CN108998483B - 利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，所述的单亚基RNA聚合酶，为来自

KMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶，通过研究发现KP34RNA聚合酶在T7和Syn5转录***的几个薄弱环节中显示出明显的优势，尤其是能产生精确均一的产物末端及对富含二级结构的RNA(如sgRNA)转录效果非常好。针对这一特性，利用该聚合酶合成的sgRNA末端均一性很高，提供了一个可以按需定制的DNA定点剪切工具，其效率高，成本低。

Description

利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法。

背景技术

SgRNA(single-guide RNA)是CRISPR基因编辑***中重要的组成部分，早先发现的guide RNA由两部分组成—crRNA和tracRNA,两者“双剑合璧”后，即sgRNA能更方便也更稳定的行使定点导向的功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9蛋白靶向剪切目的基因。CRISPR是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式，是一套很巧妙的***。它先把外来的DNA片段整合进细菌自己的基因组，然后转录出RNA，经过一些剪切后，并利用这些guide RNA把带有核酸内切酶活性的Cas蛋白直接引导到外源序列的位置，将外源DNA切断。对细菌或古细菌而言，就完成了对外来病原体的快速精准的打击。

至于最近很火的CRISPR技术其实是利用CRISPR***中的RNA引导Cas蛋白去切断目标DNA的这一个步骤。当然CRISPR的爆火主要还是由于这套技术好用，是因为要达成基因敲除的目的，只需把两个质粒导入细胞即可大功告成。一个是含有Cas9蛋白的表达基因，它可以切断双链DNA。另一个是用来表达sgRNA,前一部分与目标基因配对，后一部分可形成发夹结构与Cas9蛋白结合，切断目标基因。这是传统构建CRISPR***的方法。随着RNA研究的发展及RNA导入细胞方法的完善，目前也可以通过将Cas9 mRNA和sgRNA导入细胞而发挥基因编辑功能。RNA转运至细胞内就可以翻译成蛋白质或直接发挥作用后被迅速降解，与导入质粒法不同(DNA会一直存在细胞中)，这种方法不会造成基因突变的危险。

SgRNA的体外制备方法有化学合成和酶法合成这两种。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，目前化学合成RNA多限于短RNA(几个到几十个核苷酸长度)，且合成费用高。酶法合成RNA是在RNA聚合酶体外转录基础上建立的生物制备方法。相对于化学合成，酶法合成具有效率高、条件温和的特性，能够合成长序列RNA，更易于实现较大规模生产,是一种发展前景良好的RNA合成方法。目前体外酶法合成RNA主要是利用T7 RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，这使得T7 RNA聚合酶几乎成为了RNA酶法合成中唯一的工具酶。

T7 RNA聚合酶于四十年前被鉴定，其选择受限于当时已发现的有限噬菌体种类，无法保证它是一个最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺点包括：提前终止、延伸性能弱、产物末端不均一、必须以鸟苷酸起始、对修饰核苷酸掺入效率低、对富含高级结构的RNA转录效率低等等，以致很多情况下所需的RNA无法有效合成。因而选择T7作为体外合成RNA的标准酶具有很大的随机性。在随后的数十年中，人们对T7 RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，相关论文和专利不计其数，然而这个酶并不是天然为RNA体外合成而设，其主要缺点越来越成为RNA这一热门研究和应用领域的限制因素。

KP34 RNA聚合酶是我们最新发现的一类单亚基RNA聚合酶，它来自

类噬菌体。

类噬菌体与T7类、SP6类和P60类(含Syn5)亲缘关系较远，且其成员间异质性最大。并且KP34 RNA聚合酶与已知的T7类和Syn5类单亚基RNA聚合酶在氨基酸序列、蛋白质大小、进化地位以及功能特征等方面存在显著差异。这也暗示着KP34 RNA聚合酶的转录体系与T7和Syn5 RNA聚合酶的转录体系差异很大。通过研究发现KP34 RNA聚合酶在T7和Syn5转录***的几个薄弱环节中显示出明显的优势，尤其是能产生精确均一的产物末端及对富含二级结构的RNA(如sgRNA)转录效果非常好。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中化学合成和T7 RNA聚合酶体外转录合成sgRNA方法的缺陷，提供一种利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，从而制得具有产物末端均一性、稳定性、输送性优良的sgRNA，所述sgRNA为103nt sgRNA，该sgRNA可用于CRISPR基因编辑等。

本发明的另一目的是提供所述KP34 RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用，为相关研究领域合作者解决难于合成的RNA原料问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，包括以下步骤：

S1、获得所需sgRNA的DNA转录模板；

S2、加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH8.0 Tris-HCl，DTT，氯化镁，亚精胺，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应；

S3、加入DNase I去除DNA模板；

S4.纯化回收转录产物。

进一步的，所述单亚基RNA聚合酶为

类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述sgRNA如序列表SEQ ID NO.1所示。

优选的，步骤S1所述sgRNA转录模板包含一个RNA聚合酶启动子、一个20nt靶标特异性区域和一个83bp的恒定区域。

优选的，步骤S2所述转录反应的温度为37℃，反应的时间为1～2h。当转录时间达到1h以上可以得到大量的转录产物，转录效果较好，综合考虑转录反应时间为1～2h较佳。

进一步的，所述DNA转录模板为线性化的质粒DNA模板、PCR产物模板或合成的DNA寡核苷酸模板。

进一步的，所述线性化质粒DNA模板的构建具体步骤如下：

(1)通过无缝连接的方法把sgRNA和KP34 RNA聚合酶启动子克隆到pUC19质粒载体上，同时在sgRNA后面添加一个BspQI酶切位点，提取pUC19质粒；

(2)采用BspQI限制性内切酶线性化pUC19质粒，电泳检测，纯化回收。

进一步的，所述PCR产物模板的获取步骤为：通过PCR体系扩增pUC19载体序列，使正向引物上带有KP34 RNA聚合酶的启动子序列，电泳检测，纯化回收PCR产物。

进一步的，所述PCR体系：2X PrimeSTAR Max 10μl，pUC19质粒1ng，正向引物0.5μM，反向引物0.5μlM，ddH2O补至25μl；PCR程序:98℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s、30个循环；72℃终延伸10min。

进一步的，所述DNA寡核苷酸模板的合成步骤为：合成两条互补的DNA单链，DEPC水溶解稀释至50μΜ，分别吸取20μl 50μM完全互补的两条单链DNA，再加入5μl 10X引物退火缓冲液混合均匀后于金属浴95℃5min，自然降温退火成双链。

进一步的，所述两条互补的DNA单链包括正向单链和互补链，所述正向单链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述互补链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

以线性化质粒作模板能保证DNA模板末端的均一性，极大地降低了转录产物末端出现不均一的概率；

进一步的，步骤S4所述纯化转录产物的方法有试剂盒纯化法、乙醇沉淀法、RNA氯化锂沉淀法。

试剂盒纯化法适用于小量检测型，乙醇沉淀法，可以沉淀小片段和大片段RNA，但也会沉淀出蛋白质，所以必须先用酚/氯仿抽提，RNA氯化锂沉淀法，适用于纯化至少100nt的RNA，它不会沉淀DNA和蛋白质，操作简单，效率高，是大量制备RNA的最佳方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)提供了一个可以按需定制的DNA定点剪切工具，其效率高，成本低。

(2)合成sgRNA的产物末端均一性、稳定性、输送性优良。

(3)产物末端不会添加额外核苷酸，避免出现错误的二级结构。

附图说明

图1为本发明sgRNA结构示意图；

图2为本发明实施例1中,利用KP34 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶体外转录合成sgRNA的结果图；左侧电泳图为T7 RNA聚合酶的转录结果，右侧电泳图为KP34 RNA聚合酶的转录结果；泳道1至3分别为T7的DNA转录模板、sgRNA产物、去除了DNA模板的sgRNA产物；泳道4至6分别为KP34的DNA转录模板、sgRNA产物、去除了DNA模板的sgRNA产物；

图3-图14所示为本发明实施例2中KP34 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶体外转录合成sgRNA 3’末端均一性的测序结果图；图3-图8为T7 RNAP转录产物的测序结果，图9-图14为KP34 RNAP转录产物的测序结果。

具体实施方式

本发明所用的KP34 RNA聚合酶来自KP34噬菌体，属于

类噬菌体，是一种从污水中浓缩分离得到的新型病毒，其宿主为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaestrains)。肺炎克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，噬箘体KP34也被认为是治疗肺炎克雷伯氏菌的候选疗法之一。噬箘体KP34的基因组为典型的双链DNA结构，其基因组大小为43809bp，共含有57个开放阅读框。实验证明，噬菌体KP34的RNA聚合酶单个蛋白质就可以在体外高效完成RNA的合成，且与已知的T7类和Syn5类单亚基RNA聚合酶在氨基酸序列、蛋白质大小、进化地位以及功能特征等方面存在显著差异。这也暗示着KP34 RNA聚合酶的转录体系与T7和Syn5 RNA聚合酶的转录体系差异很大。

由于实验原理大体相同，以下实施例仅以KP34 RNA聚合酶为例，本发明包含的其他单亚基RNA聚合酶均可以参照实施例中的方法获得sgRNA体外转录结果。所有本发明所用到的单亚基RNA聚合酶的氨基酸序列均可在基因序列查询网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上查询。

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：利用KP34 RNA聚合酶进行体外转录

(1)转录反应模板的获取

通过无缝连接的方法把sgRNA和KP34 RNA聚合酶启动子克隆到pUC19质粒载体上，同时在sgRNA后面添加一个BspQI酶切位点，提取pUC19质粒；然后用BspQI限制性内切酶线性化质粒。酶切反应体系为50μl：BspQI 1μl，质粒DNA 1μg，10x NEBuffer3.15μl，ddH2O补至50μl。反应条件为50℃反应30min。通过琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否完全，结果如图2泳道1和泳道4所示，线性化效果非常好。使用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen)纯化回收酶切产物，具体纯化步骤如下：

a.在酶切反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A，混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃滤液；

b.将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；

c.将制备管置回2ml离心管，加400μl Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；

d.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加25-30μl ddH2O，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。

(2)体外转录反应

体外转录反应的体系成分如下：40mM Tris-HCl(pH 8.0)，6mM MgCl2，2mM亚精胺，10mM DTT，200μΜATP、GTP、CTP、UTP，0.3μl RNase抑制剂，0.2μl焦磷酸酶，1μΜKP34 RNA聚合酶，20nM线性化质粒模板或100ng/μl PCR模板或2Μm DNA退火寡核苷酸模板，补DEPC水至10μl，混匀。将反应混合物于37℃温育1小时。取1ul转录产物加入甲酰胺和EDTA配置的上样缓冲液后冻存。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色检测转录产物的效果，结果如图2所示，两个RNA聚合酶都能转录出sgRNA，通过本发明方法合成的sgRNA最终为103nt sgRNA，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示。T7 RNA聚合酶的转录产物复杂，产生很多条带，而KP34RNA聚合酶的转录产物单一，效率高。

PCR产物作模板：通过PCR方法扩增pUC19载体序列，使正向引物上带有KP34 RNA聚合酶的启动子序列，PCR反应体系总体积为25μl：2X PrimeSTAR Max 10μl，pUC19质粒1ng，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，ddH2O补至25μl。扩增程序：98℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s、30个循环；72℃终延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测是否扩增出单一条带。使用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化回收PCR产物。

合成的DNA寡核苷酸作模板：利用合成两条互补的DNA单链(武汉金开瑞生物工程有限公司)，所述两条互补的DNA单链包括正向单链和互补链，所述正向单链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述互补链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。退火成双链获得转录模板的方法，首先是将单链用DEPC水溶解稀释至50μΜ，然后分别吸取20μl 50μM完全互补的两条单链DNA，再加入5μl 10X引物退火缓冲液混合均匀后于金属浴95℃5min，然后关闭金属浴电源，自然降温至室温以完成双链退火，双链模板的终浓度为20μM。

(3)去除DNA模板

50μl DNA消化反应体系：RNA样品(≤10μg)，10X RQ1 RNase-Free DNase反应缓冲液5μl和RQ1 RNase-Free DNase 5μl混合。37℃温育30min。

(4)RNA转录产物的纯化回收

1)RNA Clean&Concentrator^TM-5(ZYMO Research)试剂盒纯化法(适用于小量检测型)

a)在DNA消化反应液中，加入2个体积RNA Binding Buffer，混匀；

b)加入等体积的无水乙醇，混匀；

c)将混合液转移至Zymo-Spin^TMColumn中，12000rpm离心30s，弃滤液；

d)加入400μl RNA Prep Buffer到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃滤液；

e)加入700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000rpm离心30s,弃滤液；

f)加入400μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000rpm离心2min，弃滤液；

g)将吸附柱转移至一干净的收集管中，加入15μl DEPC水，室温静置1min，12000rpm离心30s洗脱RNA。

2)LiCl沉淀法(适用于大量制备型)

a)在DNA消化反应液中，加入等体积的7.5M LiCl，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清液；

b)加入2.5倍体积70％乙醇，重悬RNA 2min，12000rpm离心2min，弃上清液；

c)自然风干RNA 5min-1h，室温下，用DEPC水溶RNA，-80℃冻存。

取1μl RNA回收产物与甲酰胺和EDTA配置的上样缓冲液混合。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色检测DNA模板是否消化彻底及RNA的回收效率如何。结果如图2泳道3和6所示，DNA模板消化得很干净，并且RNA的回收效率达到了95％。

实施例2：利用3’RACE分析转录产物sgRNA的3’末端均一性

(1)Poly(A)加尾

体外转录步骤与上述相同，接着通过E.coli Poly(A)聚合酶催化十几个腺苷添加到sgRNA 3’末端。20μl反应体系：1X E.coli Poly(A)聚合酶反应缓冲液，1mM ATP和1μgsgRNA混合。37℃温育30min。使用RNA纯化试剂盒RNA Clean&Concentrator^TM-5对加尾产物进行纯化回收。

(2)反转录成cDNA

先把RNA反转录模板变性处理(10μl)：先将50pg-100ng RNA反转录模板，10mMdNTP与VN-oliod(T)18引物混合，所述VN-oliod(T)18引物碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示，65℃热处理5min后立即放置冰上；加入提前配好的下列试剂(10μl):5xProtoScriptII RT Reaction Buffer，200u/μl ProtoScriptII Reverse Transcriptase，0.1M DTT和40u/μl RNase抑制剂，混合均匀。42℃反应1小时后，65℃反应20min使酶失活，然后放置于冰上。

(3)PCR扩增cDNA

扩增体系(25μl):0.5μl cDNA，12.5μl Taq DNA聚合酶(Bionin PCR MasterMix2x)，0.5μl正向端引物SgRNA-F(与基因特异性结合)，所述正向端引物SgRNA-F的碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示，0.5μl反向引物GSP2-R(含有与VN-oliod(T)18接头特异结合的序列)，所述反向引物GSP2-R的碱基序列如序列表SEQ ID NO.6所示，ddH2O补至25μl，混匀。扩增程序：98℃预变性5min；98℃变性10s、59℃退火10s、72℃延伸1min、30个循环；72℃终延伸10min。使用AxyPrep PCR清洁试剂盒对PCR产物进行纯化回收。使用超微量核酸浓度测定仪测定PCR产物的浓度。

(5)连接T载体测序

反应体系如下(10μl)：PCR扩增好的DNA片段(20-50ng)，pCloneEZ-TOPO载体1μl，10xEnhancer 1μl,ddH2O补至10μl，混匀。室温下(20-30℃)，反应时间不超过5min。如果室温较低，使用PCR仪控温，可设25℃反应5min。取5μl连接液转化50μl DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴10min；42℃水浴热激60s，立即放置于冰上静置2min；加入300μl LB培养基，37℃220rpm振荡培养1h；吸取100μl菌液涂板，37℃培养过夜；第二天早上，挑单克隆，测序。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 武汉核圣生物技术有限公司

<120> 利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcacgggc agcuugccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 2

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggtaatgtt acaggagtag ggcacgggca gcttgccggg ttttagagct agaaatagca 60

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 120

tttgaagagc 130

<210> 3

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccattacaa tgtcctcatc ccgtgcccgt cgaacggccc aaaatctcga tctttatcgt 60

tcaattttat tccgatcagg caatagttga actttttcac cgtggctcag ccacgaaaaa 120

aaacttctcg 130

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctacgtaa cggcatgaca gtgttttttt tttttttttt t 41

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggcacgggc agcttgccgg gtt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctacgtaa cggcatgaca gtg 23

Claims (3)

1.利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、获得转录合成sgRNA的DNA模板；

S2、加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH8.0Tris-HCl，DTT，氯化镁，亚精胺，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应；

S3、加入DNase I去除DNA模板；

S4、纯化回收转录产物；所述单亚基RNA聚合酶为

类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述sgRNA如序列表SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA末端有一串polyU结构；

合成的DNA寡核苷酸作模板:所述DNA模板为两条互补的DNA单链，所述两条互补的DNA单链包括正向单链和互补链，所述正向单链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述互补链的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，步骤S2所述转录反应的温度为37℃，反应时间为1-2h。

3.如权利要求1所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，步骤S4所述纯化转录产物的方法有试剂盒纯化法、乙醇沉淀法、RNA氯化锂沉淀法。

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