CN108976284B - 含Gly-Pro-Arg-Pro的五肽修饰的华法林,其合成,活性和应用 - Google Patents

含Gly-Pro-Arg-Pro的五肽修饰的华法林,其合成,活性和应用 Download PDF

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Abstract

含Gly‑Pro‑Arg‑Pro的五肽修饰的华法林,其合成,活性和应用，本发明公开了下式的华法林‑4‑O‑乙酰‑Gly‑Pro‑Arg‑Pro‑AA(式中AA为Asp残基,Ile残基,Leu残基,Phe残基,Tyr残基和Val残基),公开了它们的制备方法,公开了它们的抗静脉血栓活性，因而本发明公开了它们在制备抗静脉血栓药物中的应用。
Figure DDA0001309830580000011

Description

含Gly-Pro-Arg-Pro的五肽修饰的华法林,其合成,活性和 应用
技术领域
本发明涉及华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA,涉及它们的制备方法,涉及它们的抗静脉血栓活性，因而本发明涉及它们在制备抗静脉血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
静脉血栓症已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。静脉血栓症主要包括深静脉血栓和肺栓塞。深静脉血栓和肺栓塞发病的患者数不仅超过了心肌梗塞和中风发病的总人数，而且比乳腺癌和艾滋病所引起死亡的总人数高。由于静脉血栓症的发病率随年龄增长呈指数态增加，所以对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人口基数考虑进去，对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，静脉血栓症的预防及治疗一直是医药领域所关注的重点。虽然华法林作为代表药物于1941年被用于临床实践，但是华法林的安全窗口窄。剂量不足会导致肺栓塞，剂量过高有致命性出血的风险。过去的50多年对华法林进行了大量结构改造，却都没有能够得到抗静脉血栓活性满意的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰华法林结构的目标是扩大华法林的安全窗口。使它们在低剂量下显示满意的抗静脉血栓活性避免肺栓塞风险，使它们的高剂量也仍然低于华法林的常规剂量避免出血的风险。经过5年探索，发明人发现华法林的4位用乙酰Gly-Pro-Arg-Pro-AA修饰(AA为Asp残基,Ile残基,Leu残基,Phe残基,Tyr残基和Val残基)生成的华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA在0.1μmol/kg剂量下具有优秀的抗静脉血栓活性。这个剂量比华法林的剂量4.87μmol/kg低48.7倍，也就是说它们的安全窗口比华法林的安全窗口大48.7倍。可见，本发明具有显著的技术进步。根据这个发现，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA(式中AA为Asp残基,Ile残基,Leu残基,Phe残基,Tyr残基和Val残基)。
Figure BDA0001309830560000011
本发明的第二个内容是提供华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA(式中AA为Asp残基,Ile残基,Leu残基,Phe残基,Tyr残基和Val残基)的制备方法，该方法包括：
1)合成华法林-4-O-乙酸苄酯；
2)合成华法林-4-O-乙酸；
3)以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成Gly-Pro-OBzl；
4)以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro；
5)以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl,Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl,Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl,Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl,Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl和Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl；
6)以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl,华法林-4-O-乙酰-Gly-ProArg(NO2)-Pro-Ile-OBzl,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl和华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl；
7)氢解脱保护基合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Asp,华法林-4-O-乙酰-Gly-ProArg-Pro-Ile,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Leu,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Phe,华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Tyr和华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Val。
本发明的第三个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA(式中AA为Asp残基,Ile残基,Leu残基,Phe残基,Tyr残基和Val残基)的抗静脉血栓活性。
附图说明
图1华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA的合成路线.(i)溴-2-乙酸苄酯,丙酮,K2CO3,45℃；(ii)CH3OH,Pd/C,H2；(iii)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并***(HOBt),N-甲基吗啉(NMM),四氢呋喃(THF)；(iv)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N)；5a和6a中AA为Asp残基；5b和6b中AA为Ile残基；5c和6c中AA为Leu残基；5d和6d中AA为Phe残基；5e和6e中AA为Tyr残基；5f和6f中AA为Val残基。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备华法林-4-O-乙酸苄酯
将26.48g(80.00mmol)华法林与400mL丙酮于45℃搅拌至华法林溶解。往得到的溶液中加14mL(88mmol)溴乙酸苄酯，继续于45℃搅拌96h，薄层层析(TLC，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)显示反应完成。反应液过滤除，滤液减压浓缩，得到的淡黄色油状物用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝8/1)，得到19.77g(54％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):457[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝7.89(dd,J1＝3.0Hz,J2＝9.0Hz,1H),7.63(dt,J1＝3.0Hz,J2＝9.0Hz,1H),7.43～7.31(m,9H),7.24(t,J＝9.0Hz,2H),7.15(tt,J＝9.0Hz,1H),5.26(s,2H),5.61(s,1H),5.02(d,J＝15.0Hz,1H),4.85(d,J＝15.0Hz,1H),4.97(t,J＝9.0Hz,1H),3.45(dq,J1＝9.0Hz,J2＝18.0Hz,2H),2.11(s,3H)。
实施例2制备华法林-4-O-乙酸
将19.77g(43.36mmol)华法林-4-O-乙酸苄酯溶于150mL四氢呋喃，然后与4.94g钯碳(Pd/C)悬浮。往里通氢气72h。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)显示反应完全。滤去Pd/C，滤液减压浓缩，得到15.58g(98％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):367[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.86(s,1H),7.90(d,J＝6.0Hz,1H),7.63(t,J＝6.0Hz,1H),7.43～7.34(m,4H),7.27(t,J＝9.0Hz,2H),7.17(t,J＝9.0Hz,1H),4.99(t,J＝9.0Hz,1H),4.75(dd,J1＝15.0Hz,J2＝30.0Hz,2H),3.54～3.47(m,2H),2.14(s,3H)。
实施例3制备Boc-Gly-Pro-OBzl
将7.730g(44.15mmol)Boc-Gly用100mL无水四氢呋喃溶解，0℃往该溶液中加5.940g(44.00mmol)1-羟基苯并***(HOBt)及9.888g(48.00mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，0℃搅拌30min并往里加9.665g(40.00mmol)HCl·Pro-OBzl。反应液用N-甲基吗啉调节pH为9，室温搅拌17h，TLC(二氯甲烷/甲醇＝20/1)显示反应完成。滤除反应液中的不溶物，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，滤去无色固体，滤液分别用饱和NaHCO3溶液洗(50mL×3)，饱和NaCl溶液洗(50mL×3)，5％KHSO4溶液洗(50mL×3)，饱和NaCl溶液洗(50mL×3)，饱和NaHCO3溶液洗(50mL×3)，饱和NaCl溶液洗(50mL×3)，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩，得到的淡黄色固体用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到13.42g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):363[M+H]+。
实施例4制备HCl·Gly-Pro-OBzl
将13.42g(37.05mmol)Boc-Gly-Pro-OBzl与52mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌5h。之后，反应混合物减压浓缩。残留物用50mL无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩。该操作重复三次。残留物用无水***充分洗，得到10.85g(98％)标题化合物，为无色固体。
实施例5制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-OBzl
按照实施例3的方法，从15.58g(42.57mmol)华法林-4-O-乙酸和11.56g(38.70mmol)HCl·Pro-OBzl得到21.07g(89％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):611[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.50(dd,J1＝5.7Hz,J2＝11.4Hz,1H),7.91(dt,J1＝1.5Hz,J2＝8.7Hz,1H),7.64(td,J1＝1.5Hz,J2＝6.0Hz,1H),7.43(d,J＝7.5Hz,4H),7.34(m,6H),7.29(t,J＝3.3Hz,2H),7.19(m,1H),5.15(m,2H),4.92(t,J＝7.5Hz,1H),4.58(t,J＝3.9Hz,2H),4.44(dd,J1＝3.9Hz,J2＝9.0Hz,1H),4.10(m,2H),3.61(m,2H),3.47(d,J＝7.2Hz,2H),2.22(m,1H),2.14(s,3H),1.99～1.76(m,3H)。
实施例6制备Boc-Pro-Asp(OBzl)-OBzl
按照实施例3的方法，从1.659g(7.716mmol)Boc-Pro和2.443g(6.988mmol)HCl·Asp(OBzl)-OBzl得到3.560g(100％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):511[M+H]+。
实施例7制备HCl·Pro-Asp(OBzl)-OBzl
按照实施例4的方法，从3.560g(6.979mmol)Boc-Pro-Asp(OBzl)-OBzl得到3.112g(100％)标题化合物，为黄色油状物。
实施例8制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl
按照实施例3的方法，从2.458g(7.705mmol)Boc-Arg(NO2)和3.112g(6.968mmol)HCl·Pro-Asp(OBzl)-OBzl得到2.338g(47％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.36(s,5H),7.35(s,5H),6.93(d,J＝7.8Hz,1H),5.13～5.04(m,4H),4.73(dd,J1＝6.6Hz,J2＝14.1Hz,1H),4.34(m,1H),4.15(m,1H),3.56(m,2H),3.12(s,2H),2.84(t,J＝7.2Hz,2H),1.98～1.46(m,8H),1.37(s,9H)。
实施例9制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl
按照实施例4的方法，从1.774g(2.495mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl得到1.616g(100％)标题化合物，为淡黄色油状物。
实施例10制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl(5a)
按照实施例3的方法，从1.415g(2.720mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.616g(2.496mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl得到1.611g(58％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.47～8.39(m,3H),8.19(d,J＝7.2Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.35～7.34(m,13H),7.26(t,J＝7.5Hz,2H),7.17(d,J＝6.9Hz,1H),5.12～5.03(m,4H),4.90(t,J＝7.2Hz,1H),4.70(m,1H),4.57(s,2H),4.51～4.32(m,3H),4.03(m,2H),3.64～3.49(m,4H),3.46(d,J＝7.2Hz,2H),3.12(s,2H),2.85(m,2H),2.14(s,3H),2.09～1.55(m,12H)。
实施例11制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Asp(6a)
按照实施例2的方法，从0.360g(0.323mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl(5a)得到0.126g(44％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):889[M+H]+,911[M+Na]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.42(m,1H),8.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.8Hz,1H),7.86(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(t,J＝7.2Hz,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(d,J＝7.5Hz,2H),7.26(t,J＝7.2Hz,4H),7.17(m,2H),4.90(t,J＝7.5Hz,1H),4.58(s,2H),4.46～4.35(m,3H),4.16～4.03(m,3H),3.63～3.51(m,4H),3.46(d,J＝7.2Hz,2H),3.14(m,2H),2.39(m,2H),2.14(s,3H),2.08～1.59(m,12H)。
实施例12制备Boc-Pro-Ile-OBzl
按照实施例3的方法，从1.420g(6.605mmol)Boc-Pro和1.817g(4.621mmol)Tos·Ile-OBzl得到1.921g(99％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):419[M+H]+。
实施例13制备HCl·Pro-Ile-OBzl
按照实施例4的方法，从1.921g(4.594mmol)Boc-Pro-Ile-OBzl得到1.529g(94％)标题化合物，为黄色油状物。
实施例14制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl
按照实施例3的方法，从2.094g(6.564mmol)Boc-Arg(NO2)和1.529g(4.311mmol)HCl·Pro-Ile-OBzl得到1.222g(46％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.18(d,J＝8.1Hz,1H),7.36(s,5H),6.98(d,J＝7.8Hz,1H),5.11(dd,J1＝12.3Hz,J2＝26.7Hz,2H),4.43(dd,J1＝3.3Hz,J2＝8.1Hz,1H),4.20(t,J＝6.9Hz,1H),4.12(m,1H),3.62～3.52(m,2H),3.10(s,2H),2.01～1.43(m,9H),1.36(s,9H),1.33～1.12(m,2H),0.83～0.78(m,6H)。
实施例15制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl
按照实施例4的方法，从1.222g(1.934mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl得到1.070g(100％)标题化合物，为无色固体。
实施例16制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl(5b)
按照实施例3的方法，从1.318g(2.534mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.070g(1.926mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl得到0.742g(38％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.48～8.44(m,2H),8.19(d,J＝4.5Hz,1H),8.16(d,J＝5.1Hz,1H),7.90(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.36(s,7H),7.26(t,J＝7.2Hz,2H),7.16(m,1H),5.11(dd,J1＝12.3Hz,J2＝26.1Hz,2H),4.90(t,J＝7.2Hz,1H),4.57(m,2H),4.52～4.38(m,3H),4.22(t,J＝5.7Hz,1H),4.06(m,2H),3.64～3.40(m,6H),3.13(s,2H),2.14(s,3H),2.00～1.55(m,13H),1.39(m,1H),1.21(m,1H),0.84～0.78(m,6H)。
实施例17制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Ile(6b)
按照实施例2的方法，从0.383g(0.375mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl(5b)得到0.117g(35％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):887[M+H]+,925[M+K]+；1H-NMR(300MHz,D2O):δ/ppm＝7.48～7.15(m,9H),4.54(m,1H),4.35～4.30(m,3H),4.06(m,3H),3.91(d,J＝6.0Hz,1H),3.65～3.41(m,6H),3.00(m,2H),2.11(s,3H),1.90～1.55(m,12H),1.30(m,1H),1.01(m,1H),0.75(t,J＝6.6Hz,6H)。
实施例18制备Boc-Pro-Leu-OBzl
按照实施例3的方法，从1.420g(6.605mmol)Boc-Pro和1.820g(4.629mmol)Tos·Leu-OBzl得到1.834g(94％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):419[M+H]+。
实施例19制备HCl·Pro-Leu-OBzl
按照实施例4的方法，从1.834g(4.386mmol)Boc-Pro-Leu-OBzl得到1.555g(100％)标题化合物，为黄色油状物。
实施例20制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl
按照实施例3的方法，从2.103g(6.592mmol)Boc-Arg(NO2)和1.555g(4.384mmol)HCl·Pro-Leu-OBzl得到1.165g(43％)标题化合物，为无色固体.ESI-MS(m/e):620[M+H]+。
实施例21制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl
按照实施例4的方法，从1.165g(1.882mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl得到1.042g(100％)标题化合物，为无色固体。
实施例22制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl(5c)
按照实施例3的方法，从1.257g(2.416mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.042g(1.875mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl得到0.542g(28％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.48～8.44(m,2H),8.26(t,J＝7.2Hz,1H),8.18(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(s,7H),7.28(t,J＝7.8Hz,2H),7.19(m,1H),5.09(dd,J1＝12.3Hz,J2＝18.0Hz,2H),4.90(t,J＝7.5Hz,1H),4.57(m,2H),4.52～4.25(m,4H),4.05(m,2H),3.56～3.44(m,4H),3.46(d,J＝7.5Hz,2H),3.13(s,2H),2.14(s,3H),2.00～1.49(m,15H),0.88(d,J＝6.3Hz,3H),0.81(d,J＝6.3Hz,3H)。
实施例23制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Leu(6c)
按照实施例2的方法，从0.315g(0.308mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Leu-OBzl(5c)得到0.073g(27％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):887[M+H]+,925[M+K]+,1772[2M]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝9.88(m,1H),8.43(m,1H),8.25(d,J＝6.9Hz,1H),7.90(d,J＝7.2Hz,1H),7.64(t,J＝7.2Hz,1H),7.42～7.39(m,2H),7.36(d,J＝7.2Hz,2H),7.24(t,J＝7.2Hz,2H),7.19(m,2H),7.07(m,2H),4.89(m,1H),4.58(s,2H),4.51(m,1H),4.39(m,1H),4.19～4.03(m,3H),3.71～3.70(m,3H),3.56～3.45(m,2H),3.46(d,J＝6.9Hz,2H),3.10(s,2H),2.14(s,3H),2.04～1.24(m,15H),0.85(s,6H)。
实施例24制备Boc-Pro-Phe-OBzl
按照实施例3的方法，从1.423g(6.619mmol)Boc-Pro和1.748g(5.993mmol)HCl·Phe-OBzl得到2.612g(96％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):453[M+H]+。
实施例25制备HCl·Pro-Phe-OBzl
按照实施例4的方法，从2.612g(5.776mmol)Boc-Pro-Phe-OBzl得到2.245g(100％)标题化合物，为黄色油状物。
实施例26制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl
按照实施例3的方法，从2.108g(6.608mmol)Boc-Arg(NO2)和2.245g(5.776mmol)HCl·Pro-Phe-OBzl得到2.281g(61％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.33(d,J＝6.9Hz,1H),7.33(s,3H),7.26～7.23(m,7H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),5.05(s,2H),4.46(dd,J1＝7.2Hz,J2＝14.4Hz,1H),4.37(dd,J1＝3.3Hz,J2＝8.4Hz,1H),4.14(m,1H),3.54(m,2H),3.15(s,2H),2.99(d,J＝7.2Hz,2H),2.00～1.44(m,8H),1.36(s,9H)。
实施例27制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl
按照实施例4的方法，从1.430g(2.189mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl得到1.291g(100％)标题化合物，为无色固体。
实施例28制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl(5d)
按照实施例3的方法，从1.259g(2.420mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.291g(2.189mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl得到1.331g(58％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.45～8.43(m,2H),8.33(m,1H),8.14(dd,J1＝7.8Hz,J2＝14.4Hz,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,1H),7.44～7.28(m,6H),7.26～7.14(m,10H),5.03(s,2H),4.89(t,J＝7.5Hz,1H),4.58(m,2H),4.50～4.33(m,4H),4.08(m,2H),3.66～3.45(m,4H),3.46(d,J＝7.5Hz,2H),3.12(s,2H),2.95(d,J＝6.3Hz,2H),2.14(s,3H),2.00～1.54(m,12H)。
实施例29制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Phe(6d)
按照实施例2的方法，从0.390g(0.370mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl(5d)得到0.043g(13％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):921[M+H]+,958[M+K]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.32(m,1H),8.40(m,1H),8.21(d,J＝6.9Hz,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(t,J＝8.1Hz,1H),7.44～7.34(m,4H),7.28～7.12(m,5H),7.04(m,3H),4.88(m,1H),4.57(s,2H),4.46(m,1H),4.38(m,1H),4.24～4.00(m,3H),3.84(m,1H),3.57～3.71(m,4H),3.38(d,J＝7.2Hz,2H),3.18～2.97(m,4H),2.14(s,2H),2.03～1.24(m,13H)。
实施例30制备Boc-Pro-Tyr-OBzl
按照实施例3的方法，从2.363g(10.99mmol)Boc-Pro和4.440g(10.02mmol)Tos·Tyr-OBzl得到4.592g(98％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):469[M+H]+。
实施例31制备HCl·Pro-Tyr-OBzl
按照实施例4的方法，从4.592g(9.808mmol)Boc-Pro-Tyr-OBzl得到3.902g(98％)标题化合物，为黄色油状物。
实施例32制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl
按照实施例3的方法，从3.504g(10.98mmol)Boc-Arg(NO2)和3.902g(9.642mmol)HCl·Pro-Tyr-OBzl得到2.549g(40％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝9.25(s,1H),8.50(s,1H),8.27(d,J＝7.2Hz,1H),7.37～7.32(m,3H),7.27～7.21(m,2H),7.00(d,J＝8.4Hz,2H),6.94(d,J＝7.8Hz,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),5.02(s,2H),4.42～4.35(m,2H),4.14(m,1H),3.56(m,2H),3.10(m,2H),2.86(d,J＝7.2Hz,2H),2.01～1.44(m,8H),1.36(s,9H)。
实施例33制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl
按照实施例4的方法，从1.666g(2.490mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl得到1.481g(98％)标题化合物，为无色固体。
实施例34制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl(5e)
按照实施例3的方法，从1.426g(2.741mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.481g(2.445mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl得到1.788g(68％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝9.26(s,1H),8.46～8.43(m,2H),8.26(d,J＝7.5Hz,1H),8.17(d,J1＝7.5Hz,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝8.4Hz,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(s,5H),7.29～7.22(m,4H),7.16(t,J＝7.2Hz,1H),7.00(d,J＝8.4Hz,2H),6.64(d,J＝8.1Hz,2H),5.02(s,2H),4.90(t,J＝7.5Hz,1H),4.58(s,2H),4.51～4.32(m,4H),4.05(m,2H),3.58～3.44(m,4H),3.46(d,J＝7.5Hz,2H),3.13(s,2H),2.86(d,J＝7.2Hz,2H),2.14(s,3H),1.98～1.54(m,12H)。
实施例35制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Tyr(6e)
按照实施例2的方法，从0.360g(0.336mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl(5e)得到0.073g(23％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):937[M+H]+,960[M+Na]+,974[M+K]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝9.36(d,J＝17.7Hz,1H),9.10(s,1H),8.43(d,J＝5.1Hz,1H),8.22(d,J＝6.6Hz,1H),7.90(d,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝8.1Hz,1H),7.43(d,J＝8.7Hz,2H),7.36(d,J＝7.2Hz,2H),7.26(t,J＝7.2Hz,2H),7.18(d,J＝7.2Hz,1H),7.00(d,J＝4.2Hz,1H),6.81(d,J＝7.8Hz,2H),6.57(d,J＝7.5Hz,2H),4.90(t,J＝7.5Hz,1H),4.57(s,2H),4.52(m,1H),4.38(m,1H),4.20(t,J＝9.0Hz,1H),4.05(m,2H),3.79(m,1H),3.54～3.45(m,4H),3.46(d,J＝7.5Hz,2H),3.01(s,2H),2.97(d,J＝12.9Hz,1H),2.87(d,J＝12.9Hz,1H),2.14(s,3H),2.02～1.41(m,12H)。
实施例36制备Boc-Pro-Val-OBzl
按照实施例3的方法，从1.418g(6.595mmol)Boc-Pro和2.275g(6.000mmol)Tos·Val-OBzl得到2.311g(95％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e):453[M+H]+。
实施例37制备HCl·Pro-Val-OBzl
按照实施例4的方法，从2.311g(5.718mmol)Boc-Pro-Val-OBzl得到1.948g(100％)标题化合物，为淡黄色油状物。
实施例38制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl
按照实施例3的方法，从2.003g(6.279mmol)Boc-Arg(NO2)和1.948g(5.718mmol)HCl·Pro-Val-OBzl得到2.774g(80％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.44(s,1H),8.16(d,J＝8.1Hz,1H),7.36(s,5H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),5.12(dd,J1＝12.3Hz,J2＝24.3Hz,2H),4.46(dd,J1＝3.3Hz,J2＝7.8Hz,1H),4.17(m,1H),4.16(d,J＝7.2Hz,1H),3.58(m,2H),3.11(s,2H),2.08～1.44(m,9H),1.36(s,9H),0.86(dd,J1＝3.0Hz,J2＝6.6Hz,6H)。
实施例39制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl
按照实施例4的方法，从1.701g(2.811mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl得到淡黄色固体产物1.500g(99％)标题化合物，为淡黄色固体。
实施例40制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl(5f)
按照实施例3的方法，从1.420g(2.730mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro和1.354g(2.500mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl得到0.877g(35％)标题化合物，为无色固体.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.48(m,2H),8.18(m,2H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.36(s,7H),7.26(t,J＝7.2Hz,2H),7.16(d,J＝6.9Hz,1H),5.11(dd,J1＝12.3Hz,J2＝24.6Hz,2H),4.90(t,J＝7.2Hz,1H),4.57(m,2H),4.52～4.39(m,3H),4.18(m,1H),4.04(m,2H),3.58～3.47(m,4H),3.46(d,J＝7.2Hz,2H),3.13(s,2H),2.14(s,3H),2.05～1.57(m,13H),0.86(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例41制备华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Val(6f)
按照实施例2的方法，从0.380g(0.377mmol)华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl(5f)得到0.121g(37％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):873[M+H]+,895[M+Na]+,910[M+K]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.41(m,1H),8.20(d,J＝7.2Hz,1H),7.90(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(t,J＝7.2Hz,1H),7.45～7.35(m,4H),7.26(t,J＝7.2Hz,2H),7.17(m,1H),7.04(d,J＝6.3Hz,2H),4.91(m,1H),4.53(d,J＝3.6Hz,2H),4.55～4.52(m,2H),4.39(dd,J1＝3.0Hz,J2＝8.4Hz,1H),4.25～4.14(m,1H),4.08～4.03(m,2H),3.74～3.48(m,4H),3.44(d,J＝7.2Hz,2H),3.10(s,2H),2.14(s,3H),2.06～1.63(m,13H),0.80(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例42评价6a-f的抗静脉血栓活性
试剂20％乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)生理盐水溶液为麻醉剂，生理盐水(石家庄四药有限公司)，华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
动物SD品系大鼠，雄性，300±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
模型大鼠下腔静脉结扎模型。
给药剂量本发明的化合物6a-f的口服剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林的口服剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
实验操作大鼠在手术前适应环境并禁食一天，按上面的剂量给大鼠灌胃。给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药使大鼠麻醉。将麻醉大鼠固定于大鼠固定板上，腹部备皮且消毒，然后沿腹白线打开腹腔，上至露出肝脏一角，开口约4cm长。移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围***，暴露下腔静脉及其分支，在左肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官移回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。术后,大鼠于25℃循环4小时。打开腹腔后，逐个分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处取出2cm下腔静脉，从中取出血栓。血栓称重并用t检验统计结果。手术以每组四只交替进行。实验数据见表1。
表1化合物6a-f对下腔静脉结扎大鼠静脉血栓重量的影响
Figure BDA0001309830560000111
a)与生理盐水比p<0.05,与华法林比p>0.05；b)与生理盐水比p<0.01,与华法林比p>0.05；c)与生理盐水比p<0.01,与华法林比p<0.05；n＝7
表1的结果表明，在0.1μmol/kg剂量下化合物6a-f抑制下腔静脉结扎大鼠静脉血栓的活性或与0.1μmol/kg剂量下华法林的活性相当或比0.1μmol/kg剂量下华法林的活性强。可见，化合物6a-f抑制下腔静脉结扎大鼠静脉血栓的活性至少是华法林活性的48.7倍。本发明具有意想不到的技术效果。

Claims (3)

1.下式的华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中AA为Asp残基、Ile残基、Leu残基、Phe残基、Tyr残基或Val残基。
2.制备权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA的方法，该方法包括：
1) 合成华法林-4-O-乙酸苄酯；
2) 合成华法林-4-O-乙酸；
3）以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成Gly-Pro-OBzl；
4) 以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro；
5) 以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl, Arg(NO2)-Pro-Ile-OBzl, Arg(NO2)-Pro- Leu-OBzl, Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl, Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl和Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl;
6) 以二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并***为催化剂，采用液相法合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro- Arg(NO2)-Pro-Asp(OBzl)-OBzl,华法林-4- O-乙酰- Gly-ProArg(NO2)-Pro-Ile-OBzl, 华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Leu- OBzl, 华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Phe-OBzl,华法林-4-O-乙酰-Gly- Pro-Arg(NO2)-Pro-Tyr-OBzl 和华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg(NO2)-Pro-Val-OBzl；
7) 氢解脱保护基合成华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Asp,华法林-4-O-乙酰-Gly-ProArg-Pro-Ile, 华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Leu, 华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Phe, 华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Tyr和华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-Val。
3.权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA在制备抗静脉血栓药物中的应用。
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