CN108998419A

CN108998419A - 一种低免疫原性、可诱导凋亡的ips细胞制备方法

Info

Publication number: CN108998419A
Application number: CN201810916134.6A
Authority: CN
Inventors: 顾雨春; 吴理达; 尹乐; 谭声江
Original assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因修饰的iPS细胞及其制备方法。本发明提供了敲除B2M基因且表达FKBP‑Caspase9融合蛋白的iPS细胞，该iPS细胞的免疫原性较低，且可受控程序性凋亡。而由于进行的修饰是基因组级别的基因修饰，因此免疫原性的降低以及可受控程序性凋亡均可保持稳定性，并使分化获得的细胞保持这一特点。免疫原性降低有益于异体回输，可受控程序性凋亡提高了细胞的安全性，B2M基因敲除后，不能形成正常的MHCI，细胞免疫原性降低，此单克隆细胞株全部无B2M蛋白表达。

Description

一种低免疫原性、可诱导凋亡的IPS细胞制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因修饰的iPS细胞及其制备方法。

背景技术

细胞治疗(cell therapy)是利用正常或生物工程改造过的人体细胞，对组织、器官进行修复的治疗方法。一般来讲，细胞治疗包括肿瘤细胞免疫治疗，以及干细胞治疗两大类。目前，细胞治疗在治疗癌症、血液病、心血管病、糖尿病、老年痴呆症等方面显示出越来越高的应用价值。

干细胞(stem cell)具有自我更新能力以及多向分化潜能，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，虽然目前干细胞治疗应用仍在探索阶段，应用案例还较少，但干细胞治疗拥有广阔的前景，而且干细胞治疗应用范围很广，例如：治疗神经***疾病、免疫***疾病、替换受损细胞，组织，器官等。然而，干细胞制备成本较高，而且受年龄等因素影响，患者未必能够及时、有效的获得所需的干细胞。

iPS细胞，英文全称为Induced pluripotent stem cells，中文全称是诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。iPS细胞的获得方法相对简单和稳定，不使用胚胎细胞或***，不仅在伦理上占有优势，更扩大了干细胞的来源范围，使更多患者能够有机会利用iPS技术获得所需的干细胞。另一方面，虽然iPS细胞在细胞治疗中表现出优良的性能，但研究表明iPS细胞中的外源的诱导因子(Oct4，sox2，cMyc，klf4)的存在，增加了iPS在细胞治疗中转化为癌细胞的风险。因此，为了确保iPS细胞治疗的安全，而降低iPS细胞的免疫原性、降低iPS细胞的肿瘤化风险，对干细胞异体移植具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基因修饰的iPS细胞及其制备方法，该iPS细胞免疫原性低、可受控程序性凋亡。

本发明提供的基因修饰的iPS细胞，其表达FKBP-Caspase9融合蛋白，且不表达B2M蛋白。

本发明所述iPS细胞的制备方法，采用Cas9技术敲除iPS细胞的B2M基因；采用慢病毒感染法或定点敲入技术使iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。

本发明中，所述B2M基因的敲除采用含有SEQ ID NO.1所示序列的载体。

本发明中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述表达FKBP-Caspase9融合蛋白基因的慢病毒表达载体为pLenti-CMV/To-Neo。

本发明还提供了靶向敲除iPS细胞B2M基因的Cas9/gRNA载体，其含有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明还提供了FKBP-Caspase9融合蛋白的慢病毒表达载体，其含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明所述的iPS细胞在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于细胞治疗的产品，其包含本发明所述的iPS细胞。

本发明还提供了一种低致瘤风险的细胞治疗方法，其为：给予本发明所述的iPS细胞，当发生肿瘤化风险时给予AP1903。

本发明提供了敲除B2M基因且表达FKBP-Caspase9融合蛋白的iPS细胞，该iPS细胞的免疫原性较低，且可受控程序性凋亡。而由于进行的修饰是基因组级别的基因修饰，因此免疫原性的降低以及可受控程序性凋亡均可保持稳定性，并使分化获得的细胞保持这一特点。免疫原性降低有益于异体回输，可受控程序性凋亡提高了细胞的安全性，B2M基因敲除后，不能形成正常的组织相容性复合体I(major histocompatibility complex I，MHC I)，细胞免疫原性降低，此单克隆细胞株全部无B2M蛋白表达。

附图说明

图1示Cas9/gRNA载体图谱；

图2示T7E1酶切的凝胶电泳图；

图3示western鉴定结果；

图4示测序结果；

图5示细胞凋亡实验结果图，其中，图5-a示WT iPS细胞加入AP1903的效果，图5-b示经实施例2编辑的iPS细胞加入AP1903的效果；

图6示AP1903作用下的细胞凋亡率。

具体实施方式

本发明提供了基因修饰的iPS细胞及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，表达所述B2M蛋白的基因的敲除位点位于B2M基因的第1号外显子，其序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白中，C端为FKBP或Caspase9皆可，一些实施例中，所述融合蛋白的C端为FKBP。为了更好的使FKBP-Caspase9融合并发挥功能，FKBP与Caspase9序列之间不存在Linker。本发明一些实施例中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

B2M(beta-2-microglobulin)蛋白，是人类白细胞抗原中的一种，敲除B2M基因使细胞不表达该蛋白可有效降低其自身免疫原性。这对于干细胞诱导产生的下游细胞的异体移植等相关研究及应用，具有重要意义。AP1903等类似药物可与FKBP蛋白结合使FKBP蛋白形成二聚体。FKBP蛋白与Caspase9蛋白形成的融合蛋白，在AP1903存在时形成二聚体可诱导细胞程序性凋亡。以此为基础，对IPS细胞进行基因修饰，使之稳定表达FKBP-Caspase9蛋白，在IPS细胞发生肿瘤化风险时，可通过AP1903进行诱导，使之程序性凋亡，以此可提高IPS细胞的安全性。因此，本发明提供的基因修饰的iPS细胞不仅具有较低的免疫原性低、还可受控程序性凋亡，在移植后发生肿瘤风险的情况下，采用AP1903或其类似物使细胞凋亡。

本发明所述iPS细胞的制备方法包括，采用Cas9技术敲除iPS细胞的B2M基因；采用慢病毒感染法或定点敲入技术使iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。

所述B2M基因的敲除采用Cas9技术，敲除位点位于B2M基因的第1号外显子上。本发明中，敲除位点的序列为GAGTAGCGCGAGCACAGCTA，如SEQ ID NO:1所示。

一些实施例中，所述B2M基因的敲除采用含有SEQ ID NO.1所示序列的载体。用于构建B2M基因敲除载体的出发载体为LentiCRISPRv2(通用载体)。所述载体经活性验证后，使用Neon电转***转化iPS细胞。

一些实例中，采用慢病毒感染法使所述iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。在此实施例中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。用于构建FKBP-Caspase9融合蛋白的慢病毒转移载体为pLenti-CMV/To-Neo(通用载体)。所述含有表达FKBP-Caspase9融合蛋白基因的慢病毒表达载体经包装后转染iPS细胞。慢病毒的包装质粒为pspax和PMD2G。

在另一些方案中，采用定点敲入技术使所述iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。在此实施例中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。所述表达FKBP-Caspase9融合蛋白基因的敲入位点为AAVS1位点。用于构建FKBP-Caspase9融合蛋白敲入载体的出发载体为pMSCV-F-del Casp9(对通用载体进行基因修饰：前后加入AAVS1同源臂)。敲入位置AAVS1的gRNA靶点为GAGTAGCGCGAGCACAGCTA。

本发明方案中，对基因编辑的顺序不做限定，可先进行B2M基因的敲除，也可先进行FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的敲入，这些方案均在本发明的保护范围之内。在一些具体实施例中，对敲除B2M基因后的iPS细胞进行编辑，敲入FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因。

该载体的构建方法为将gRNA位点的DNA引物序列分别加上对应的粘性末端，然后将两条合成的引物序列退火形成双链DNA，通过T4连接酶切与酶切后的出发载体连接。所述出发载体为LentiCRISPRv2(通用载体)。连接的酶切位点为BsmB I。

本发明提供的慢病毒表达载体的出发载体为plenti-CMV/To-Neo，加入SEQ IDNO:2所示序列的酶切位点为Xho I和Xba I。

本发明还提供了FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的敲入载体，其含有AAVS1同源臂及SEQ ID NO.2所示的序列。

人类第19号染色体的AAVS1位点(又名为PPP1R2C位点)，是一个经过验证、能确保转入DNA正常表达的安全位点。该位点是一个开放的染色体结构区域，能保证转入基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点***外源基因片段对细胞无已知的副作用。

本发明实施例中，所述同源臂的左臂序列如SEQ ID NO.3所示，所述同源臂的右臂序列如SEQ ID NO.4所示，该载体的出发载体为pMSCV-F-del Casp9。

本发明中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的敲入载体的构建方法包括如下步骤：

将所获的的载体与LentiCRISPRv2载体共同转染敲除B2M基因的iPS细胞，以puro筛选，获得敲除B2M基因且表达FKBP-Caspase9融合蛋白的iPS细胞。

所述共同转染的方法为：Thermo Neon电转仪电转，参数：1200V 20ms 2plus。

本发明所述的iPS细胞在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

本发明提供了敲除B2M基因且表达FKBP-Caspase9融合蛋白的iPS细胞，该iPS的免疫原性较低，且可受控程序性凋亡。而由于进行的修饰是基因组级别的基因修饰，因此免疫原性的降低以及可受控程序性凋亡均可保持稳定性，并使分化获得的细胞保持这一特点。免疫原性降低有益于异体回输，可受控程序性凋亡提高了细胞的安全性，B2M基因敲除后，不能形成正常的MHCI，细胞免疫原性降低，此单克隆细胞株全部无B2M蛋白表达。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，iPS细胞来自成纤维细胞(用于IPS诱导基因组合：Oct4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28、p53DD)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、构建B2M基因敲除位点对应的Cas9/gRNA载体，载体图谱如图1。

位点信息：

gRNA1:GGCCACGGAGCGAGACATCT；

gRNA2：GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO.1)

将gRNA位点的DNA序列加上酶切位点，再合成其互补序列，然后将两条序列形成双链DNA，通过酶切与出发载体连接。所述出发载体为LentiCRISPRv2。连接的酶切位点为BsmBI。

2、测试gRNA位点活性

2.1将Cas9/gRNA载体转染293T细胞，转染96h后提取293T细胞基因组，同时设转染空载体293T细胞的对照组。

2.2使用2.1获得的基因组DNA作为模板对gRNA位点前后约500bp长度使用高保真酶进行PCR扩增，并将PCR产物进行纯化。

引物信息：

F：CACCTAGCTGTGCTCGCGCTACTC

R：AAACGAGTAGCGCGAGCACAGCTA

2.3将2.1获得的PCR产物退火，使用T7E1内切酶进行酶切，凝胶电泳，结果如图2。图2中泳道从左至右依次为：

Maker；

野生型293T细胞基因组DNA的PCR产物的退火产物；

转染空载体293T细胞基因组DNA的PCR产物退火后经T7E1酶切的产物；

转染含gRNA1的Cas9/gRNA载体的293T细胞基因组DNA的PCR产物退火产物；

转染含gRNA1的Cas9/gRNA载体的293T细胞基因组DNA的PCR产物退火后经T7E1酶切的产物；

转染含gRNA2的Cas9/gRNA载体的293T细胞基因组DNA的PCR产物退火产物；

转染含gRNA2的Cas9/gRNA载体的293T细胞基因组DNA的PCR产物退火后经T7E1酶切的产物。

结果显示，其中gRNA1和gRNA2的Cas9/gRNA载体电泳结果皆有明显条带产生(如图2中箭头所示)，二者皆进行敲除实验。

2.4、将gRNA2的Cas9/gRNA载体，使用Neon电转***电转iPS细胞，在电转36h后加入终浓度为0.1μg/ml的puromycin进行筛选。

在puro筛选约4～6天后，IPS细胞稳定不死，且呈克隆状生长时，挑取单克隆，置于96孔板培养。

2.5、视单克隆细胞生长速度实时将单克隆细胞从96孔板转移到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板等，并实时将单克隆细胞扩增、冻存。

2.6、IPS细胞B2M基因敲除western鉴定：取约1×10⁵以上数目的待检测IPS单克隆细胞，提取蛋白进行western，使用B2M抗体进行检测，同时检测Tubulin或Actin作为内参，检测结果如图3，无蛋白表达的单克隆，进行下一步基因测序检测。采用cas9***敲除的效率理论上不超过44％，实际操作中敲除率往往只有5％～20％，本方案获得的6个单克隆细胞株中，有2个成功的敲除了B2M基因。

2.7、将2.6中获得的无蛋白表达的2个单克隆提取基因组作为模板，将gRNA靶点位置序列进行PCR扩增，将PCR产物纯化后连入T载体进行基因测序，结果如图4。结果显示：测序结果中缺失序列非3整数倍，说明该敲除成功，将该单克隆扩增冻存备用。测序验证结果显示，这两个无B2M蛋白表达的单克隆皆由gRNA2获得，未检测到由gRNA1获得的单克隆。

实施例2

对实施例1中获得的B2M敲除的单克隆iPS细胞进行基因修饰，使用慢病毒感染法使其表达FKBP-Caspase9基因，挑取单克隆扩增培养。

1.出发载体plenti-CMV/To-Neo(FKBP-Caspase9的序列如SEQ ID NO:2所示,酶切位点：Xho I和Xba I)，以包装慢病毒(包装质粒为pspax和PMD2G)，

2.使用1中获得的慢病毒感染B2M敲除的单克隆iPS细胞，并使用G418筛选后挑取单克隆

实施例3

1、实施例1制备的gRNA2的Cas9/gRNA载体，

2、FKBP-Caspase9融合蛋白的敲入载体：AAVS1同源臂的左臂序列如SEQ ID NO.3所示，AAVS1同源臂的右臂序列如SEQ ID NO.4所示；FKBP-Caspase9融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示；出发载体为pMSCV-F-del Casp9。

将上述两个载体共同转染iPS细胞，以puro筛选，获得敲除B2M基因且表达FKBP-Caspase9融合蛋白的iPS细胞。所述共同转染的方法为：Thermo Neon电转仪电转，参数：1200V 20ms 2plus。

效果验证

将获得的实施例2和实施例3获得的单克隆铺12孔板，同时设WT iPS作为对照，加入终浓度20nM的AP1903进行测试。

对实施例2制得的单克隆的测试结果如图5～6所示，WT组加入AP1903无明显凋亡，经过编辑的iPS细胞在加入AP1903约20h时细胞出现明显凋亡，如图5-b所示，将该克隆细胞扩增后冻存。细胞存活率的结果如图6，结果显示：对于在AP1903存在的条件下，经编辑的iPS细胞的存活率显著低于WT iPS，p<0.05。而对于经编辑的iPS细胞，在AP1903存在条件下的存活率显著低于无AP1903处理的对照，p<0.05。

实施例3制得的iPS细胞的测试结果与此相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京呈诺医学科技有限公司

<120> 一种低免疫原性、可诱导凋亡的IPS细胞制备方法

<130> MP1810500

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtagcgcg agcacagcta 20

<210> 2

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctcgagg gagtgcaggt ggagactatc tccccaggag acgggcgcac cttccccaag 60

cgcggccaga cctgcgtggt gcactacacc gggatgcttg aagatggaaa gaaagttgat 120

tcctcccggg acagaaacaa gccctttaag tttatgctag gcaagcagga ggtgatccga 180

ggctgggaag aaggggttgc ccagatgagt gtgggtcaga gagccaaact gactatatct 240

ccagattatg cctatggtgc cactgggcac ccaggcatca tcccaccaca tgccactctc 300

gtcttcgatg tggagcttct aaaactggaa tctggcggtg gatccggagt cgacggattt 360

ggtgatgtcg gtgctcttga gagtttgagg ggaaatgcag atttggctta catcctgagc 420

atggagccct gtggccactg cctcattatc aacaatgtga acttctgccg tgagtccggg 480

ctccgcaccc gcactggctc caacatcgac tgtgagaagt tgcggcgtcg cttctcctcg 540

ctgcatttca tggtggaggt gaagggcgac ctgactgcca agaaaatggt gctggctttg 600

ctggagctgg cgcggcagga ccacggtgct ctggactgct gcgtggtggt cattctctct 660

cacggctgtc aggccagcca cctgcagttc ccaggggctg tctacggcac agatggatgc 720

cctgtgtcgg tcgagaagat tgtgaacatc ttcaatggga ccagctgccc cagcctggga 780

gggaagccca agctcttttt catccaggcc tgtggtgggg agcagaaaga ccatgggttt 840

gaggtggcct ccacttcccc tgaagacgag tcccctggca gtaaccccga gccagatgcc 900

accccgttcc aggaaggttt gaggaccttc gaccagctgg acgccatatc tagtttgccc 960

acacccagtg acatctttgt gtcctactct actttcccag gttttgtttc ctggagggac 1020

cccaagagtg gctcctggta cgttgagacc ctggacgaca tctttgagca gtgggctcac 1080

tctgaagacc tgcagtccct cctgcttagg gtcgctaatg ctgtttcggt gaaagggatt 1140

tataaacaga tgcctggttg ctttaatttc ctccggaaaa aacttttctt taaaacatca 1200

gtcgactatc cgtacgacgt accagactac gcactcgact aa 1242

<210> 3

<211> 2150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catccccttt acccggtgct acacacttcc tagtatgccg tggggcaccc ctccggcctg 60

tagactccat ttcccagcat tccccggagg aggccctcat ctggcgattt ccactgggcg 120

cctcggagct gcggacttcc cagtgtgcat cggggcacag cgactcctgg aagtggccaa 180

gggccacttc tgctaatgga ctccatttcc cagcgctccc cgcgacctgc ccagcacacc 240

ctggggcagc gccgtgacgt cagcacgccg ggcggggacc gggagatcct tggggcggtg 300

gggggccagc ggcagttccc ggcggccccc ggggcgggcg ggcgggcggg tggtggcggc 360

ggttggggct cggcgctcgc tcgctcgctg ggcgggcggg cggtgcgatg tccggagagg 420

atggcccggc ggctggcccg ggggcggcgg cggcggctgc ccgggagcgg cgacgggagc 480

agctgcggca gtggggggcg cgggcgggcg ccgagcctgg ccccggagag cgccgcgccc 540

gcaccgtccg cttcgagcgc gccgccgagt tcctggcggc ctgtgcgggc ggcgacctgg 600

acgaggcgcg tctgatgctg cgcgccgccg accctggccc cggcgccgag ctcgaccccg 660

ccgcgccgcc gcccgcccgc gccgtgctgg actccaccaa cgccgacggt atcagcgccc 720

tgcaccaggt cagcgccccc cgcccggcgt ctcccggggc caggtccacc ctctgctgcg 780

ccacctgggg catcctcctt ccccgttgcc agtctcgatc cgccccgtcg ttcctggccc 840

tgggctttgc caccctatgc tgacaccccg tcccagtccc ccttaccatt ccccttcgac 900

caccccactt ccgaattgga gccgcttcaa ctggccctgg gcttagccac tctgtgctga 960

ccactctgcc ccaggcctcc ttaccattcc ccttcgacct actctcttcc gcattggagt 1020

cgctttaact ggccctggct ttggcagcct gtgctgaccc atgcagtcct ccttaccatc 1080

cctccctcga cttcccctct tccgatgttg agcccctcca gccggtcctg gactttgtct 1140

ccttccctgc cctgccctct cctgaacctg agccagctcc catagctcag tctggtctat 1200

ctgcctggcc ctggccattg tcactttgcg ctgccctcct ctcgcccccg agtgcccttg 1260

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tgagctctac tggcttctgc gccgcctctg gcccactgtt tccccttccc aggcaggtcc 1380

tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 1440

ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 1500

cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 1560

cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 1620

tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 1680

gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 1740

tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 1800

gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 1860

ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 1920

catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 1980

ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 2040

ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 2100

gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt 2150

<210> 4

<211> 2100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgacagaa aagccccatc cttaggcctc ctccttccta gtctcctgat attgggtcta 60

acccccacct cctgttaggc agattcctta tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc 120

atctctctcc ttgccagaac ctctaaggtt tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg 180

gagggagagc ttggcagggg gtgggaggga agggggggat gcgtgacctg cccggttctc 240

agtggccacc ctgcgctacc ctctcccaga acctgagctg ctctgacgcg gctgtctggt 300

gcgtttcact gatcctggtg ctgcagcttc cttacacttc ccaagaggag aagcagtttg 360

gaaaaacaaa atcagaataa gttggtcctg agttctaact ttggctcttc acctttctag 420

tccccaattt atattgttcc tccgtgcgtc agttttacct gtgagataag gccagtagcc 480

agccccgtcc tggcagggct gtggtgagga ggggggtgtc cgtgtggaaa actccctttg 540

tgagaatggt gcgtcctagg tgttcaccag gtcgtggccg cctctactcc ctttctcttt 600

ctccatcctt ctttccttaa agagtcccca gtgctatctg ggacatattc ctccgcccag 660

agcagggtcc cgcttcccta aggccctgct ctgggcttct gggtttgagt ccttggcaag 720

cccaggagag gcgctcaggc ttccctgtcc cccttcctcg tccaccatct catgcccctg 780

gctctcctgc cccttcccta caggggttcc tggctctgct cttcagactg agccccgttc 840

ccctgcatcc ccgttcccct gcatccccct tcccctgcat cccccagagg ccccaggcca 900

cctacttggc ctggacccca cgagaggcca ccccagccct gtctaccagg ctgccttttg 960

ggtggattct cctccaactg tggggtgact gcttggcaaa ctcactcttc ggggtatccc 1020

aggaggcctg gagcattggg gtgggctggg gttcagagag gagggattcc cttctcaggt 1080

tacgtggcca agaagcaggg gagctgggtt tgggtcaggt ctgggtgtgg ggtgaccagc 1140

ttatgctgtt tgcccaggac agcctagttt tagcgctgaa accctcagtc ctaggaaaac 1200

agggatggtt ggtcactgtc tctgggtgac tcttgattcc cggccagttt ctccacctgg 1260

ggctgtgttt ctcgtcctgc atccttctcc aggcaggtcc ccaagcatcg cccccctgct 1320

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agtaggaggg gctggagcca ggattcttag ggctgaacag agaagagctg ggggcctggg 1500

ctcctgggtt tgagagagga ggggctgggg cctggactcc tgggtccgag ggaggagggg 1560

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gagggaggag gggctggggc ctggactcgt gggtctgagg gaggaggggc tgggggcctg 1680

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gctgggggcc tggactcctt catctgaggg cggaagggct ggggcctggc ctcctgggtt 1800

gaatggggag gggttgggcc tggactctgg agtccctggt gcccaggcct caggcatctt 1860

tcacagggat gcctgtactg ggcaggtcct tgaaagggaa aggcccattg ctctccttgc 1920

ccccctcccc tatcgccatg acaactgggt ggaaataaac gagccgagtt catcccgttc 1980

ccagggcacg tgcggcccct tcacagcccg agtttccatg acctcatgct cttggccctc 2040

gtagctccct cccgcctcct ccagatgggc agctttggag aggtgaggga cttggggggt 2100

Claims

1.基因修饰的iPS细胞，其表达FKBP-Caspase9融合蛋白，且不表达B2M蛋白。

2.权利要求1所述iPS细胞的制备方法，其特征在于，采用Cas9技术敲除iPS细胞的B2M基因；采用慢病毒感染法或定点敲入技术使iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述B2M基因的敲除采用含有SEQ IDNO.1所示序列的载体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒感染法的慢病毒表达载体为pLenti-CMV/To-Neo。

6.靶向敲除iPS细胞B2M基因的Cas9/gRNA载体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的序列。

7.FKBP-Caspase9融合蛋白的慢病毒表达载体，其特征在于，含有SEQ ID NO.2所示的序列。

8.权利要求1的iPS细胞在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

9.一种用于细胞治疗的产品，其特征在于，包含权利要求1所述的iPS细胞。

10.一种低致瘤风险的细胞治疗方法，其特征在于，

给予权利要求1所述的iPS细胞，当发生肿瘤化风险时给予AP1903。