CN108998459B - 一种淫羊藿次苷d2的生物生产方法 - Google Patents

一种淫羊藿次苷d2的生物生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种淫羊藿次苷D2的生物生产方法，包括产淫羊藿次苷D2重组菌的构建和发酵方法。淫羊藿次苷D2重组菌的构建方法为：全化学合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc和带trc启动子的糖基转移酶基因sugt3，将skdc基因和sugt3基因整合至SyBE‑002447染色体上，得到SDR2菌株。以葡萄糖为前体，对SDR2菌株进行发酵生产淫羊藿次苷D2。本发明使用工程大肠杆菌生产淫羊藿次苷D2，可解决淫羊藿次苷D2的来源问题，降低成本。

Description

一种淫羊藿次苷D2的生物生产方法
技术领域
本发明所属生物医药技术领域，涉及一种产淫羊藿次苷D2的重组菌及构建方法和淫羊藿次苷D2的生物生产方法。
背景技术
淫羊藿次苷D2(icariside D2)，分子式为C14H20O7，分子量为300.30。淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)等植物的有效成分，具有良好的抗癌、抗炎、降血压等药理活性，具有重要的药用价值。
淫羊藿次苷D2通常从野生淫羊藿等植物的根、茎中提取，面临着提取含量低，提取工艺复杂，生产周期长等问题。化学方法合成淫羊藿次苷D2需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，不利于工业生产。
发明内容
本发明利用一种酮基脱羧酶基因以及一种糖基转移酶基因，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖等生物质碳源合成淫羊藿次苷D2，使生产成本最低化。
本发明的第二个目的是提供产淫羊藿次苷D2的重组菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供产淫羊藿次苷D2的重组菌发酵制备淫羊藿次苷D2的方法。
本发明的技术方案概述如下：
产淫羊藿次苷D2的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带trc启动子的糖基转移酶基因sugt3,所述序列如SEQ ID No.2所示；
(2)将带trc启动子的skdc基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447中，同时敲除feaB基因，得到TRS2菌株；
(3)将带trc启动子的sugt3基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌TRS2菌株中，同时敲除lacI基因，得到SDR2菌株。
按上述方法构建产淫羊藿次苷D2的重组菌SDR2菌株。
产淫羊藿次苷D2的重组菌SDR2制备淫羊藿次苷D2的方法，包括如下步骤：
将重组菌SDR2菌株接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到达0.8-1.0之间时，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵36h，生产淫羊藿次苷D2。
本发明的优点：
淫羊藿次苷D2具有抗癌、抗炎、降血压等多种药理活性，应用于药品、食品等工业生产中。本发明使用工程大肠杆菌，葡萄糖为碳源，利用组成型表达发酵生产淫羊藿次苷D2，微生物合成成本低、产量高。本发明可解决淫羊藿次苷D2的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
具体实施方式
利用一种酮基脱羧酶基因skdc以及一种糖基转移酶基因sugt3，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖为生物质碳源合成淫羊藿次苷D2生产成本最低化。
原始底盘大肠杆菌是高产酪氨酸的菌株，名称为SyBE-002447，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101
本发明所用pKD46质粒和pCP20质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。
LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
含有葡萄糖的M9培养基组成为：0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、3.0g/L KH2PO4、17.1g/L Na2HPO4·12H2O、0.025％酵母粉，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入过膜的终浓度为5mM MgSO4、0.1mM CaCl2以及灭菌的10g/L葡萄糖。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明设计了淫羊藿次苷D2的人工生物合成途径，详细的合成过程如下：以葡萄糖或者其他生物质为碳源，经过酪氨酸途径合成对羟基苯丙酮酸。对羟基苯丙酮酸在酮基脱羧酶(Skdc)的催化作用下合成4-羟基苯乙醛，4-羟基苯乙醛在大肠杆菌內源乙醇脱氢酶(Adh)催化下生成4-羟基苯乙醇(酪醇)，在糖基转移酶(Sugt3)的催化下，酪醇与UDP-葡萄糖结合合成淫羊藿次苷D2。
实施例1 酮基脱羧酶基因skdc和糖基转移酶基因sugt3表达盒的设计
优选酮基脱羧酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长skdc基因，并在基因前加入trc启动子，构成skdc表达盒，合成序列如SEQ ID No.1示。
优选糖基转移酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长sugt3基因，并在基因前加入trc启动子，构成sugt3表达盒，合成序列如SEQ ID No.2示。
实施例2 λ-red同源重组方法敲除feaB基因同时整合skdc基因到底盘菌株SyBE-002447染色体上。
敲除feaB基因同时整合skdc基因到底盘菌株SyBE-002447染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：
1、整合片段的制备：以KF(SEQ ID NO.3)为上游引物，以KR(SEQ ID NO.4)为下游引物，以SEQ ID NO.1为模板，采用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，PCR制备KC片段。PCR应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将得到的KC片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。
2、同源重组：把pKD46质粒导入菌种SyBE-002447，获得SyBE-002447/pKD46，将活化的菌种SyBE-002447/pKD46，接种于10ml LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mM L-***糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取KC片段7.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布平板，37℃过夜培养。
3、整合菌株筛选：挑取单菌落，以TF(SEQ ID NO.05)为上引，TR(SEQ ID NO.6)为下引，采用Taq DNA聚合酶，进行菌落PCR验证。PCR条带大小约为1900bp时，获得敲除feaB基因同时将skdc基因整合到底盘菌株SyBE-002447染色体上的菌株TRS2/pKD46。菌落PCR应条件为预变性：97℃，5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
4、缺失pKD46：挑取PCR验证正确单菌落，在42℃下无抗生素的平板上连续传代3次。在氨苄青霉素抗性平板和无抗性平板上同时接种，氨苄青霉素抗性平板不生长，无抗性平板上生长的菌落为pKD46缺失菌株，即获得敲除feaB基因同时将skdc基因整合到底盘菌株SyBE-002447染色体上的菌株TRS2。37℃液体LB培养后，甘油保存。
实施例3 λ-red同源重组方法敲除lacI基因同时整合sugt3基因到大肠杆菌底盘菌株TRS2染色体上。
敲除lacI基因同时整合sugt3基因到大肠杆菌TRS2染色体上的菌株构建过程详细步骤如下：
1、整合片段的制备：以UF为上游引物(SEQ ID NO.7)、以UR为下游引物(序列SEQID NO.8)，以SEQ ID NO.2为模板，重叠延伸PCR制备UC片段。PCR应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将得到的UC片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。
2、同源重组：将活化的菌种TRS2/pKD46，接种于10ml LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mM L-***糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取UC片段7.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布平板，过夜培养。
3、整合菌株的筛选：挑取单菌落，以IF(20bp lacI上游同源臂，SEQ ID NO.9)为上引，IR(20bp sugt3下游引物，SEQ ID NO.10)为下引，采用Taq DNA聚合酶，进行菌落PCR验证。PCR条带大小约为1500bp时，获得整合sugt3基因到底盘菌株TRS2染色体上的菌株SDR2/pKD46。
4、缺失pKD46：挑取PCR验证正确单菌落SDR2/pKD46，在42℃于无抗平板传代3次。在氨苄青霉素抗性平板和无抗性平板上同时接种，氨苄青霉素抗性平板不生长，无抗性平板上生长的菌落为pKD46缺失菌株，即获得敲除lacI基因同时将sugt3基因整合到菌株TRS2染色体上的菌株SDR2。37℃液体LB培养后，甘油保存。
实施例4 重组菌TRS2的发酵及检测
将重组菌重组菌TRS2接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到0.8-1.0之间时，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵36h，合成酪醇。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)***检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1mL/min；进样量20μL；柱温室温；紫外检测器，检测波长225nm。TRS2菌株摇瓶发酵36h，酪醇产量为1.6g/L。
实施例5 重组菌SDR2的发酵及检测
将重组菌SDR2接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到0.8-1.0之间时，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵36h，合成淫羊藿次苷D2。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)***检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1mL/min；进样量20μL；柱温室温；紫外检测器，检测波长225nm。SDR2菌株摇瓶发酵36h，淫羊藿次苷D2产量为0.7g/L。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种淫羊藿次苷D2的生物生产方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1847
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg agaggatggc tccggttaaa caggacttca 60
acatcgacgt tcagaccatc gaaaacaccg acatctctct gtctgaatac atctacctgc 120
gtatcgctca actgggtgtt aaatctatct tcggtgttcc gggtgacttc aacctgaacc 180
tggttgacga actggacaaa gttccgcagc tgaaatggat cggttgctgc aacgaactga 240
acgctaccta cgctgctgac ggttacgcta aagctagtgg tactatcggt gttgttgtta 300
ccacctacgg tgttggtgaa ctgtctgcta tcaacggtat cgctggtgct ttcgctgaat 360
acgctccggt tctgcacatc gttggtactt ctgctatggc taccaaacgt ctggaacacg 420
ttcacaacat ccaccacctg gctggttcta aaaacttcct ggaccgtccg gaccactaca 480
tctacgaaaa aatggttgac gacatctgca tcgttaaaga atctctgtct gaaatcgaaa 540
acgcttgcgg tcagatcgac aacgctatcg ttcagaccta cctgctgtct cgtccgggtt 600
acctgttcct gccgcgtaac atggctacca tgaaagttcc gcgtgaacgt ctgttcaacc 660
agccgctggc tctggaacgt gttgacctgc acccgggtga aaccctgcaa gttgttgaaa 720
aaatcctgga aaaattctac cacgctaaag aaccggctct gatcgttgac tacctgaccc 780
gtccgttccg tatgatggaa aactgctcta aactgatcgg tgctctggaa aacaaagtta 840
acatcttctc tcgtccgatg tctaaaggtt tcgttgacga atctcacccg cgttacatcg 900
gttgctacat cggtaaacag tctaaacacc cgtctacctc tgacatcctg gaaaaaaaat 960
ctgacttcat cctgtctgtt ggtactttcg acgttgaaac caacaacggt ggtttcacct 1020
ctaaactgcc gcaggaacac ctggttgaac tgaacccgca cttcacccgt gttggtactc 1080
aatgcttctc taacgttaac atgtgccacg ttctgccgct gctggcttct aaactgcgtg 1140
gtgacctgat ctctatggct accgttcacc cgaacgactt ctctctgcgt aaaaaagaaa 1200
aagctcaaga caaaatgaaa gctctgaacc agtctcacct ggttaaatct accgaactgc 1260
tgctgaacgc taacgacacc ctgatcgttg aaacctgctc tttcatgttc gctgttccgg 1320
acatcgcttt cccgaacaac acccagttca tctctcaatc tttctacaac tctatcggtt 1380
acgctctgcc ggctaccctg ggtgtttcta tcgctaaacg tgacttccgt aaaccgggta 1440
aagttgttct gatccagggt gacggttctg ctcaaatgac catccaggaa ctggctacca 1500
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aacgtatgat cctgggtccg accaaagaat acaacgacat cgctccgaac tgggactgga 1620
ccggtatgct gcgtgctttc ggtgacatcc gtggtcactc taaatctatc tctatcgaca 1680
cctgcggtcg tctggacaaa ctggttcaga cccgtgaatt tcaggaaccg acccacctga 1740
acttcgttga actgatcctg ggtcgtatgg acgctccgga acgtttcgct aacatggtta 1800
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cttaccagca ggttctgacc tctctgccgt cttctatcga ccacatcttc ctgccgcagg 240
ttgacctgac cgacgttgtt tctcagtctc cggctcaccc gcgtatcgaa accctgatct 300
ctctgaccgt tgctcgttct ctgtcttctc tgcgtaccac cctgtcttct ctgcaatctt 360
ctaaaaacct ggtttctctg gttgttgacc tgttcggtac tgacgctttc gacccggcta 420
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<213> 人工序列()
<400> 9
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 10
ttagtgtttc atagaagaac 20

Claims (3)

1.产淫羊藿次苷D2的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
（1）人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述基因skdc核苷酸序列如SEQID No.1所示； 人工全合成带trc启动子的糖基转移酶基因sugt3，所述基因sugt3核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
（2）将带trc启动子的skdc基因，通过λ-red 同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447中，所述大肠杆菌SyBE-002447现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7962；同时敲除feaB基因，得到TRS2菌株；
（3）将带trc启动子的sugt3基因，通过λ-red 同源重组技术整合到大肠杆菌TRS2菌株中，同时敲除lacI基因，得到SDR2菌株。
2.权利要求1的方法构建的产淫羊藿次苷D2的重组菌SDR2菌株。
3.利用权利要求2所述产淫羊藿次苷D2的重组菌制备淫羊藿次苷D2的方法，其特征是包括如下步骤：
将重组菌SDR2菌株接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600达到0.8-1.0之间时，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵36h，生产淫羊藿次苷D2。
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