物合成体系培养液；
菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组：向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入2mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮，使4-羟基-6-甲基-吡喃酮在培养液中的终浓度达到约0.1mg/mL；
菌液加3,4-二羟基苯甲醛对照组：向含有上述1得到的20mL生物合成体系内投入4mL原始溶液浓度为1mg/mL的前体化合物3,4-二羟基苯甲醛，使3,4-二羟基苯甲醛在培养液中的终浓度达到约0.1mg/mL；
将上述各组在摇床培养继续反应10天，收集培养液。
乙酸乙酯常温萃取培养液(体积比1:1)三次，收集乙酸乙酯萃取产物，浓缩后检测。
3、检测
1)TCL检测
TCL检测上述2得到的乙酸乙酯萃取产物，结果如图1(展开剂石油醚：丙酮＝5:3)所示，图1A提示实验组除去原始菌液里面主要成分和投入的底物，实验组内有明显的hispidin斑点；图1B提示菌液+4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组中也有hispidin产生，说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4-二羟基苯甲醛；图1C说明仅向菌液中投入3,4-二羟基苯甲醛时，没有hispidin产生。
2)HPLC-DAD检测
取2mL甲醇溶解上述2得到的乙酸乙酯萃取物，再用1mL注射器吸取0.1mL的样品，并甲醇稀释至1mL，0.22μm的滤膜过滤样品。安捷伦1220，Agilengt XDB-C18分析柱，流动相：20％-70％甲醇(0.2％甲酸水)梯度洗脱25min，254nm检测。
结果如图2所示，图2A为4-羟基-6-甲基-吡喃酮(8.2min)和hispidin(18.5min)标准品的HPLC图谱；图2B为3,4-二羟基苯甲醛的HPLC图谱(8.0min)；图2C为菌液对照组的HPLC图谱；图2D为菌液加3,4-二羟基苯甲醛对照组的HPLC图谱；E为菌液加4-羟基-6-甲基-吡喃酮对照组；图2F为实验组HPLC图谱；图2G为实验组HPLC图谱与4-羟基-6-甲基-吡喃酮和hispidin标准品色谱峰对照图谱。
检测结果表明：当投入化合物为4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛时，有hispidin产生(图2E)，仅投入4-羟基-6-甲基-吡喃酮时也有hispidin产生，且产量和实验组相似(图2F)。其他对照组中未检测到hispidin。
3)NMR鉴定
采用Sephadex LH-20柱层析(凝胶柱柱子高度30cm，直径1.5cm)对上述2得到的实验组的乙酸乙酯萃取物进行分离，洗脱剂为纯甲醇。
实验组的结果的NMR鉴定结果如图3所示，trans/cis-hispidin的NMR图谱；(a)1HNMR(b)13C NMR；在4-羟基-6-甲基-吡喃酮和3,4-二羟基苯甲醛的生物合成脱水的过程中分别形成了顺式和反式双键，因此产生trans-Hispidin(6-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)及cis-Hispidin(6-[(Z)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-4-hydroxypyran-2-one)两个化合物。且从1H NMR中质子积分来看，两个化合物各占50％。
二、生物合成条件优化
由于上述实验证实，在火木层孔菌培养体系中仅加入4-羟基-6-甲基-吡喃酮，也会有hispidin产生，且不影响产率，说明火木层孔菌培养体系中能够提供3,4-二羟基苯甲醛。因此，以火木层孔菌培养时间(A)、4-羟基-6-甲基-吡喃酮投入量(B)和投入之后反应时间(C)三个影响因素，各设三个水平优化培养条件。
1、优化
采用马丁液体培养基、30℃摇床震荡培养火木层孔菌不同时间(A)，收集培养液，取含有菌丝体的培养液作为生物合成体系。向含有培养不同时间的生物合成体系内投入不同终浓度(B)的前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮，继续摇床震荡培养进行反应不同时间(C)，收集反应产物。八层纱布过滤反应产物的菌丝体，1:1乙酸乙酯萃取培养液三次，收集乙酸乙酯萃取物，合并萃取液浓缩成浸膏状，用于后期检测。
通过L9(34)正交表设计实验。
表1三个因素和三个水平
Figure GDA0003171150960000051
表2 L9(34)正交表
Figure GDA0003171150960000052
表3实验设置分组
Figure GDA0003171150960000053
2、HPLC检测
①标准曲线的绘制
分别取浓度0.015625,0.03125,0.0625,0.125,0.25,0.5，1mg/mL的Hispidin和浓度分别为0.125,0.3125,0.5,2,8mg/mL的4-羟基-6-甲基吡喃酮进行标准曲线的绘制。
③液相分析
分别采用2mL甲醇溶解样品，从中吸取0.1mL用甲醇稀释至1mL，0.22μm的滤膜过滤样品至液相小瓶。安捷伦1220，Agilengt XDB-C18分析柱，液相条件：20％-70％甲醇(0.2％甲酸水)梯度洗脱25min，254nm。
通过HPLC测定，Hispidin和4-羟基-6-甲基吡喃酮的标准曲线见图4和图5。根据标准曲线，计算得出9组实验中hispidin的含量见表4。
表4各组中hispidin的含量(单位：mg/L)
Figure GDA0003171150960000061
因此，由hispidin产量可知，最佳组合条件是A1，B3，C3(组3)，即在火木层孔菌培养15天时的培养液作为生物合成的酶体系、投入4-羟基-6-甲基吡喃酮的终浓度为0.5mg/mL、继续反应时间为60h时，得到最大产量的hispidin，浓度为25.86mg/L。
通过极差计算可知，影响hispidin产量的的因素最重要的是底物浓度，其次是投入培养周期，最后是反应时间。

Claims (3)

1.一种生物合成Hispidin的方法，包括如下步骤：用火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液催化底物4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮，得到Hispidin；
所述4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮在其所在体系中的浓度为0.5mg/mL；
所述火木层孔菌的培养液为培养火木层孔菌得到的培养液；
培养时间为15天；
反应的时间为60小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：向火木层孔菌的培养液或其培养液的上清液中加入4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮进行反应，得到Hispidin。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括如下步骤：
若采用火木层孔菌的培养液的上清液，则将所述反应的产物用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin；
若采用火木层孔菌的培养液，则先将所述反应的产物过滤菌丝体，再用乙酸乙酯萃取，得到Hispidin。
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Phelligridins C-F: Cytotoxic Pyrano[4,3-c][2]benzopyran-1,6-dione and Furo[3,2-c]pyran-4-one Derivatives from the Fungus Phellinus igniarius;Mo S等;《J Nat Prod》;20040421;第67卷(第5期);第826页右栏倒数第1-2行以及第827页左栏第1段第1-4行、倒数第1-3行 *
用分子印迹技术分离纯化菇类抗氧化成分以及该成分在氧化应激中的保护机制;李宁;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20140615(第06期);第11页倒数第2段第1-3行、第64页倒数第1段第4行以及第65页第1段第1-2行 *

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