CN108992369A - 一种透明质酸、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种透明质酸、其制备方法和用途，所述透明质酸具有5kDa‑3000kDa的重均分子量、5kDa‑3000kDa的数均分子量、5kDa‑3000kDa的粘均分子量，并具有7‑15的多分散系数。本发明还涉及所述产品的制备方法以及用途。

Description

一种透明质酸、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体而言，涉及一种透明质酸、其制备方法以及在制备化妆品中的用途。

背景技术

透明质酸(hyaluronan，HA)又称糖醛酸、玻尿酸、琉璃糖碳基酸，是一种由交替排列的D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡糖所组成的直链线性大分子多糖。透明质酸存在于脊椎动物的***，例如透明软骨、滑膜关节液和皮肤组织(真皮和表皮)，并参与许多生理过程，例如粘附、发育、细胞运动、癌症、血管发生和伤口愈合(Laurent T.C.和FraserJ.R.E.，1992，FASEB J.6：2397-2404；及Toole B.P.，1991，Proteoglycans andhyaluronan in morphogenesis and differentiation.，Cell Biology of theExtracellular Matrix，pp.305-341，Hay E.D.编，Plenum，New York)。

传统对HA的开发集中在研究HA的理化特性的新型应用。例如，目前已经报道1000Da至3000kDa范围内的透明质酸的用途。其它研究包括对HA的预处理、新剂型带来的新功效、对HA进行化学改性和交联使其具有独特的性质。HA的生理机理的研究则是偏向于生理学和医学的方向。例如，HA如何通过细胞受体产生生理活性、各种HA的经皮渗透性以及相应的临床效果。

此外，本领域已经报道了，高分子量(200kDa-3500kDa)的透明质酸具有优异的保湿效果，且在物理性摩擦状态下具有润滑作用，可有利地将其用于医药品或化妆品。然而，分子量较高也使得透明质酸难以被人体吸收，在施用面与水接触后保湿效果不能持久。针对此，本领域已经开发包含低分子量级分的透明质酸。目前所公知的是，高分子量级分(平均分子量为1MDa-1.5MDa)的HA为化妆品组合物提供优良的保湿性质，而低分子量级分(平均分子量为20kDa-400kDa)的HA由于能够渗透皮肤屏障，显示出抗皱性质。在这方面，本领域已经提供具有这两种分子量级分的透明质酸组合物(CN101123942A)。然而，仍需对这两种不同分子量级分的透明质酸的比例进行进一步研究，以实现短期和长期效果的平衡。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种透明质酸，所述透明质酸具有5kDa-3000kDa的重均分子量、5kDa-3000kDa的数均分子量、5kDa-3000kDa的粘均分子量，并具有7-15的多分散系数。

在第二方面，本发明提供了一种化妆品组合物，所述化妆品组合物包含第一方面所述的透明质酸。

在第三方面，本发明涉及所述透明质酸在制造化妆品方面的用途。

有益效果

本发明人经过深入研究发现，虽然现有技术教导了低分子量级分具有抗皱效果、高分子量级分具有保湿效果，然而在将不同分子量级分进行组合时，不但能在表观效果上相互补充，而且这两种级分所具有的协同作用能够同时实现快速起效和效果的长时间保持。特别地，发明人发现，当PD在1.5-2.9范围内且分子量范围为10-80kDa时，透明质酸的主要作用在于细胞修复和伤口愈合、促进细胞以及营养成分的增长(特别是弹性蛋白的合成)、提高皮肤屏障完整性以及增加皮肤弹性。当PD在3.0-15.0范围内且分子量范围为5kDa-3000kDa时，透明质酸具有瞬时提拉、提高皮肤紧致度和弹性的作用。而当PD在7.0-30.0范围内且分子量范围为5kDa-3000kDa时，透明质酸能够实现长期锁水保湿，长期抗皱，提高皮肤光滑度和弹性。

因此，出于瞬时和长效效果平衡的考虑，本发明选择PD在7.0-15.0的多分散透明质酸。根据本发明的实施例，具有该特征的透明质酸表现出优异生理活性和经皮渗透性；在受试者测试中，由具有该特征的透明质酸制成的化妆品具有优异的抗皱、保湿、提高皮肤弹性等功效，并且同时具有优异的瞬时和长效效果。

附图说明

图1为根据初步筛选，不同产品原型皮肤水分测试筛选的结果图。

图2为根据初步筛选，不同产品原型TEWL经皮水分流失图。

图3为透明质酸产品C(Cube3瞬华)的色谱图。

图4为透明质酸产品D(Difference昭华)的色谱图。

图5为根据效果例1，施用产品Cube3瞬华30min和120min后皮肤角质层的水分含量变化。

图6为根据效果例1，施用产品Cube3瞬华30min和120min后皮肤水分流失的改变。

图7为根据效果例1，施用产品Cube3瞬华后皮肤弹性增加率。

图8为根据效果例1，施用产品Cube3瞬华后皮肤光滑度增加率。

图9为根据效果例1，施用产品Cube3瞬华后皮肤皱纹数量改变率。

图10为根据效果例1，专业医生对施用产品Cube3瞬华后提拉抗皱功效的评分。

图11为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤水分增加率。

图12为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤弹性增加率。

图13为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤光滑度改善率。

图14为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤粗糙度改变率。

图15为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤皱纹数量改变率。

图16为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤鳞屑改变率。

图17为根据效果例2，施用产品Difference昭华后皮肤皱纹体积改变率。

图18A-18C为根据效果例2，专业医生对施用产品Difference后的功效评分。

具体实施方式

本发明提供了一种新型配比的透明质酸(HA)。通过体外(细胞水平)和针对受试者的***性生理学研究，我们研发、制备并筛选出具有优异生理活性和经皮渗透性的HA产品；而人体临床测试证实，该产品具有优异的抗皱、保湿、提高皮肤弹性等功效，并且同时具有优异的瞬时和长效效果。

本文使用的术语“透明质酸”也称为乙酰透明质酸，具有本领域公知的含义。透明质酸的基本单位单元为重复的N-乙酰-D-氨基葡糖(GlcNAc)和D-葡糖醛酸(GlcUA)二糖单位，这些二糖单位由交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接到一起，形成直链线性结构。由于透明质酸常以无机盐的形式存在，在本领域中，术语“透明质酸”也包括其无机盐，例如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸镁、透明质酸钙、透明质酸锌或透明质酸钴等。

本文使用的术语“多分散系数(polydispersity，PD)”在本领域表征了分子量分布曲线的宽度，以重均分子量Mw和数均分子量Mn的比值计，即PD＝Mw/Mn，其中，数均分子量Mn为样品中所有聚合物分子的总重量除以分子总数，重均分子量Mw为各分子的重量分数与其相应的分子量相乘所得，即按重量统计平均的分子量。一般而言，PD值越小表明分子量分布范围越窄。此外，术语“粘均分子量”(Mv)为用溶液黏度法测得的平均分子量，其测量方法例如参见CN103124558B。

透明质酸的各平均分子量(例如重均分子量、数均分子量和粘均分子量)可以使用本领域的标准方法来确定，例如Ueno等，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta 272：1-40；和Wyatt Technologies，1999，Light ScatteringUniversity DAWN Course Manual和DAWN EOS Manual，Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，California所描述的那些方法。

在一些实施方式中，本发明的透明质酸分子量范围为5kDa-3000kDa，具体而言具有5kDa-3000kDa的重均分子量、5kDa-3000kDa的数均分子量以及5kDa-3000kDa的粘均分子量，优选具有30kDa-1000kDa的重均分子量、20kDa-150kDa的数均分子量以及30kDa-600kDa的粘均分子量，Mw/Mn在7-15。

在一些实施方式中，本发明的透明质酸具有的多分散系数为7-15。在一些实施方式中，本发明的透明质酸具有的多分散系数为8-12。

可将本发明的含有透明质酸作为化妆品的活性成分，实现对皮肤护理。包含本发明的透明质酸的化妆品没有特别限定，可列举例如爽肤水、面霜、洗面奶、面膜、凝胶及外用软胶囊剂型，例如用于皮肤的清洗剂、化妆水、雪花膏、冷霜、乳液、面膜、粉底化妆品、胭脂、口红、指甲修整剂等甲用化妆品、睫毛油等眼用化妆品、用于毛发的洗发水、护发素、头发修整剂、剃须液和刷牙剂。

实施例

下面将采用实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于这些实施例。

分析方法

透明质酸产品的分子量范围、重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、粘均分子量(Mv)和分散系数(PD)：使用安捷伦公司的1260型凝胶渗透色谱仪(GPC)和G1362A示差检测器，测定温度为30℃，流动相为0.1M硝酸钠超纯水溶液，流速为0.6mL/min，按照《中国药典》2015版分子排阻法检测。以不同分子量葡聚糖作为标准品，用GPC软件绘制标准曲线，通过软件计算后的得到产品的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、粘均分子量(Mv)和分散系数(PD)。

1％水溶液黏度：利用转子型旋转黏度计，根据《中国药典》2015版黏度测定法测得的质量分数为1w/v％的水溶液黏度。

实施例1初步筛选

为了研发性能更好的透明质酸产品，发明人首先制备了不同PD和分子量范围的HA。

HA的制备

本发明的透明质酸由将兽疫链球菌(Sterptococcus zooepidemicus，购自ATCC，目录号为HA-116ATCC39920)发酵提纯制得，具体方法如下：

培养基

斜面培养基(g/L)：心脑浸粉(BHI)36，葡萄糖12，酵母粉12，琼脂粉24，pH 7.2。

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉20，七水硫酸镁2.0，四水硫酸锰0.1，磷酸二氢钾2.0，碳酸钙20，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：酵母粉20，磷酸氢二钠6.2，硫酸钾1.3，葡萄糖140，七水硫酸镁2.0，pH 7.0。

培养方法

斜面培养：接种后的斜面置于37±0.2℃恒温培养箱中培养16±0.5h，用于摇瓶接种。

种子培养：将培养好的斜面种子接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速200r/min，温度37±0.2℃，培养时间14-16h。

发酵培养：按10％的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐KFT-7L(Biostat B2nd generation 1000009844，Sartorius，德国)，罐中装发酵培养基3.5L，搅拌转速200±10r/min，通气量1.0vvm，温度37±0.2℃，利用pH电极在线检测pH，通过自动加料泵流加5mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在7.0±0.1以内。利用溶氧电极在线检测溶氧浓度，每隔2h取样一次进行检测分析。

提取纯化

取发酵液适量，置于不锈钢罐(出料口连接板框滤机)，加水，调至浓度约为0.5％，搅拌混合液，搅拌速度200±10r/min，温度为60℃，混合约30分钟，混合均匀后，加6mol/L的HCl调节pH至1.5～2.6后在此温度下继续搅拌，根据表1调节搅拌和出料时间(2-13h左右)，使得出料时罐内保持搅拌状态。出料、过滤至滤液透光率达到99.9％(550nm)后，得到混合滤液○1，置于不锈罐，缓慢加5mol/L NaOH调pH至7，保持搅拌，搅拌速度200±10r/min，得到混合滤液○2。取混合滤液○2，加70％乙醇沉淀，保持搅拌，搅拌速度50±5r/min，得到混合液体○3。取混合液体○3，离心1小时，速度4000r/min，弃去上清液，取下层沉淀物，干燥，每2小时翻盘，取干燥样品测定干燥失重，使干燥至恒重，粉碎，过80目筛，获得4种透明质酸产品：A(Mw＝1460kDa，Mn＝84.9kDa，PD＝17.2)、C(Mw＝867kDa，Mn＝97.8kDa，PD＝8.86)、E(Mw＝1255kDa，Mn＝1014kDa，PD＝1.24)、K(Mw＝60.4kDa，Mn＝31.4kDa，PD＝1.92)。

表1

产品编号	pH	搅拌时间(h)	出料时间(h)
				A	2.5	3	12
C	2.3	4	6
				E	2.6	4.5	0.8
K	1.8	10	1
				B	2.4	3	4
D	2.5	3	8
				H	2.0	8	0.8

根据表2将各产品配制为霜剂，并配制空白对照霜剂。

表2

空白霜剂制备方法：称取黄原胶和水，充分溶解混合均匀，加入EDTA二钠，加热至约85℃，作为A相，另称取环五聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯、PEG-6硬脂酸酯、PEG-32硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯，加热至约90℃使全部溶解，作为B相，在相近温度下，将B相缓慢加入A相，加入同时进行搅拌，均质3-5分钟，搅拌降温，低于50℃时加入甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、硝酸镁、氯化镁混合物以及三乙醇胺。

将根据表1制备的透明质酸以不同比例加入空白对照霜剂，进行短期角质层水分含量和经皮水分流失测试。

选择25-60岁的15名健康女性作为受试者，对施用本发明产品的效果进行评价。在21±1℃、50±5％湿度下进行研究。分别在面部选择测试区域(每一产品3cm×3cm涂覆面积)和对照区域。要求受试者们在进行测量之前至少8小时不要洗脸，且不要在测试所涉及的区域涂敷任何产品。在研究开始时和使用产品后30min和120min对测试区域及对照区域短期角质层水分含量进行评估。每次测试中产品和空白对照霜剂的用量保持一致。

使用皮肤角质层水分测量仪(corneometer，Courage&Khazaka公司)，采用皮肤角质层水分测量法对皮肤表面水合作用进行评估。皮肤角质层水分测量法测定角质层的电容，并由此反映出相对角质层含水量。测量结果如图1所示，编号C、K产品在短期有优异的增加皮肤水分能力。

参考该初筛范围，又制备了3种产品：B(Mw＝1374kDa，Mn＝319kDa，PD＝4.3)、D(Mw＝1012kDa，Mn＝98.2kDa，PD＝10.3)和H(Mw＝255kDa，Mn＝189kDa，PD＝1.35)。对于产品B、D、H以及上述制备的E，测定20名女性使用前、使用30分钟、使用120分钟的经皮水分流失。使用经皮水分流失(TEWL)测试进行皮肤水分保护层的评估。经皮水分流失(TEWL)测试测定水分流失值，并由此反应出流失到体外的水分。测量使用皮肤水分流失测试仪TewameterTM300(Courage&Khazaka)进行。TEWL值越大，表示流失到体外的水分越多，皮肤屏障功能越弱。测量结果如图2所示，编号B、D产品在短期有优异的减少经皮水分流失能力。

通过初步筛选，选定了C、K、B、D这四种具有优异的短期效果的产品。接下来，对这四种产品与普通的市售低分子HA、高分子HA的渗透性进行比较。

利用人体重构表皮模型(RHE Skinethic Laboratories，France)测定对上述四种产品与市售的低分子HA(市售产品1，Mw＝255kDa，PD＝1.35)、高分子HA(市售产品2，Mw＝1805kDa，PD＝1.5)的渗透性进行比较，用ELISA的方法测定皮肤模型中的成分，结果表明，在24小时内，上述四种产品在0.5％和1.0％的浓度时，渗透性优于同等浓度的市售产品1、2(表3)。

表3不同HA渗透性测试结果

进一步通过细胞试验证实上述四种产品的功效。

1)促进细胞新陈代谢测试

在体外测量这四种产品对细胞新陈代谢的影响。以HA处理细胞后细胞合成的蛋白量来评估细胞新陈代谢，合成蛋白含量越多，表示新陈代谢越强。

将1mL密度为5×10⁵个/mL的角化细胞(PC2011，Cat.No.PC3011，广东博溪生物科技有限公司)悬液接种至12孔板的孔中，在37℃，5％CO₂恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，BPH-9162)中培养24h，让细胞完全贴壁。用培养基(IMDM加入20mM的谷氨酰胺，10％胎牛血清)将这4种产品稀释成0.6％，以未加待测HA的稀释液为阴性对照。分别将1mL不同HA和对照稀释液加入相应的样品组和空白组孔板中，得到终浓度为0.3％的样品液后继续培养细胞。继续培养48h后，取上清进行蛋白合成检测。用比色法(福林酚反应)检测蛋白合成量。在碱性条件下铜离子与蛋白形成螯合物，催化酪氨酸及色氨酸残基氧化，生成蓝色复合物，颜色的强度代表蛋白浓度。结果以蛋白mg/ml表示，示于表4中。

表4不同HA促进细胞新陈代谢测试结果

结果表明产品C、D、K有优异的促进细胞新陈代谢的作用。

2)受损细胞修复测试

在体外测量这四种产品对细胞的抗损伤作用。将10μL密度为5×10⁵个/mL的成纤维细胞(PC2031，Cat.No.PC3031，广东博溪生物科技有限公司)接种在96孔板的孔中，在37℃，5％CO₂恒温培养箱(SANYO，MCO-15AC)中培养，培养基为IMDM加入20mM的谷氨酰胺，并含有10％胎牛血清，培养24h。在新鲜培养基中同时加入1.6mM双氧水与2％的待测HA作为实验组，单独加入1.6mM双氧水作为阳性对照，未处理细胞作为阴性对照，各取10μL样品液及阳性和阴性对照液加入相应样品组和对照组孔板的培养液中(此时样品终浓度为1％)，继续培养24h，然后每孔加入20μL MTT(上海麦克林生化科技有限公司，C10069452)，培养4h后，弃培养基，加入150μL DMSO(天津市大茂化学试剂厂，20170301)，在酶标仪(Thermo，MULTISKAN GO)490nm波长下检测吸光度值。细胞活力以百分数表示。实验重复测试3遍取平均值。结果示于表5中。

表5不同HA对受损细胞修复测试结果

结果表明产品C、D、K有优异的修复受损细胞的作用。

3)弹性蛋白合成测试

在体外测量这四种产品对弹性蛋白合成的影响。用染料结合定量的方法测定弹性蛋白含量，染料结合到哺乳动物弹性蛋白的碱性和非极性氨基酸序列上，可分析生物原料中提取的弹性蛋白含量。所用的染料是5,10,15,20-四苯基-23,23-卟吩四磺酸盐(TPPS)，该染料可用于测量三种形式弹性蛋白：1)可溶性重组弹力蛋白；2)山黧豆素型弹力蛋白；3)不溶性弹力蛋白，溶解弹性多肽以后的成分，[α-弹性蛋白；κ-弹性蛋白]。

将1mL密度为1.5×10⁶个/mL的成纤维细胞(PC2031，Cat.No.PC3031，广东博溪生物科技有限公司)悬液接种在12孔板的孔中，在37℃，5％CO₂恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，BPH-9162)中培养24h。用培养基(IMDM加入20mM的谷氨酰胺，10％胎牛血清)将这4种产品稀释成2％，空白对照组加入等体积的完全培养基。分别将1mL不同HA和对照稀释液加入相应的样品组和空白组孔板中，得到终浓度为1％的样品液后继续培养细胞。继续培养24h，然后取细胞上清，用弹力蛋白试剂盒(CMS50691.1，上海极威生物科技有限公司)检测弹性蛋白。结果示于表6。

表6不同HA对弹性蛋白合成测试结果

结果表明产品C、D有优异的促进弹性蛋白合成的作用。

经过上述筛选及验证，我们初步选定了产品C(Mw＝867kDa，Mn＝97.8kDa，Mv＝482kDa，PD＝8.86，1％水溶液黏度为730mPa.s)、D(Mw＝1012kDa，Mn＝98.2kDa，Mv＝540kDa，PD＝10.3，1％水溶液黏度为910mPa.s)，分别将其定名为cube3瞬华、difference昭华，色谱图分别如图3-4所示。将C、D的透明质酸以0.5w/w％的浓度加入空白对照霜剂，得到产品1-2。

效果例1：产品1体内功效评价

短期角质层水分含量和经皮水分流失

采用与初步筛选中相同的方法，对施用产品1后短期角质层水分含量以及经皮水分流失进行评价。结果如图5-6所示，可以看出，产品1在30分钟和120分钟内能显著改善角质层水分含量。产品1在施用30分钟后能显著减少经皮水分流失，在120分钟后效果更显著。

皮肤弹性、光滑度、皱纹数目和皱纹深度测试

选择30-50岁的10名健康女性作为受试者，对施用本发明产品的效果进行评价。在21±1℃、50±5％湿度下进行研究。在面部选择测试区域和对照区域(各3cm×3cm)。要求受试者们在进行测量之前至少8小时不要洗脸，并且不要在测试所涉及的区域涂敷任何产品。在研究开始时和使用产品后0.5小时(T0.5)，2小时(T2)和4小时(T4)对测试区域及对照区域的皮肤弹性、光滑度、皱纹数目进行评估。每次测试中产品和空白对照霜剂的用量保持一致。

皮肤弹性测定使用的仪器为Cutometer dual MPA580，方法为仪器法。

皮肤光滑度测定使用的仪器为Visioscan，方法为仪器法，用SESm(srufaceevaluation of smoothness)数值进行图像光滑度分析。

皮肤皱纹数目测试使用Visioscan，方法为仪器法。

结果如图7-9所示。使用产品1能够显著提高皮肤弹性和光滑度，并减少皱纹的数目。

专业医生评分

选择30-50岁的10名健康女性作为受试者，对施用本发明产品的效果进行评价。在21±1℃，湿度50±5％中进行研究。分别在面部选择测试区域和对照区域(各3cm×3cm)。要求受试者们不要洗脸，并且在进行测量之前至少8小时不要在测试所涉及的区域涂敷产品。在研究开始时和使用产品后30min(T0.5)、2h(T2)和4h(T4)，由同一名专业皮肤医生对受试者的皮肤状况进行评分，1-4分的得分对应如下情况：

分数1：没有提拉作用：皮肤放松，可见到细纹；

分数2：有轻微的提拉作用：皮肤放松，可见到的细纹减少；

分数3：有中度的提拉作用：皮肤放松，可见到的细纹明显减少；

分数4：有优异的提拉作用：皮肤提起，看不到细纹。

结果如图10所示，与对照相比，产品1对皮肤具有提拉作用。

弹性蛋白测定

采用与初步筛选相同的方法，在体外测量cube3瞬华对弹性蛋白合成的影响。结果如表7所示，cube3瞬华具有优异的促进弹性蛋白合成的作用。

表7

效果例2：产品2功效评价

长期角质层水分含量

选择30-50岁的20名健康女性作为受试者，对施用本发明产品后皮肤的长期角质层水分含量进行评价。在21±1℃，湿度50±5％中进行研究。分别在面部选择测试区域和对照区域(3cm×3cm涂覆面积)。要求受试者在进行测量之前至少1天不要在测试所涉及的区域涂敷产品。每天在测试区域和对照区域涂覆一次，在研究开始时、使用各测试样品15天、30天和60天后对测试区域及对照区域短期角质层水分含量进行评估。评估采用与初步筛选相同的方法进行。每次测试中产品和空白对照霜剂的用量保持一致。

结果如图11所示。可以看出，在施用产品2后15天能显著改善角质层水分含量。

皮肤弹性、光滑度、皱纹数目和皱纹深度、皮肤鳞屑测试

选择30-50岁的20名健康女性作为受试者，对施用本发明产品的效果进行评价。在21±1℃，湿度50±5％中进行研究。分别在面部选择(每一产品3cm×3cm涂覆面积)的测试区域和对照区域。要求受试者在进行测量之前至少1天不要在测试所涉及的区域涂敷产品。每天在测试区域和对照区域涂覆一次，在研究开始时、使用各测试样品15天、30天和60天后对测试区域及对照区域的皮肤弹性、光滑度、皱纹数目和皱纹深度和皮肤鳞屑进行评估。皮肤弹性、光滑度、皱纹数目和皱纹深度的评估采用与效果例1相同的方法进行。每次测试中产品和空白对照霜剂的用量保持一致。

皮肤鳞屑的评估采用仪器法进行评估，利用Visioscan分析表面鳞屑SESc(surface evaluation of scaliness)。该方法的原理是：通过一个均匀环形的紫外光(UVA)照明光源和一个黑白的高分辨率CCD摄像头组成的皮肤镜对皮肤表面进行图像拍摄，图像被传输到主机中进行数字化处理，主机通过USB线与PC机相连接将皮肤图像输入软件中进行分析。图像是以0-255范围的灰度值来显示的，皱纹在图相中显示为暗黑色，皮肤剥落的角质层显示为亮白色，软件可以分析出皮肤表面的各种参数。通过这种独特的高分辨率紫外光拍摄***直接拍摄活性皮肤表面，分析皮肤表面形态、皮肤粗糙度和干燥程度，是化妆品功效测试中的一种操作简单、经济、准确的方法。也可应用皮肤药品功效测试，皮肤科医生的客观临床诊断。

结果如图12-17所示。施用产品2能够显著提高皮肤弹性和光滑度，并减少皱纹的数目和深度。此外，产品2能够显著减少皮肤脱屑现象。

专业医生评分

选择30-50岁的20名健康女性作为受试者，根据与效果例1类似的方法，由同一名专业皮肤医生对施用产品2后15天、30天和60天的效果进行评估。得分如图18A-图18C所示。与空白对照相比，皮肤医生确认含有0.5％本发明HA的膏霜有肉眼可见的明显平滑、减少皱纹、紧致的作用。

受损细胞修复测试

采用与初步筛选相同的方法，在体外测量difference昭华对细胞的抗损伤作用。结果如表8所示，difference昭华具有优异的修复受损细胞的作用。

表8

综上所述，本发明制备的HA能够短期和长期地改善角质层的水分含量，能够显著提高皮肤弹性和光滑度，并且减少皱纹的数目和深度，还能显著减少皮肤脱屑现象。并且通过体外细胞实验，证实本发明制备的HA还具有优异的促进弹性蛋白合成以及修复受损细胞的作用。

Claims (8)

1.一种透明质酸，所述透明质酸具有5kDa-3000kDa的重均分子量、5kDa-3000kDa的数均分子量、5kDa-3000kDa的粘均分子量，并具有7-15的多分散系数。

2.如权利要求1所述的透明质酸，所述透明质酸具有30kDa-1000kDa的重均分子量、20kDa-150kDa的数均分子量以及30kDa-600kDa的粘均分子量。

3.如权利要求2所述的透明质酸，所述透明质酸的多分散系数为8-12。

4.如权利要求3所述的透明质酸，所述透明质酸的多分散系数为8.86。

5.如权利要求3所述的透明质酸，所述透明质酸的多分散系数为10.3。

6.如权利要求1-5中任一项所述的透明质酸，所述透明质酸的1％水溶液黏度为700mPa.s-1000mPa.s。

7.含有如权利要求1-6中任一项所述的透明质酸的化妆品组合物。

8.如权利要求1-6中任一项所述的透明质酸在制造化妆品方面的用途。