CN108970403A - 一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构和方法，该结构包括基底电极层以及位于其上表面的绝缘层，基底电极层上设有相互连通的制备结构、分选结构，制备结构包括位于绝缘层内的制备腔室以及位于制备腔室上方的上层电极，分选结构包括用于分选脂质体的分选微通道，制备腔室与分选微通道通过过渡通道连通，分选微通道位于绝缘层内，基底电极层上设有位于分选微通道侧边的分选电极。本发明通过电极施加电信号并结合压电陶瓷晶片发出超声信号，高效的制备巨型脂质体，制备重复性好，通过介电电泳分选不同粒径的巨型脂质体，制备效率和分选效率均得到显著提高，不易破碎、分选得到较多粒径相近的巨型脂质体。

Description

一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构和方法

技术领域

本发明涉及脂质体制备及分选结构领域，特别是涉及一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构和方法。

背景技术

脂质体是由一层或者多层脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡。其具有双亲性、生物相容性、具有类细胞膜结构等特性，近年来已应用于医药、美容、食品和生物化学等多个研究领域。按照脂质体的粒径大小，可将脂质体分为：小型脂质体(直径0.02μm-0.2μm)、大型脂质体(直径0.2μm-1μm)、巨型脂质体(直径>1μm)。其中，巨型脂质体不仅具有前述的脂质体常见特性，更具有一些独特的性质，如：具有微米级尺寸，易于操控且在光学显微镜下易于观察，尺寸可达细胞尺寸，膜结构类似细胞膜等。因而，巨型脂质体具有更为广阔的应用，越来越受到人们的重视。其可以包封大分子药物，运载蛋白质、DNA、质粒、微球等物质，用于基因转移、药物传送；可作为细胞模型，模拟细胞环境，进行蛋白质表达或者细胞功能等方面的研究；也可作为膜模型来研究其物理性质，如机械性能和电气性质；还可以用于研究分子与膜的相互作用，以及膜穿孔、融合的过程和机制；也能作为生化反应器，提供生化反应的超小反应体积，观察在其包裹体积内的快速生化反应。

但是巨型脂质体带来更多应用价值的同时，由于其尺寸巨大、稳定性差、成型难，也为其制备和后续的应用带来较多困难。目前提出的巨型脂质体制备方法主要包括温和水合法、溶剂蒸发法、微流控注入法和电形成法。

温和水合法：对传统脂质体制备方法中的“薄膜分散法”的改进，将脂质溶于有机相，形成脂质溶液；取适量脂质溶液于容器中，完全蒸发掉有机溶剂之后形成脂质膜；添加水相进行水合，在整个水合过程中尽量避免一切外界扰动，一定时间之后，在容器内形成巨型脂质体。

溶剂蒸发法：对传统脂质体制备方法中的“两相分散法”的改进，将脂质溶于有机相，形成脂质溶液，再添加水相，使有机相与水相充分接触，然后，减压将有机溶剂蒸发，在蒸发过程中，脂质材料在水相中形成巨型脂质体。

微流控注入法：该方法是由传统的溶剂注入法改进而来，该方法采用了近年提出的微流控芯片，2003年由Tan(Yung-Chi eh Tan,Kenneth Longmuir,Abraham P.Lee,Microfluidic liposome generation from monodisperse droplet emulsion-towardsthe realization of artificial cells.2003,summer bioengineering conference.)提出。首先，将水相注入溶解有脂质的特定有机溶剂中，通过芯片结构逐粒形成一定粒径的油包水液滴；随后，将油包水液滴取出进行各种后续处理，得到巨型脂质体，如：通过注入到可以去除有机溶剂的液相中，去除有机溶剂，使得脂质分离出来，重组形成巨型脂质体(TanYC,Hettiarachchi K,Siu M,et al.Controlled microfluidic encapsulation ofcells,proteins,and microbeads in lipid vesicles.Journal of the AmericanChemical Society,2006,128:5656-5658.)；或者通过降温到-10℃，使得液滴冻结后再将液滴表面替换为形成脂质双分子层的脂质混合物；之后，再通过旋转蒸发去除有机溶剂，再加入缓冲液用于脂质水合，最终形成巨型脂质体(Sugiura S,Kuroiwa T,Kagota T,etal.Novel method for obtaining homogeneous giant vesicles from a monodispersewater-in-oil emulsion prepared with a microfluidic device.Langmuir,2008,24:4581-4588.)。

电形成法：1986年Angelova等人首次提出利用电极施加电场制备巨型脂质体(Angelova MI,Dimitrov DS.Liposome electroformation.Faraday Discussions,1986,81:303-311.)，早期采用平行的铂金丝作为电极，将脂质溶液滴加于电极上，再蒸发形成脂质膜，添加水相的同时，通过施加电场，制备巨型脂质体。随后，电极逐渐改进，又提出了采用ITO玻璃平面电极、硅微孔阵列电极等。

但现有方法在制备及分选方面存在诸多问题，如：巨型脂质体粒径分布广、差异大、制备重复性差、制备效率低、包封物质的包封率低、存在有机溶剂残留等，巨型脂质体制备后需要再进行后处理，特别是包封物质的巨型脂质体，需要将巨型脂质体和未被包封的物质分开，采用传统纳米脂质体的加大了巨型脂质体应用的难度，增加了人力、物力的投入，而且现有后处理方式往往采用离心或者滤膜过滤，均存在巨型脂质体的分选效果差、易变形、易破碎、分选得到的巨型脂质体粒径均一性差等问题。这些问题都严重阻碍了巨型脂质体的应用。虽然这些制备方法在不断改进，但到目前为止，所有制备方法均存在各种缺陷，无法克服上述问题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于介电电泳的脂质体制备及分选结构和方法，用于解决现有技术中脂质体的制备、分选对脂质体造成影响、分选效率较低等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于介电电泳的脂质体制备及分选结构，包括基底电极层以及位于其上表面的绝缘层，所述基底电极层上设有相互连通的制备结构、分选结构，所述制备结构包括位于所述绝缘层内的制备腔室以及位于制备腔室上方的上层电极，所述分选结构包括用于分选脂质体的分选微通道，所述制备腔室与所述分选微通道通过过渡通道连通，所述分选微通道位于所述绝缘层内，所述基底电极层包括位于所述分选微通道侧边的分选电极。

在本发明的一些实施例中，所述制备结构还包括位于所述基底电极层下表面的下层压电陶瓷晶片、位于所述制备腔室上方的上层电极，所述基底电极层包括位于所述制备腔室底部的下层电极。

在本发明的一些实施例中，所述上层电极、下层电极电性连接至第一信号发生器，所述基底电极层还包括基底玻璃，所述下层电极位于该基底玻璃的上表面，所述上层电极的上表面设有上层玻璃，基底玻璃作为底部支撑结构，贯穿制备结构及分选结构的底部。

下层电极、上层电极、分选电极的材料具体可以为ITO。

在本发明的一些实施例中，所述下层压电陶瓷晶片通过控制电路电性连接至第一信号发生器。

在本发明的一些实施例中，所述过渡通道呈倾斜设置，其下端连通至所述制备腔室底部，其上端连通至所述分选结构。

在本发明的一些实施例中，所述过渡通道上设有可自由***或取出的挡料件。

在本发明的一些实施例中，所述制备腔室连通有进液通道，所述进液通道连通有注射泵。

在本发明的一些实施例中，所述分选结构还包括分选进样腔室，所述过渡通道的上端连通至所述分选进样腔室。分选进样腔室具体可以设置为圆形、方形等形状，以蓄积较多的流体，使得后续的分选可以连续进行，不会间断。

在本发明的一些实施例中，所述分选微通道的末端设有三个出口，分别连通至用于收集所需脂质体的第二收集腔室、用于收集其余物质的第一收集腔室、第三收集腔室。

在本发明的一些实施例中，还包括用于固定所述制备结构、分选结构的固定架。

本发明第二方面提供一种基于介电电泳的脂质体制备及分选方法，包括如下步骤：

1)脂质体的制备：向制备腔室内注入所需料液，蒸干有机溶剂后，注入去离子水或所需缓冲液，对制备腔室施加电信号，脂质膜膨胀至形成所需直径范围的脂质体后，停止施加电信号，通过压电陶瓷晶片对制备腔室施加超声信号，促使脂质膜封闭形成脂质体；

2)脂质体的分选：向制备腔室中注入新的去离子水或所需缓冲液，通过控制电路对下层压电陶瓷晶片施加谐振电信号，改变脂质体内外溶液的介电常数，同时使得脂质体进入分选微通道，对分选电极施加电信号，通过介电电泳分选得到所需脂质体，所需脂质体可以是所需粒径的巨型脂质体，也可以是包载有内容物的脂质体，包载的内容物可以为微球、核酸、蛋白等。

如上所述，本发明的一种基于介电电泳的脂质体制备及分选结构和方法，具有以下有益效果：本发明通过电极施加电信号并结合压电陶瓷晶片发出超声信号，高效制备脂质体，制备重复性好，通过介电电泳分选不同粒径的脂质体，或者包载内容物的脂质体和未包载的内容物，制备效率和分选效率均得到显著提高，不易破碎，分选得到较多粒径相近的脂质体。

附图说明

图1显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构整体结构示意图。

图2显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构的水平剖视结构示意图。

图3显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构的竖直剖视结构示意图。

图4显示为本发明实施例中制备结构制得的脂质体悬液在显微镜下的拍照图。

图5、图6显示为分选微通道中的脂质体悬液在显微镜下的拍照图。

图7显示为本发明实施例中第二收集腔室收集到的巨型脂质体在显微镜下的拍照图。

零件标号说明

1—第一信号发生器

2—第二信号发生器

3—芯片

4—注射泵

5—制备结构

6—分选结构

7—第一收集腔室

8—第二收集腔室

9—第三收集腔室

10—控制电路

11—基底电极层

12—进液通道

13—制备腔室

14—上层电极

15—下层压电陶瓷晶片

16—过渡通道

17—分选电极

18—分选微通道

19—第一微通道

20—第二微通道

21—第三微通道

22—挡料件

23—分选进样腔室

24—固定架

25—绝缘层

26—下层电极

27—基底玻璃

28—上层玻璃

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

图1显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构整体结构示意图，图2显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构的水平剖视结构示意图，图3显示为本发明实施例的脂质体制备及分选结构的竖直剖视结构示意图。本发明提供一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构，其具体为一芯片3，该芯片3包括基底电极层11以及设置在其上表面的绝缘层25，基底电极层11上设有相互连通的制备结构5、分选结构6，制备结构包括位于绝缘层25内的制备腔室13以及位于制备腔室13上方的上层电极14，上层电极14的上表面设有上层玻璃28，分选结构6包括用于分选脂质体的分选微通道18，制备腔室13与分选微通道18通过过渡通道16连通，分选微通道18位于绝缘层内，基底电极层11上设有位于分选微通道18单侧的分选电极17，正负电极沿流体流动方向交错排列在分选微通道18单侧。分选电极17的布置方式有多种，也可以根据需要将其布置在分选微通道18的两侧。

制备结构5还包括位于基底电极层11下表面的下层压电陶瓷晶片15，下层压电陶瓷晶片15通过控制电路10电性连接至第一信号发生器1，基底电极层11由基底玻璃27和其上覆盖的下电极层26构成，制备腔室13一侧的中部连通一进液通道12，进液通道12连通有注射泵4，制备腔室13的另外一侧连通有一过渡通道16，该过渡通道16的一侧连通至制备腔室13的底部，该过渡通道16的另一侧设有一U型开口，U型开口有助于脂质体悬液流入到右侧的分选进样腔室23，分选进样腔室23用于蓄积脂质体悬液，使其在分选微通道18中连续流动，U型开口正对分选进样腔室23，过渡通道16上设有可自由***或取出的挡料件22，不需要料液通过该过渡通道16时，挡料件22***过渡通道16中，起到阻挡料液通过的作用，挡料件22具体可以为梯形盖，梯形盖的***深度比U型口深，有效阻挡料液流通。

分选结构6包括一分选进样腔室23，用于收集制备部分的脂质体悬液，使其进入分选微通道，分选进样腔室23一侧连通至U型开口，另外一侧连通至分选微通道18，分选微通道18的末端设有三个出口，三个出口分别连通至第一微通道19、第二微通道20、第三微通道21，分选微通道18的三个出口分别连通至三个相应的收集腔室，包括第一收集腔室7、第二收集腔室8、第三收集腔室9。

在本发明的一些实施例中，绝缘层25的上表面为平整面，便于脂质体的制备。

在本发明的一些实施例中，上层电极14、下电极层26均电性连接至第一信号发生器1，下层压电陶瓷晶片15通过控制电路10电性连接至第一信号发生器1。

在本发明的一些实施例中，还包括安装在制备结构5、分选结构6外侧的固定架24，固定架24将基底电极层11、绝缘层25、上层电极14夹紧，使得腔室内料液不会外漏。

固定架24下部安装下层压电陶瓷晶片15，下层压电陶瓷晶片15位于基底电极层11底部。

在本发明的一些实施例中，过渡通道16与制备腔室13的基底呈45°角，过渡通道16的下端连接制备腔室13，上端连接至绝缘层上平面，过渡通道16上端紧邻分选结构6，使得脂质体可以顺利进入分选结构6。

在本发明的一些实施例中，分选结构6的分选进样腔室23位于绝缘层25内，其底部位于基底电极层11的上表面。分选进样腔室23具体可以设置为圆形，便于液体流通。

在本发明的一些实施例中，过渡通道16位于绝缘层25内，分选电极17位于基底电极层11内。

在本发明的一些实施例中，三个收集腔室均位于绝缘层25内，腔室底部位于基底电极层11上表面。

本发明的运行过程如下：对制备及分选巨型脂质体的芯片3进行清洗处理、等离子清洗，然后将卵磷脂溶解于三氯甲烷溶剂中，加入荧光染料DiI(1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)，将有机相进行染色处理后，添加有机相于制备结构5的制备腔室13的基底平面上，然后用氮气吹5min，再将制备、分选巨型脂质体的芯片3放置于真空环境下2小时，让有机溶剂完全蒸发，在基底平面上形成脂质膜，然后向制备腔室13内通过注射泵4经通道12注入去离子水(或者需要的缓冲液)，再采用第一信号发生器1通过上层电极14、基底电极层11对制备腔室13施加电信号2Vpp，10Hz，持续4小时，待较多脂质膜膨胀至形成所需直径范围(10-50μm)巨型脂质体的时候，停止对电极施加电信号，再采用第一信号发生器1以及与其连接的控制电路10对下层压电陶瓷晶片15施加谐振电信号，产生超声信号作用于制备腔室13，促使脂质膜封闭形成巨型脂质体后，关闭第一信号发生器1。巨型脂质体的介电电泳受到其粒径以及内外溶液介电常数的影响，通过注射泵4向制备腔室13添加介电电泳缓冲液(或者其他需要的缓冲液)，同时采用第一信号发生器1以及与其连接的控制电路10对下层压电陶瓷晶片15施加谐振电信号，促进制备腔室内料液混合均匀，改变脂质体内外溶液的介电常数。

制备腔室13内的溶液经过过渡通道16进入到分选结构6，通过第二信号发生器2对分选电极17施加电信号，5-10Vpp,100KHz，使得巨型脂质体与远小于10μm的非巨型脂质体、脂质碎末、未包封物质等通过介电电泳发生分离。最后，所需的巨型脂质体通过第二微通道20进入第二收集腔室8；其余非巨型脂质体等物质则经过第一微通道19、第三微通道21进入第一收集腔室7、第三收集腔室9，完成分选和收集。

图4所示为制备结构5制得的脂质体悬液在显微镜下放大200倍的拍照图。从图4可以看出，巨型脂质体与非巨型脂质体、脂质碎末、未包封物质等混杂在一起，如果不进行分选，进行后续研究如构建细胞模型、微型生化反应器等时，将无法排除干扰。

图5、图6所示为分选微通道中的脂质体悬液在显微镜下的拍照图，从图中可以看出，粒径较小的脂质体汇聚到电极上，而粒径较大的脂质体沿着通道中间往前流动。

图7所示为中间收集腔室收集到的巨型脂质体，对比图7和图4可以发现，巨型脂质体被有效收集起来，而非巨型脂质体、脂质碎末、未包封物质等被有效分离。

综上，本发明通过电极施加电信号并结合压电陶瓷晶片发出超声信号，高效制备巨型脂质体，制备重复性好，通过介电电泳分选不同粒径的巨型脂质体，或者将包载内容物的巨型脂质体与未包载的内容物分离，制备效率和分选效率均得到显著提高，不易破碎，实现将巨型脂质体与非巨型脂质体、未包封内容物有效分离。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：包括基底电极层(11)以及位于其上表面的绝缘层(25)，所述基底电极层(11)上设有相互连通的制备结构(5)、分选结构(6)，所述制备结构(5)包括位于所述绝缘层(25)内的制备腔室(13)，所述分选结构(6)包括用于分选脂质体的分选微通道(18)，所述制备腔室(13)与所述分选微通道(18)通过过渡通道(16)连通，所述分选微通道(18)位于所述绝缘层(25)内，所述基底电极层(11)包括位于所述分选微通道(18)侧边的分选电极(17)。

2.根据权利要求1所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述制备结构(5)还包括位于所述基底电极层(11)下表面的下层压电陶瓷晶片(15)、位于所述制备腔室(13)上方的上层电极(14)，所述基底电极层(11)包括位于所述制备腔室(13)底部的下层电极(26)。

3.根据权利要求2所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述上层电极(14)、下层电极(26)电性连接至第一信号发生器(1)，所述基底电极层(11)还包括基底玻璃(27)，所述下层电极(26)位于该基底玻璃(27)的上表面，所述上层电极(14)的上表面设有上层玻璃(28)。

4.根据权利要求2所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述下层压电陶瓷晶片(15)通过控制电路(10)电性连接至第一信号发生器(1)。

5.根据权利要求1所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述过渡通道(16)呈倾斜设置，其下端连通至所述制备腔室(13)底部，其上端连通至所述分选结构(6)。

6.根据权利要求5所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述过渡通道(16)上设有可自由***或取出的挡料件(21)。

7.根据权利要求1所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述制备腔室(13)连通有进液通道(12)，所述进液通道(12)连通有注射泵(4)。

8.根据权利要求1所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：所述分选结构(6)还包括分选进样腔室(23)，所述过渡通道(16)的上端连通至所述分选进样腔室(23)。

9.根据权利要求1所述的巨型脂质体制备及分选结构，其特征在于：还包括用于固定所述制备结构(5)、分选结构(6)的固定架(25)，所述分选微通道(18)的末端设有三个出口，分别连通至用于收集所需脂质体的第二收集腔室(8)、用于收集不合格脂质体或其他物质的第一收集腔室(7)、第三收集腔室(9)。

10.一种基于介电电泳的巨型脂质体制备及分选方法，包括如下步骤：

1)脂质体的制备：向制备腔室内注入所需料液，蒸干有机溶剂后，注入去离子水或所需缓冲液，对制备腔室施加电信号，脂质膜膨胀至形成所需直径范围的脂质体后，停止施加电信号，通过压电陶瓷晶片对制备腔室施加超声信号，促使脂质膜封闭形成脂质体；

2)脂质体的分选：向制备腔室中注入新的去离子水或所需缓冲液，通过控制电路对下层压电陶瓷晶片施加谐振电信号，改变脂质体内外溶液的介电常数，同时使得脂质体进入分选微通道，对分选电极施加电信号，通过介电电泳分选得到所需巨型脂质体。