CN109022317B

CN109022317B - 一种丁酸梭菌菌粉的制备方法

Info

Publication number: CN109022317B
Application number: CN201810931128.8A
Authority: CN
Inventors: 李永红; 李克克; 冯利菲; 朱广跃; 李光华
Original assignee: Henan Jinbaihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Jinbaihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-15
Filing date: 2018-08-15
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2038-08-15
Also published as: CN109022317A

Abstract

本发明属于菌粉制备技术领域，特别涉及一种丁酸梭菌菌粉的制备方法。对丁酸梭菌发酵液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为150～180ºC。本发明一种丁酸梭菌菌粉的制备方法，生产成本低廉，过程可控性强，获得的丁酸梭菌菌粉活菌数量高，产品常温储存稳定性能良好，对推动丁酸梭菌市场有重要价值。

Description

一种丁酸梭菌菌粉的制备方法

技术领域

本发明属于菌粉制备技术领域，特别涉及一种丁酸梭菌菌粉的制备方法。

背景技术

丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 又名酪酸菌、酪酸梭状芽孢杆菌。丁酸梭菌是革兰氏阳性菌，专性厌氧，菌体直杆状或微弯，芽孢内生；菌落为不规则圆形，白色或者乳白色，有酸臭味；适宜生长温度为25ºC～37ºC，适宜生长pH为4.0～9.8；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等多种碳源，发酵产物主要为丁酸。丁酸梭菌属于人和动物肠道内正常菌群的一种，具有调节肠道微生态平衡，增强免疫力，产生益生物质等益生特性。

丁酸梭菌具有如下益生特性：

1）调节肠道微生态平衡：微生态平衡是指正常微生物群与其宿主生态环境在长期进化过程中形成生理性组合的动态平衡。丁酸梭菌既可以促进肠道有益菌群增殖，又可以抑制部分致病菌生长，从而维持肠道菌群稳态，有利于肠道健康。丁酸梭菌能产生淀粉酶、纤维素酶，这些酶可以水解肠道内的淀粉和纤维素产生小分子糖，供双歧杆菌等益生菌生长利用。陈秋红等通过在嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌的培养基中加入丁酸梭菌发酵液提取物，使得实验组活菌数量远远高于对照组，从而证明丁酸梭菌可促进嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌生长，朱晓慧等实验研究也得出了相同结论。丁酸梭菌可以有效抑制肠道致病菌生长，陈秋红等试验中发现大肠杆菌ACCC10080、志贺氏菌ACCC01690、沙门氏菌SM0807与丁酸梭菌混合培养，24 h后与致病菌单独培养相比大肠杆菌降低4个数量级，志贺氏菌降低3个数量级，沙门氏菌降低5个数量级，说明丁酸梭菌可以有效抑制大肠杆菌ACCC10080、志贺氏菌 ACCC01690、沙门氏菌 SM0807的生长。张树波等研究发现丁酸梭O3131可以显著抑制肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌。与单独培养相比，肠出血性大肠杆菌降低4个数量级，痢疾志贺菌降低4个数量级，霍乱沙门菌降低7个数量级，而霍乱弧菌活菌数几乎为零。对于动物肠道致病菌抑制作用，唐宝英等对丁酸梭菌RH2与猪大肠杆菌C83902、鸡大肠杆菌C83851、鸡白痢沙门氏菌Sg9的拮抗作用进行了探讨，通过调整活菌数比例，都能使得培养结束后致病菌活菌数降为0。谢树贵等试验表明丁酸梭菌B1对猪大肠杆菌K88、K99、O139和金黄色葡萄球菌、猪肠炎沙门氏菌O4Hi有显著抑制作用。

2）增强机体免疫力：丁酸梭菌能够增强动物机体免疫力，促进动物生长。刘亭婷等试验探讨了丁酸梭菌对蛋用仔公鸡血清免疫指标的影响，结果表明饲料中添加丁酸梭菌使得蛋用仔公鸡血清中免疫球蛋白G（IgG）、血清补体C3含量明显高于对照组，而且实验组蛋用仔公鸡平均体重较对照组有显著提高。热灭活的丁酸梭菌疫苗可以激活巨噬细胞和自然杀伤细胞，摄入达到一定量后机体血清中IgA含量明显提高。断奶仔猪饲料中添加丁酸梭菌可以提高仔猪血清中IgG、C3的含量，与刘亭婷等实验结果相似。用丁酸梭菌饲喂大肠杆菌K88感染的肉鸡，发现肉鸡血清中IgA、IgM、IgY、C3、C4含量较对照组有所提高，说明丁酸梭菌对大肠杆菌感染肉鸡的免疫功能有积极影响。

3）产生益生物质：丁酸梭菌发酵主要产物为丁酸，丁酸是一种短链脂肪酸，在维持结肠上皮细胞的形态和功能方面有重要作用。丁酸梭菌可以产生B族维生素、VK等微量有机物质，有助于人和动物维持正常的生理功能，研究证明丁酸梭菌能促进VE吸收，主要成分为丁酸梭菌的VE吸收促进剂可以使实验组血清中VE含量明显升高。丁酸梭菌能产生多种酶类，如淀粉酶，纤维素酶，果胶酶等，这些酶能分解肠道内不能直接吸收的糖类，产生容易吸收的葡萄糖等供机体和肠道其他有益菌利用。丁酸梭菌发酵过程中还会产生大量气体，如CO₂、H₂等，其中H₂被广泛的用于医疗研究，证明其有抗氧化，抗炎，抑制细胞凋亡等作用。

目前，丁酸梭菌主要分为临床应用和动物应用。丁酸梭菌微生态制剂在临床上用于治疗腹泻、肠炎，辅助治疗手足口病，预防结肠直肠肿瘤发生。在婴儿肺炎的治疗中，使用抗生素的同时口服丁酸梭菌二联活菌散，可以显著降低抗生素相关性腹泻的发生。丁酸梭菌和美沙拉嗪片联用治疗溃疡性结肠炎相比单独使用美沙拉秦片效果确切。治疗轮状病毒肠炎的常规疗法加上小儿氨基酸联合丁酸梭菌活菌制剂的辅助治疗显著提高了临床疗效。丁酸梭菌可以有效抑制痢疾志贺菌、肠出血性大肠杆菌等致病菌，并且促进双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌的生长，对于维持肠道微生物菌群稳态有重要作用，因此其在临床中治疗腹泻、肠炎等有显著疗效。丁酸梭菌配合利巴韦林和干扰素治疗儿童手足口病效果显著，因其可以增强巨噬细胞活性，其发酵产生的丁酸可以促进肠道上皮细胞的修复，有效防止病毒入侵。杨金梅等用丁酸梭菌作用于结肠癌SW-480细胞，1.5×10⁷ cfu/mL的丁酸梭菌作用48 h，结肠癌细胞出现凋亡迹象，caspase-3和caspase-9活性增强，主导线粒体凋亡的两种蛋白质Bax表达上调，Bcl-2表达下调，肿瘤细胞发生凋亡。在动物应用方面，丁酸梭菌作为饲料添加剂应用于家禽、家畜及水产养殖中，可以提高动物生产性能，增强动物抵抗力，改善动物产品质量，节省饲养成本。刘来亭等在艾拔益加肉鸡（AA肉鸡）饲料中添加0.9%丁酸梭菌，实验组肉鸡肠道绒毛长度增长，意味着其肠道上皮细胞数量增多，消化吸收营养物质的能力增强，从而提高肉鸡日增重量，并且实验组肉鸡死淘率、发病率明显降低。刘婷婷发现谷氨酰胺和丁酸梭菌复合饲料添加剂可以显著提高仔猪平均日增重；使血清中超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力增强；C3、C4水平提高，增强仔猪免疫力；缓解肠道绒毛萎缩和隐窝增生；改善盲肠菌落结构。宋增福等发现丁酸梭菌可以提高鮸鱼中肠和和后肠双歧杆菌数量，减少大肠杆菌数量，降低了后肠中不动杆菌属，短杆菌属和肠产气杆菌属的数量，有效改善鮸鱼肠道菌群环境，有利于鮸鱼健康。

益生菌在肠道发挥作用需要经过胃的强酸性环境，确保在进入肠道后依然保持高数量活菌数是益生菌发挥疗效的关键。益生菌制剂的剂型主要有液体剂型和固体剂型两种，固体剂型可分为：粉剂，颗粒剂，胶囊剂，片剂等。液体制剂通常存在保质期短，运输不便，易污染等缺点，而固体剂型相对来讲保质期长，活菌数高，易运输携带，使用方便。固体剂型中的益生菌菌粉制备常用方法有：自然干燥，低温烘干，真空冷冻干燥，喷雾干燥。喷雾干燥指液体原料经过雾化器分散成细小雾滴，在干燥介质中雾滴的溶剂成分迅速蒸发而形成干燥粉末的干燥技术。喷雾干燥技术的特点是：干燥时间短，产品中有效成分破坏较少，干燥过程简单。相较益生菌菌粉制备的其他方法，喷雾干燥法有其独特优势。虽然喷雾干燥法是较为常用的工艺，但是针对不同的有效成分，例如针对稳定性差的丁酸梭菌液体产品，如何提供一种活菌数高、稳定性好的菌粉制备工艺仍是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高数量活菌数的丁酸梭菌菌粉的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种丁酸梭菌菌粉的制备方法，对丁酸梭菌发酵液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为150～180ºC。

进一步的，液体发酵液喷雾干燥之前进行预处理，所述的预处理为离心分离。

进一步的，对离心分离的参数进行控制，离心时转速3000～5000 r/min，离心处理5～30 min；优选4000 r/min，离心处理10 min。

优选的，离心分离后，弃上清，补加无菌液，之后加入保护剂再进行喷雾干燥。

所述的保护剂优选为海藻酸钠、麦芽糊精、壳寡糖、乳酸钙、羧甲基纤维素钠和二氧化硅的组合物，麦芽糊精加入的量为发酵液质量的5%～30%、海藻酸钠加入的量为发酵液质量的5%～30%，壳寡糖加入的量为发酵液质量的1%～10%、乳酸钙加入的量为发酵液质量的1%～10%，羧甲基纤维素钠的加入量为发酵液质量的0.05%～0.5%、二氧化硅的加入量为发酵液质量的0.05%～0.5%。

更优选的，海藻酸钠加入的量为发酵液质量的10%、麦芽糊精加入的量为发酵液质量的10%、壳寡糖加入的量为发酵液质量的2%、乳酸钙加入的量为发酵液质量的1%，羧甲基纤维素钠的加入量为发酵液质量的0.2%，二氧化硅的加入量为发酵液质量的0.1%。

进一步的，发酵液离心分离后进行浓缩，之后再进行喷雾干燥。

具体的，发酵液离心分离后，弃上清液，补加不多于原发酵液体积的无菌水进行浓缩。

浓缩的倍数优选不大于5，更优选浓缩的倍数为3。

本发明采用喷雾干燥法进行菌粉制备。通过研究发现，在提高菌粉中的活菌数量方面，喷雾器的入口温度、发酵液的处理方式都有着非常大的影响。仅仅对于发酵液的处理方面，发酵液是否离心处理、离心处理的参数、发酵液的浓缩倍数、是否添加保护剂、保护剂的种类以及添加量等都会影响制备菌粉中的活菌数量。本发明的创新点在于对活菌数量影响因素的确定以及对上述因素的综合研究，提供了一种丁酸梭菌菌粉的制备方法，所述方法获得的菌粉活菌数量高，稳定性能好，能更好地发挥益生作用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明一种丁酸梭菌菌粉的制备方法，生产成本低廉，过程可控性强，获得的丁酸梭菌菌粉活菌数量高，产品常温储存稳定性能良好，对推动丁酸梭菌市场应用有重要价值。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

本发明实施例中所用的丁酸梭菌发酵液购买于河南金百合生物科技有限公司。采用BUCHI B-290小型喷雾干燥器，进口温度可在150ºC～200ºC间调节。

实施例1 进口温度的影响

调节喷雾干燥的进口温度，对不经处理的丁酸梭菌发酵液直接进行喷雾干燥，原菌液活菌数5.7×10⁸cfu/mL，得到的菌粉进行亚硫酸铁平板计数（下面也都是采用平板计数方式），40ºC放置10天后再次进行平板计数。结果如表1所示：

表1 进口温度的影响

注：活菌数1为喷雾干燥得到的菌粉即时检测得到的活菌数即检活菌数；活菌数2为40ºC放置10 d后活菌数；活菌数3为常温放置3个月活菌数；质量收率为100 mL发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。

实施例2 菌液进行离心预处理的影响

取丁酸梭菌发酵液100 mL，在4000 rmp条件下离心10 min后取菌泥，再用等体积无菌水还原，处理过的菌悬液中加入20%海藻酸钠；以100 mL发酵液中直接加入20%海藻酸钠为对照，对喷雾干燥后的菌粉进行活菌数和稳定性对比。喷雾干燥时的喷雾器的进口温度为180ºC。

对三个批次的发酵液同时进行试验，批次1菌液活菌数7.2×10⁸cfu/mL，批次2菌液活菌数5.7×10⁸cfu/mL批，批次3菌液活菌数2.7×10⁸cfu/mL。结果如表2所示：

注：活菌数1为即检活菌数；活菌数2为40ºC放置10 d后活菌数；活菌数3为常温放置3个月活菌数；质量收率为100 mL发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。

结果显示发酵液经处理之后，菌粉经40ºC放置10 d、常温三个月放置后性能稳定且批次间稳定性良好。通过分析数据可以发现40ºC放置10 d后活菌数与常温放置三个月活菌数差异不大，因此在后期试验中可以只检测40ºC放置10 d时的活菌数来表征对应方法处理下菌粉的稳定性，同时缩短了试验周期。

实施例3 离心条件的影响

分别取10 mL发酵液，在表3中的不同条件下进行离心，弃上清，补加无菌水至10mL，混匀后检测菌悬液中活菌数含量，结果如表3所示：

结果显示当转速为4000 rpm，离心时间为10 min 时菌泥中活菌残留量最高。

实施例4 保护剂的影响

取丁酸梭菌发酵液100 mL，在4000 rmp条件下离心10 min后取菌泥，再用等体积无菌水还原，处理过的菌悬液中加入表4中的不同保护剂, 保护剂添加量为发酵液质量的20%；之后进行喷雾干燥（喷雾器入口温度为180ºC），结果如表4所示：

注：活菌数1为即检活菌数；活菌数2为40ºC放置10 d后活菌数；质量收率为100 mL发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。

40ºC存放10 d后低聚果糖作为保护剂的菌粉结块严重，蔗糖、低聚半乳糖、菊粉、玉米淀粉轻微结块，上述保护剂所得菌粉活菌数量以及稳定性也比较低。海藻酸钠作为保护剂时，菌粉活菌数量最高，稳定性良好；麦芽糊精作为保护剂时，菌粉稳定性最好；脱脂奶粉稳定性比较差；***胶的活菌数和稳定性都不太理想。（高温储存后的存活率来表征稳定性）。

采用不同配比的海藻酸钠、麦芽糊精为保护剂，其他参数同表4，结果如表5所示，保护剂用量指其质量与发酵液质量的比值：

注：H：海藻酸钠 M：麦芽糊精

活菌数1为即检活菌数；活菌数2为40ºC放置10 d后活菌数；质量收率为100 mL发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。

结合单独使用这两种保护剂所得实验结果，可以发现海藻酸钠用量减少时，菌粉中活菌数降低，麦芽糊精用量增加时，存活率增加，在这两者用量相同即均为10%时，活菌数和存活率都达到一个相对理想的状态。

海藻酸钠和麦芽糊精用量都为发酵液质量的10%，其他成分壳寡糖、乳酸钙、羧甲基纤维素钠和二氧化硅的含量如表6所示。

当选择壳寡糖2%，乳酸钙1%，羧甲基纤维素钠0.2%，二氧化硅0.1%时活菌收率和存活率都是最好的。

实施例5 发酵液浓缩的影响

取丁酸梭菌发酵液，发酵液活菌数为5.70×10⁸cfu/mL，在4000 rmp条件下离心10min后取菌泥，再加入无菌水，通过加入无菌水的量来实现对丁酸梭菌发酵液的浓缩倍数的调整（例如，浓缩3倍就是将300 mL发酵液离心之后所得菌泥加入100 mL无菌水来获得浓缩后菌悬液）。处理过的菌悬液中加入保护剂, 之后进行喷雾干燥；保护剂为：海藻酸钠10%、麦芽糊精10%、壳寡糖2%、乳酸钙1%，羧甲基纤维素钠0.2%，二氧化硅0.1%，喷雾器入口温度为180ºC。结果如表7所示：

从结果可以看出，发酵液浓缩后活菌数得到了大幅提高，但是随着浓缩倍数的增加，质量收率减少，继而活菌收率出现了下降，三种浓缩倍数情况下存活率差异明显，浓缩3倍时所得菌粉存活率下降幅度保持在10%以内，而且此条件所得菌粉中活菌数能达到1.0×10¹⁰cfu/g。

Claims

1.一种丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 菌粉的制备方法，其特征在于，对丁酸梭菌发酵液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为180ºC；喷雾干燥时加入保护剂，所述的保护剂为麦芽糊精、海藻酸钠、壳寡糖、乳酸钙、羧甲基纤维素钠和二氧化硅的组合物，海藻酸钠加入的量为发酵液质量的10%、麦芽糊精加入的量为发酵液质量的10%、壳寡糖加入的量为发酵液质量的2%、乳酸钙加入的量为发酵液质量的1%，羧甲基纤维素钠的加入量为发酵液质量的0.2%，二氧化硅的加入量为发酵液质量的0.1%；发酵液喷雾干燥之前进行预处理，所述的预处理为离心分离；发酵液离心分离后进行浓缩，之后再进行喷雾干燥，浓缩的倍数为3。

2.如权利要求1所述的丁酸梭菌菌粉的制备方法，其特征在于，离心分离时转速3000～5000 r/min，离心处理5～30 min。