CN109022435B

CN109022435B - 一种条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法

Info

Publication number: CN109022435B
Application number: CN201810801881.5A
Authority: CN
Inventors: 白银山; 朱翠; 刘珊珊; 冯美莹; 詹小舒; 王丙云
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN109022435A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种敲除小鼠Tet3基因的SgRNA导向序列、条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法及其应用，基因编辑脱靶效应是困扰基因编辑技术应用的一个重要方面，本专利筛选获得的Tet3基因靶点是以整个小鼠基因组筛选出唯一靶向序列的靶点，基因组内无其他类似序列，所以理论上不存在脱靶效应，同时采用诱导型敲除的方法，及时关闭Cas9蛋白表达，也可以有效防止脱靶产生，当添加Dox 24h后小鼠***基因组得到97％以上敲除，Dox诱导前后作为很好的试验组和对照组，本发明所建立的细胞系和方法可以广泛应用于Tet3和其他基因功能研究。

Description

一种条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种敲除小鼠Tet3基因的SgRNA导向序列、条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法。

背景技术

Tet家族(Tet1、Tet2和Tet3)通过氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，使基因组DNA去甲基化，是表观遗传学调控的重要途径之一。Tet家族介导的甲基化调控涉及干细胞的自我更新、分化、重编程和癌变等诸多方面，并且不同的Tet家族成员显示作用于特定的细胞群。

研究表明Tet1/2在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中高表达，下调Tet1/2表达可使多能因子(如Oct4等)的表达降低，促进mESCs分化；Tet1/3在神经干细胞自我更新和分化中发挥重要的作用，敲除Tet1的小鼠表现出长期抑郁和丧失记忆的特征，而敲除mESCs的Tet3则削弱了其向神经细胞分化的能力；Tet2对于造血干细胞自我更新和分化的维持具有重要的意义，下调Tet2表达可以促进造血干细胞的增殖，但却削弱了其分化能力，促进其向肿瘤转化；缺失Tet2表达肌干细胞失去向肌细胞分化的能力。

研究发现，男性***基因组中的5-mC和5-hmC的水平，随着年龄的增长平均每年增加1.76％和5％，这反应了***DNA的变异性在增加。在小鼠***发育过程中，5-hmC表达水平也呈动态变化，以开始分化的小鼠***内表达水平最高；在出现***细胞以后表达水平急剧降低。而在小鼠精原干细胞和小鼠睾丸组织中Tet3表达很高，而Tet1/2却很弱，显示出Tet3可能是Tet家族在***发育过程中的主要调控分子，原始生殖干细胞分化以后，Tet1/2表达水平降低，印记模式开始建立，而Tet3呈现出高水平表达的状态，这提示Tet3对于维持雄性动物印记模式也可能发挥重要作用。Tet3是否通过调控小鼠精原干细胞父方印记基因的甲基化，进而调控***发育还有待研究证实。

Tet3显示出了在神经和生殖发育中的重要作用，成为相关表观分子机制研究的热点，对于深入研究其功能在治疗和预防相关疾病提供了重要价值。此外，目前使用基因编辑***包括CRISPR-Cas9并没有很好的解决脱靶问题，是影响应用的一个重要制约方面，本专利通过多个靶点筛选，并应用条件性诱导方法避免脱靶效应产生。本细胞系模型具有很广泛科研应用前景。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种高效敲除小鼠Tet3基因的SgRNA导向序列、条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种敲除小鼠Tet3基因的SgRNA导向序列，该SgRNA导向序列具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

另一方面，本发明还提供了含有上述SgRNA导向序列的表达载体。作为优选的实施方式，所述表达载体为pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA。作为更优选的实施方式，所述的表达载体具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

另一方面，本发明还提供了一种敲除小鼠Tet3基因的CRISPR-Cas9表达***，该表达***含有上述的表达载体和Cas9蛋白的转录载体。

另一方面，本发明还提供了一种优选的小鼠条件性敲除载体***，该***含有上述的SgRNA导向序列或表达载体或表达***。

另一方面，本发明还提供上述的SgRNA导向序列或表达载体或表达***或载体***在制备敲除Tet3基因的小鼠细胞的应用。

另一方面，本发明还提供了一种条件性诱导小鼠Tet3基因敲除的方法，其包括以下步骤：

(1)分别以pmU6-gRNA，Addgene 53187和pLX-SgRNA-EGFP载体为模板，SEQ ID NO：5～6和SEQ ID NO：7～8为引物，扩增得到mU6片段和Tet3-SgRNA片段；以mU6片段和Tet3-SgRNA片段为模板，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8为引物进行重叠PCR扩增，得到mU6-Tet3-SgRNA片段；

(2)、XhoI和NheI双酶切mU6-Tet3-SgRNA片段，得到mU6-Tet3-SgRNA粘性末端片段，再连入去除hU6-SgRNA序列的pLVX-EGFP-hU6-SgRNA载体骨架中，转化，构建得到pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA慢病毒载体；

(3)、将步骤(2)得到的pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA慢病毒载体进行纯化、包装得到携带Tet3-SgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染Tet-on调控表达Cas9表达***系，即构建得到所述条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系。

另一方面，本发明还提供了上述方法制备的小鼠***Tet3基因敲除细胞系。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明以小鼠***为研究对象，结合运用CRISPR/Cas9***，构建了Dox诱导敲除小鼠***Tet3基因的细胞系，结果显示诱导后，细胞基因组内Tet3基因可以97％发生切割，诱导前不发生切割，该细胞系是一个研究Tet3调控生殖发育的细胞模型，将可应用到科学研究和药物研发中应用，因建立细胞模型效果好，重复性高，能为相关药物开发提供思路。

2.本发明是应用的诱导型敲除方案，特别的设计和构建小鼠Tet3敲除载体，应用mU6启动子，添加了绿色荧光蛋白，促使本发明结果更容易观察，本设计和筛选的敲除靶点是在小鼠基因组内确立的唯一位点，小鼠基因组内不存在类似或相同的靶点序列，不存在脱靶效应，同时试验结果显示敲除效率在Dox诱导后达到97％以上，具有很强的可操作性。

附图说明

图1为本发明实施例1中条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系的建立方法的流程图；

图2为本发明实施例1中稳转Cas9***系的筛选结果，其中，A：稳转Cas9基因的单细胞克隆集落；B：稳转Cas9细胞大量传代；

图3为本发明实施例1中pLVX-EGFP-mU6-SgRNA载体的构建步骤，其中：A：Tet3靶点预测结果模式图；B:mU6-Tet3-SgRNA序列；C：扩增mU6片段(390bp)和SgRNA片段(177bp)；D：通过重叠PCR获得mU6–SgRNA(549bp)片段；E：构建好的pLVX-EGFP-mU6-SgRNA载体图谱；

图4为本发明实施例1中Tet3-SgRNA稳转细胞系的筛选结果，其中，A：293FT细胞；B：293FT细胞转染Tet3-SgRNA和包装质粒48h后荧光显微镜观察结果；C：稳定表达Tet3-SgRNA的细胞系建立；

图5为本发明实施例1中条件性诱导Tet3-KO***系建立与检测结果，其中，A-B：分别为诱导后Tet3-KO***的白光和荧光(EGFP)观察结果；C：Dox诱导前后，Tet3-KO基因组测序分析结果；D：Tet3-KO效率分析(97％)。

图6靶点序列在小鼠基因组内为唯一位点，没有类似或者相同序列存在，这说明此靶点可靠，不存在脱靶效应(应用ENSEMBL数据库Blast结果)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

实施例1

请参阅图1，为本发明的条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系的建立方法的流程图，具体包括以下步骤：

1)稳定表达eSpCas9基因的***系筛选

利用已包装好的携带eSpCas9基因的慢病毒(Addgene)，侵染***系，最终筛选获得了单克隆细胞集落(如图2A)，并最终获得了大量的种子细胞(如图2B)，供后期研究使用。

2)pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA载体构建

参考Ensembl数据库Tet3基因序列(NM_183138)，根据网页SgRNA靶点预测工具：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design-v1，预测靶点序列为(GGAGCTCATCCGGCAATTTG)(SEQ ID NO：1)(如图3A，位于第一个外显子ATG下游)；将pLVX-EGFP-hU6-SgRNA载体(addgene)应用到小鼠细胞上，将人的hU6启动子(hU6,266bp)更改为小鼠的mU6启动子(mU6,316bp)(如图3B)，首先扩增mU6片段(390bp)和SgRNA片段(177bp)(引物已添加酶切位点和设计重叠部分；如图3C)；然后通过重叠PCR获得mU6–Tet3-SgRNA(549bp；如图3D)；具体步骤为：

①分别以(pmU6-gRNA，Addgene 53187)和pLX-SgRNA-EGFP质粒为模板，分别mU6第一段上游、mU6第一段下游和Tet3-SgRNA第二段上游、Tet3-SgRNA第二段下游(表1)分别扩增mU6片段和Tet3-SgRNA片段，PCR体系(表1)如下：

表1第一、二段片段扩增反应体系

②利用重叠PCR方法扩取mU6+靶向SgRNA片段，PCR反应体系同上表1。

PCR反应程序如表2：

表2 PCR反应程序

获得的PCR产物进行1.3％琼脂糖凝胶电泳后使用Magen Hipure Gel Pure DNAMini Kit试剂盒(D2111-03)进行凝胶回收。

③通过重叠PCR方法获得启动子mU6-Tet3-SgRNA序列，以mU6第一段上游和Tet3-SgRNA第二段下游为扩增引物。反应体系如下表4：

表3 pLX-mU6-Tet3-SgRNA-EGFP载体构建引物表

表4重叠PCR反应体系

根据要求设置PCR反应条件，反应结束后PCR产物进行1.3％琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到融合PCR产物mU6-Tet3-SgRNA片段，紫外分光光度计测定其浓度，-20℃保存。

2)构建pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA质粒

将mU6-Tet3-SgRNA片段进行XhoI和NheI两个酶的双酶切，37℃反应2h，然后回收mU6-Tet3-SgRNA粘性末端片段，然后连入去除hU6–SgRNA序列的pLVX-EGFP-hU6-SgRNA载体骨架中，使用Takara T4 DNA Ligase连接试剂盒(D2011A)，16℃连接3h，转化、菌液PCR确定阳性菌并测序后，结果成功构建pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA慢病毒载体，长度为8321bp(如图3E，SEQ ID NO：2)。

3)pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA病毒包装与稳转细胞系的筛选

将构建好的pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA慢病毒载体和病毒包装质粒(pMD2.G和psPAX2)按一定比例混合，转染生长至60-70％汇合的293FT细胞(图4A)；转染48h后评估转染效率和病毒包装优劣及其有无，从结果可以看出载体转染效率较高(如图4B)；将纯化好的携带Tet3-SgRNA序列的病毒液进行侵染Tet-on调控表达Cas9表达***系(图4C)，最终获得了稳定表达的转入Cas9和Tet3-SgRNA-EGFP的两个载体的稳转***系。

其中，慢病毒包装质粒和穿梭质粒纯化方法如下：

由于抽提质粒浓度无法达到慢病毒包装中质粒浓度需要，需要进一步纯化，具体步骤如下：

(1)加入1/10体积的3M醋酸钠，混匀。

(2)加入2.5倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min。

(3)4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用0.5-1mL预冷的75％乙醇溶解；

(4)4℃，12000rpm离心10min，轻轻地吸走上清。

(5)真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。

慢病毒包装方法如下：

(1)293FT细胞铺板：提前一天在10cm²培养皿中培养293FT细胞，10％293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80％时进行侵染；

(2)侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入300μL DMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和穿梭质粒(Cas9或pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA)，各质粒使用量分别为3.5μg、10.4μg和10μg。加入60μL转染试剂Attractene Transfection Reagent(Qiagen)，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；

(3)用PBS清洗细胞两次并加入6mL 2％293FT细胞培养基，滴加混合液；

(4)放置37℃细胞培养箱培养，6h后弃去培养液，继续用2％293FT细胞培养基培养，以维持细胞活性，37℃、5％CO₂培养箱内培养；

(5)48和72h分别收集病毒原液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。

慢病毒侵染方法如下：

(1)复苏液氮保存的小鼠***，接种至卡式瓶内，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(2)待细胞生长稳定后进行传代，接种适量细胞至新的卡式瓶内；

(3)待细胞长至卡式瓶底面约60-80％时，用PBS清洗2次；

(4)用5mL过滤后的pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA慢病毒原液加5μL浓度为10μg/mL的Polybrene以及500μL FBS培养12h后换液；

(5)24h后用完全培养基替换病毒液继续培养；

(6)每天全量换液，需注意换液过程中要轻敲并用PBS清洗；

(7)细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，冻存细胞，并进一步检测转基因的结果。

4)诱导型Tet3-KO细胞系建立与分析

将上述已经转入Cas9和Tet3-SgRNA-EGFP的两个载体的稳转***中，通过筛选，传代；最终获得了体外传代次数达到30代以上稳定细胞系；该细胞系持续表达(EGFP)(图5B)；

采用添加强力霉素(Dox)培养稳转的***，培养24-72h后，将其中一部分抽提基因组。并以基因组为模板，以设计敲除Tet3基因两侧的引物进行扩增，扩增长度440bp，并送去生工测序，进行初步分析，看是否测序结果是否有套峰出现。

表5 Tet3基因敲除检测引物序列

通过添加强力霉素(Dox)诱导，通过测序分析显示诱导后Tet3基因被敲除，而诱导前细胞并未表现出敲除情况，并且正向测序和反向测序都呈现出了套峰(图5C)，说明细胞的同源染色体上的Tet3基因均被敲除，细胞呈现出纯合子细胞系。

为了进一步了解Tet3基因敲除效率，将上述扩增的片段与T载体(pMD^TM18-TVector)连接。操作方法如下：

(1)在PCR管中配制溶液(表6)；

表6配置溶液试剂使用量

(2)加入5μL的Solution I；

(3)将PCR管置于恒温仪，16℃反应3h；

(4)取100μL感受态细胞DH5α，冰上融解后加入3h后的溶液，轻轻混匀后冰上放置30min；

(5)42℃热激42-60s，迅速置于冰中放1-2min；

(6)加入300μL LB培养基，37℃、150rpm培养1h；

(7)取100μL菌液滴至有抗性氨苄的培养基平板上，并涂抹均匀，放入37℃中培养。

约12h后，用移液枪头轻轻挑24个单克隆菌体并分别加至24管装有加入抗性氨苄的1mL LB培养基的离心管中，在摇床中固定好后，37℃、150rpm培养3h。然后使用M13上、下游引物(表7)，空载扩增长度为140bp，进行菌液PCR检测，将条带长度正确的剩余菌液送至生工测序，根据测序结果计算基因敲除效率。

表7 M13上、下游序列

通过分子克隆结合测序分析，证明敲除效率达到97％以上(图5D)，这些数据结果证实获得条件性诱导Tet3-KO***系(图5)。

实施例2靶序列的筛选

发明人在研究过程中，设计了很多的靶序列(见表8)，然而很多靶序列通过实验验证，靶点无切割活性，或者切割活性很低，而有些靶点存在脱靶效应，而有些靶点虽然存在切割活性，但同时也存在脱靶效应，而最终筛选获得靶点序列7，基因组预测无脱靶可能，同时位点切割活性高，仅靶序列7在小鼠基因组内为唯一位点(见图6)，没有类似或者相同序列存在，这说明此靶点可靠，不存在脱靶效应(应用ENSEMBL数据库Blast结果)。因此，本发明最终选择了靶序列7作为导向序列。

表8Tet3靶序列筛选表

序列表

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种条件性诱导小鼠***Tet3基因敲除细胞系及其构建方法

<141> 2018-07-19

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggagctcatc cggcaatttg 20

<210> 2

<211> 8321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa 60

catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac 120

gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa 180

ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag tgcctagctc gatacataaa cgggtctctc 240

tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag 300

cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct 360

ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc 420

cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc 480

ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt 540

tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 600

gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat 660

taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt 720

tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag 780

gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa 840

ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa 900

gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg agatatgagg 960

gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1020

gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 1080

gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg 1140

ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 1200

agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 1260

caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 1320

ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 1380

aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag agaaattaac 1440

aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat 1500

gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca 1560

aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 1620

atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg 1680

tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccttgcgcc ttttccaagg cagccctggg 1740

tttgcgcagg gacgcggctg ctctgggcgt ggttccggga aacgcagcgg cgccgaccct 1800

gggtctcgca cattcttcac gtccgttcgc agcgtcaccc ggatcttcgc cgctaccctt 1860

gtgggccccc cggcgacgct tcctgctccg cccctaagtc gggaaggttc cttgcggttc 1920

gcggcgtgcc ggacgtgaca aacggaagcc gcacgtctca ctagtaccct cgcagacgga 1980

cagcgccagg gagcaatggc agcgcgccga ccgcgatggg ctgtggccaa tagcggctgc 2040

tcagcagggc gcgccgagag cagcggccgg gaaggggcgg tgcgggaggc ggggtgtggg 2100

gcggtagtgt gggccctgtt cctgcccgcg cggtgttccg cattctgcaa gcctccggag 2160

cgcacgtcgg cagtcggctc cctcgttgac cgaatcaccg acctctctcc ccagggggta 2220

ccaccatggc caagcctttg tctcaagaag aatccaccct cattgaaaga gcaacggcta 2280

caatcaacag catccccatc tctgaagact acagcgtcgc cagcgcagct ctctctagcg 2340

acggccgcat cttcactggt gtcaatgtat atcattttac tgggggacct tgtgcagaac 2400

tcgtggtgct gggcactgct gctgctgcgg cagctggcaa cctgacttgt atcgtcgcga 2460

tcggaaatga gaacaggggc atcttgagcc cctgcggacg gtgccgacag gtgcttctcg 2520

atctgcatcc tgggatcaaa gccatagtga aggacagtga tggacagccg acggcagttg 2580

ggattcgtga attgctgccc tctggttatg tgtgggaggg cgagggcaga ggaagtctgc 2640

taacatgcgg tgacgtcgag gagaatcctg gcccagagag cgacgagagc ggcctgcccg 2700

ccatggagat cgagtgccgc atcaccggca ccctgaacgg cgtggagttc gagctggtgg 2760

gcggcggaga gggcaccccc aagcagggcc gcatgaccaa caagatgaag agcaccaaag 2820

gcgccctgac cttcagcccc tacctgctga gccacgtgat gggctacggc ttctaccact 2880

tcggcaccta ccccagcggc tacgagaacc ccttcctgca cgccatcaac aacggcggct 2940

acaccaacac ccgcatcgag aagtacgagg acggcggcgt gctgcacgtg agcttcagct 3000

accgctacga ggccggccgc gtgatcggcg acttcaaggt ggtgggcacc ggcttccccg 3060

aggacagcgt gatcttcacc gacaagatca tccgcagcaa cgccaccgtg gagcacctgc 3120

accccatggg cgataacgtg ctggtgggca gcttcgcccg caccttcagc ctgcgcgacg 3180

gcggctacta cagcttcgtg gtggacagcc acatgcactt caagagcgcc atccacccca 3240

gcatcctgca gaacgggggc cccatgttcg ccttccgccg cgtggaggag ctgcacagca 3300

acaccgagct gggcatcgtg gagtaccagc acgccttcaa gacccccatc gccttcgcca 3360

gatcccgcgc tcagtcgtcc aattctgccg tggacggcac cgccggaccc ggctccaccg 3420

gatctcgcta agaattctag atcttgagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 3480

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 3540

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 3600

acagggacag cagagatcca ctttggcgcc ggctcgagtg tacaaaaaag caggctttaa 3660

aggaaccaat tcagtcgact ggatccggta ccgatccgac gccgccatct ctaggcccgc 3720

gccggccccc tcgcacagac ttgtgggaga agctcggcta ctcccctgcc ccggttaatt 3780

tgcatataat atttcctagt aactatagag gcttaatgtg cgataaaaga cagataatct 3840

gttcttttta atactagcta cattttacat gataggcttg gatttctata agagatacaa 3900

atactaaatt attattttaa aaaacagcac aaaaggaaac tcaccctaac tgtaaagtaa 3960

ttgtgtgttt tgagactata aatatccctt ggagaaaagc cttgtttggg agctcatccg 4020

gcaatttggt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt 4080

gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tctagaccca gctttcttgt acaaagttgg 4140

cattagctag cgctaaccgg tggcgcgtta agtcgacaat caacctctgg attacaaaat 4200

ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 4260

tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 4320

gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 4380

cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 4440

tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 4500

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 4560

gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 4620

gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 4680

cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 4740

gatctccctt tgggccgcct ccccgcgtcg actttaagac caatgactta caaggcagct 4800

gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa 4860

cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc 4920

tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 4980

gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga 5040

cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtacgtata gtagttcatg tcatcttatt 5100

attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt 5160

gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 5220

ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg 5280

ctctagctat cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 5340

attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 5400

cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggg acgtacccaa 5460

ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 5520

ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 5580

ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 5640

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 5700

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 5760

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 5820

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 5880

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 5940

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 6000

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 6060

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt 6120

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 6180

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 6240

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 6300

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 6360

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 6420

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 6480

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 6540

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 6600

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 6660

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 6720

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 6780

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 6840

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 6900

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 6960

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 7020

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 7080

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 7140

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 7200

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 7260

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 7320

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 7380

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 7440

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 7500

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7560

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 7620

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 7680

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 7740

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7800

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7860

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 7920

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 7980

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 8040

cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 8100

gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 8160

actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 8220

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcgcgca 8280

attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctgcaag c 8321

<210> 3

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccactttggc gccggctcga gtgtacaaaa aagcaggctt taaaggaacc aattcagtcg 60

actggatccg gtaccgatcc gacgccgcca tctctagg 98

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcgccaccgg ttagcgctag c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttggcgccg gctcgagtgt aca 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaacaaggct tttctccaag gg 22

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tggagaaaag ccttgtttgg gagctcatcc ggcaatttgg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

caccggttag cgctagctaa tgcc 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cagaaggaca ggcaccgtta c 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atggaagcag gtagttgaga gca 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cacacaggaa acagctatga c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtggtaactg gccgcgggga c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ggcccgccgg acccggtctt c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gcctggtggc cttttcggcc g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gacccctgct ggaggtcccg t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ggacttaccc gaaagcctgt g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gatttgcacc tagtccctcc g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ggacacgtat cgcgcttacc a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ggtacaggcc aggagttccg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gctgctccag ttctgccata 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gaatgagatc ccccagcccc a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gatagggtca gggcttgggc g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gttagctgcc ttgaatctcc a 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ggctctctag caccattgac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

gaatggtgct agagagcccg 20

Claims

1.一种敲除小鼠Tet3基因的SgRNA导向序列，其特征在于，所述的SgRNA导向序列为如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

2.含有权利要求1所述的SgRNA导向序列的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pLVX-EGFP-mU6-Tet3-SgRNA；所述表达载体的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种敲除小鼠Tet3基因的CRISPR-Cas9表达***，其特征在于，含有权利要求2-3任一所述的表达载体和Cas9蛋白表达载体。

5.权利要求1所述的SgRNA导向序列或权利要求2-3任一所述的表达载体或权利要求4所述的表达***在制备敲除Tet3基因的小鼠细胞中的应用；所述应用为非疾病治疗目的。