CN109022295B - 一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法 - Google Patents

一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，属于微生物技术领域。本发明的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，包括以下步骤：(1)接种白腐真菌YK‑624于PDA培养基(土豆葡萄糖琼脂培养基)培养，置于冰箱内4℃保存备用；(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于Kirk液体培养基中，于24～30℃静置培养3～5天；(3)加入0.05～0.15mM烯啶虫胺母液，于24～30℃继续静置培养3～5天。本发明利用白腐真菌体积小、比表面积大、繁殖能力强、适应性强等优势，开发的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法具有降解率高、安全、无二次污染风险的优点。

Description

一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法
技术领域
本发明涉及一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
烯啶虫胺(nitenpyram，NIT)，化学名为(E)-N-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-乙基-N′-甲基-2-硝基亚乙基二胺，是新烟碱类杀虫剂的一种。新烟碱类杀虫剂是代替有机磷农药在1990年代被开发，近年来在世界各地广泛使用的一类高效，高选择性新型杀虫剂。新烟碱类杀虫剂通过激动突触后膜的烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors，nAChR)，阻断昆虫中枢神经***正常传导而使其死亡。而在哺乳动物中，新烟碱类杀虫剂穿透血脑屏障的能力较差，且与中枢神经***及外周神经***的nAChR作用较弱，因此对哺乳动物毒性低。因其独特的作用机制，使得新烟碱类杀虫剂成为杀虫剂市场中发展最快、销售最为成功、杀虫效果最好的品种之一。自1991年吡虫啉上市以来，新烟碱类杀虫剂迅速壮大成为全球第一大杀虫剂，使用量还在每年增加。然而，现在越来越多的证据显示，新烟碱类杀虫剂的使用会引起蜂群崩溃综合征，导致蜜蜂失踪以及大量死亡。近来又有研究发现，该类杀虫剂对水生动物以及哺乳动物，包括人类也具有毒性。欧洲食品***也报道了两种新烟碱类杀虫剂啶虫脒和吡虫啉可能对发育中的人类神经***造成影响。如果今后继续大量使用，其难降解性将对土壤以及河流造成污染，有可能会成为“第二个滴滴涕”。随着各种实验数据的不断披露，各国政府也在不断颁布对于新烟碱类杀虫剂的法令或措施：欧盟在2013年宣布暂时禁止三种主打新烟碱类杀虫剂在某些作物上的使用；2017年，欧盟五月份提交表决禁用新烟碱类杀虫剂法令；加拿大也计划停止使用新烟碱类杀虫剂吡虫啉；法国将于2018年9月起禁用新烟碱类杀虫剂。新烟碱类杀虫剂的残留污染问题以及毒性机制研究引起了全世界范围的广泛关注。
国内外对烯啶虫胺的降解报道较少，李善评通过介质阻挡放电产生低温等离子体处理烯啶虫胺溶液，研究了不同介质阻挡放电功率及外界因素如Fe2+、正丁醇、无机盐Na2CO3和H2O2等对等离子体降解烯啶虫胺的影响(利用低温等离子体降解烯啶虫胺农药废水的研究，《高压电技术》，2011年10期)；连军峰通过制备气体扩散电极降解水中烯啶虫胺，采用星点设计--效应面曲线法对催化剂的制备、气体扩散电极的制备以及烯啶虫胺农药废水的降解工艺进行了优化(气体扩散电极的制备和烯啶虫胺农药废水降解机理，硕士学位论文，山东大学2011年度)。上述方法中使用的材料制备成本高，运行管理繁琐，而且极易造成二次污染。
白腐真菌在自然界生态***中发挥重要作用，是一种宝贵的生物资源，是环境治理的工具和研究模式对象。白腐真菌在降解难降解污染物前不需经过特定污染物的预条件化，能够降解大量结构不同的污染物，并且对营养条件要求低，能够节省成本。白腐真菌Phanerochaete sordida YK-624对黄曲霉毒素等众多难降解污染物的能力都有高于模式菌株黄孢原毛平革菌。白腐真菌在处理有机污染物中显示了广阔的前景，充分利用白腐真菌对环境修复的现实意义，从而为开发利用微生物降解新烟碱类杀虫剂的生物修复技术提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，利用白腐真菌体积小、比表面积大、繁殖能力强、适应性强等优势，开发的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法具有降解率高、安全、无二次污染风险的优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，包括以下步骤：
(1)接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4℃保存备用；
(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于Kirk液体培养基中，于24～30℃静置培养3～5天；
(3)加入0.05～0.15mM烯啶虫胺母液，于24～30℃继续静置培养3～5天。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述Kirk液体培养基的成分为：10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、100mL盐溶液、加水定容至1L。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述盐溶液的成分为：20g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O、1.3g CaCl2·2H2O、0.01g盐酸硫铵、16.7mL微量元素溶液，加水定容至1L。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述微量元素溶液的成分为：9g Nitrilotriacetate、3g MgSO4·7H2O、4.2g MnSO4·H2O、6g NaCl、0.6g FeSO4·7H2O、1.1g CoSO4·7H2O、1.1g ZnSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、0.06gCuSO4·5H2O、0.11g AlK(SO4)2·12H2O、0.06g H3BO3、0.07g Na2MoO4·2H2O，加水定容至1L。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、水余量。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，Kirk液体培养基为10mL。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，培养温度为30℃，培养时间为5天。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，培养温度为30℃，培养时间为5天。
作为本发明所述利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，烯啶虫胺母液的浓度为0.1mM。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用白腐真菌体积小、比表面积大、繁殖能力强、适应性强等优势，开发的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法具有降解率高、安全、无二次污染风险的优点。
附图说明
图1为本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的代谢产物的结构式图。
图2为本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的代谢产物的ESI-TOF-MS质谱图。
图3为本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的代谢产物的13C-NMR图谱。
图4为本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的代谢产物的1H-NMR图谱。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4℃保存备用；
(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于10mL Kirk液体培养基中，于30℃静置培养5天；
(3)加入0.1mM烯啶虫胺母液，于30℃继续静置培养5天。
其中，Kirk液体培养基的成分为：10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、100mL盐溶液、加水定容至1L；盐溶液的成分为：20g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O、1.3g CaCl2·2H2O、0.01g盐酸硫铵、16.7mL微量元素溶液，加水定容至1L；微量元素溶液的成分为：9gNitrilotriacetate、3g MgSO4·7H2O、4.2g MnSO4·H2O、6g NaCl、0.6g FeSO4·7H2O、1.1gCoSO4·7H2O、1.1g ZnSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、0.06g CuSO4·5H2O、0.11g AlK(SO4)2·12H2O、0.06g H3BO3、0.07g Na2MoO4·2H2O，加水定容至1L。PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、水余量。
实施例2
本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4℃保存备用；
(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于10mL Kirk液体培养基中，于28℃静置培养3天；
(3)加入0.05mM烯啶虫胺母液，于28℃继续静置培养3天。
其中，Kirk液体培养基的成分为：10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、100mL盐溶液、加水定容至1L；盐溶液的成分为：20g KH2PO4、5g MgSO4·7H2O、1.3g CaCl2·2H2O、0.01g盐酸硫铵、16.7mL微量元素溶液，加水定容至1L；微量元素溶液的成分为：9gNitrilotriacetate、3g MgSO4·7H2O、4.2g MnSO4·H2O、6g NaCl、0.6g FeSO4·7H2O、1.1gCoSO4·7H2O、1.1g ZnSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、0.06g CuSO4·5H2O、0.11g AlK(SO4)2·12H2O、0.06g H3BO3、0.07g Na2MoO4·2H2O，加水定容至1L。PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、水余量。
实施例3
本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4℃保存备用；
(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于10mL Kirk液体培养基中，于24℃静置培养5天；
(3)加入0.15mM烯啶虫胺母液，于24℃继续静置培养5天。
其中，Kirk液体培养基的成分为：10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、100mL盐溶液、加水定容至1L；盐溶液的成分为：20gKH2PO4、5g MgSO4·7H2O、1.3g CaCl2·2H2O、0.01g盐酸硫铵、16.7mL微量元素溶液，加水定容至1L；微量元素溶液的成分为：9gNitrilotriacetate、3g MgSO4·7H2O、4.2g MnSO4·H2O、6g NaCl、0.6g FeSO4·7H2O、1.1gCoSO4·7H2O、1.1g ZnSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、0.06g CuSO4·5H2O、0.11g AlK(SO4)2·12H2O、0.06g H3BO3、0.07g Na2MoO4·2H2O，加水定容至1L。PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、水余量。
对比例1
一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，包括以下步骤：
(1)接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4℃保存备用；
(2)待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于10mL PDB液体培养基(土豆葡萄糖液体培养基)中，于30℃静置培养5天；
(3)加入0.1mM烯啶虫胺母液，于30℃继续静置培养5天。
其中，PDB液体培养基的成分为：土豆20％、葡萄糖2％、水余量。PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、水余量。
效果例1
本发明实施例1～3和对比例1对烯啶虫胺的降解率试验
待实施例1～3和对比例1的降解实验完成后，在实施例1～3和对比例1的培养液中添加内标物，加入20mL丙酮后将菌体通过手持式组织均质机打碎。得到匀浆过滤后旋转蒸发浓缩，进行高效液相色谱法(HPLC，色谱柱：Inertsil ODS-3 5μm 4.6x250mm)分析。利用内标法对烯啶虫胺进行定量分析，结果显示，实施例1～3中烯啶虫胺被完全降解，而对比例1中烯啶虫胺的降解率仅为20％。可见，采用本发明的方法对烯啶虫胺进行降解，具有降解率高、安全、无二次污染风险的优点。
效果例2
本发明实施例1～3降解烯啶虫胺的代谢产物的鉴定
为了鉴定烯啶虫胺的代谢产物，将烯啶虫胺148μM添加到5L液体培养基中，按降解实验条件培养。培养20天后旋转蒸发浓缩至250mL，用同等体积的乙酸乙酯萃取3次得到的上清液，萃取后的溶液于旋转蒸发器中减压蒸馏。滤液用硅胶柱层析法进行梯度洗脱，薄层色谱法进行代谢产物的跟踪，HPLC(色谱柱：Inertsil C30S-Select 5μm 4.6x250mm)分析纯度。分离得到的产物通过制备HPLC(色谱柱：Inertsil C30S-Select 5μm 20x250mm)进一步精制纯化，得到高纯度的代谢产物。使用电喷雾质谱以及磁共振波谱分析鉴定出代谢产物为(E)-N-((6-chloropyridin-3-yl)methyl)-N-ethyl-N’-hydroxyacetimidamide(CPMHA)，其结构式如图1，ESI-TOF-MS质谱如图2，13C-NMR图谱如图3，1H-NMR图谱如图4。
可见，本发明利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法能够有效降解烯啶虫胺，降解产物安全、无二次污染风险。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）接种白腐真菌YK-624于PDA培养基培养，置于冰箱内4°C保存备用；
（2）待菌丝长满后，截取直径为10mm的白腐真菌菌丝片接种于Kirk液体培养基中，于24~30°C静置培养3~5天；
（3）加入0.05~0.15mM烯啶虫胺母液，于24~30°C继续静置培养3~5天；
所述Kirk液体培养基的成分为：10 g葡萄糖、0.221 g酒石酸铵、1.64 g无水乙酸钠、100 mL盐溶液，加水定容至1L；
所述盐溶液的成分为：20 g KH2PO4、5 g MgSO4・7H2O、1.3 g CaCl2・2H2O、0.01 g盐酸硫铵、16.7 mL微量元素溶液，加水定容至1L；
所述微量元素溶液的成分为：9 g Nitrilotriacetate、3 g MgSO4・7H2O、4.2 g MnSO4・H2O、6 g NaCl、0.6 gFeSO4・7H2O、1.1 g CoSO4・7H2O、1.1 g ZnSO4・7H2O、0.6 g CaCl2・2H2O、0.06 g CuSO4・5H2O、0.11 g AlK(SO4)2・12H2O、0.06 g H3BO3、0.07 g Na2MoO4・2H2O，加水定容至1L。
2.如权利要求1所述的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PDA培养基包括下述质量百分比的组分：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂2%、水余量。
3.如权利要求1所述的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，Kirk液体培养基为10 mL。
4.如权利要求1所述的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，培养温度为30°C，培养时间为5天。
5.如权利要求1所述的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，培养温度为30°C，培养时间为5天。
6.如权利要求1所述的利用白腐真菌降解烯啶虫胺的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，烯啶虫胺母液的浓度为0.1mM。
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