CN108969491A - 一种薏苡素制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

薏苡素制剂及其制备方法，属于医药技术领域。采用溶剂搅拌‑冷冻干燥法制备薏苡素羟丙基‑β‑环糊精(HP‑β‑CD)包合物，薏苡素HP‑β‑CD包合物制剂产品得率≥75％，其有效成份薏苡素含量≥3％，薏苡素被HP‑β‑CD包合的包合率≥65％。薏苡素HP‑β‑CD包合物使水难溶性的薏苡素在体外水性介质中释药程度和速度显著增加；口服后能增加薏苡素在体内的吸收，延缓薏苡素在体内的代谢消除，达到长效作用，显著提高薏苡素口服生物利用度，使薏苡素更有效的发挥镇痛抗炎抗肿瘤等药理作用。

Description

一种薏苡素制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域。

背景技术

薏苡素，作为药食同源植物“薏苡”的提取成分而得名，也存在于白茅、野甘草等天然植物中，有关文献中提到薏苡素具有镇痛抗炎、降糖、降血压、抗菌、抗肿瘤作用，但其相关的实验研究国内外却鲜见报道，薏苡素单体药物制剂的研究国内外没有报道。薏苡的种仁也是《中国药典》2015年版收载品种，用于水肿，脚气，小便不利，脾虚泄泻，湿痹拘挛，肺痈，肠痈，赘疣，癌肿等病症。另外，薏苡素也是以薏苡种仁油为原料制备的对肉瘤、肝癌、胃癌、肺癌等均具有较好疗效的抗癌制剂“康莱特注射液”中的主要活性成分之一。目前有很多关于康莱特注射液抗癌同时减轻癌症痛感的临床报道，由于薏苡素的水溶性差，我们采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合薏苡素，考察薏苡素及其包合物灌胃给药后在大鼠体内的药动学特征和组织分布情况，发现薏苡素能透过血脑屏障并较长时间滞留在脑部，提示“康莱特注射液”对癌患的镇痛作用很有可能是所含成分薏苡素所为，研发薏苡素制剂可以满足临床用药的需求，具有实际应用价值。

发明内容

1.为充分开发利用薏苡、白茅、野甘草等药用植物资源，本发明提出一种薏苡素制剂。

2.本发明为薏苡素HP-β-CD包合物冻干粉，本发明有效成份薏苡素含量≥5％，薏苡素被HP-β-CD包合的包合率≥65％。

3.本发明另一目的是提出薏苡素制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)定量称取HP-β-CD加到一定量蒸馏水中，恒温磁力搅拌至溶解，得一定浓度的HP-β-CD溶液；

2)定量称取薏苡素，用少量无水乙醇溶解后滴入1)项制备的HP-β-CD溶液中，继续恒温磁力搅拌得薏苡素HP-β-CD包合物溶液；

3)将薏苡素HP-β-CD包合物溶液分装在西林瓶中，放入冰箱中预冻后冷冻干燥得薏苡素HP-β-CD包合物冻干粉即为薏苡素制剂。

①薏苡素(C₈H₇NO₃，分子量165)化学名是：6-甲氧基-2-苯噁唑啉酮，有内酯环式结构，见附图1所示。薏苡素可溶于甲醇、乙腈、无水乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂，几乎不溶于水。

HP-β-CD(Hydroxypropyl-β-cyclodextrin)是β-糊精的羟烷基衍生物，在水中溶解度远大于β-CD，已经美国食品药品管理局批准可用于食品和药品中。HP-β-CD因羟丙基取代2、3位羟基H原子后增加环糊精空腔长度，所以较β-环糊精更易与药物分子形成复合物，羟丙基上羟基也会与药物分子形成新的氢键，增加复合物稳定性，从而使HP-β-CD更好地对药物发挥增溶、保护或缓释作用。采用HP-β-CD将薏苡素进行包合，能够更显著地增加水难溶性薏苡素的溶解度和稳定性，并提高其生物利用度，降低毒副作用等。

②包合物系指一种分子被全部或部分包合于另一种分子的空穴结构内形成的特殊的复合物。环糊精包合物的制备方法很多，但目前尚未有一种制备方法可通用，最常用的是饱和水溶液搅拌、超声、研磨法。

饱和水溶液搅拌法是先根据不同温度下环糊精的溶解度制成其饱和水溶液，然后加入客体药物分子充分搅拌混合后形成包合物溶液，再用适当方法将其析出，经过滤、洗涤、干燥可得包合物。

超声波法和搅拌法的不同之处就是利用超声仪(以石英作电压晶体或用钛酸钡作为换能器产生超声波，将此高频超声能传给液体，由于能量集中，可使介质产生剧烈振动，使分散相均匀地分散。)代替搅拌器，将环糊精饱和水溶液中加入主客分子药物，在一定的强度下选择适当的时间进行超声，将析出的沉淀过滤、洗涤、干燥得包合物。

研磨法是环糊精与2～5倍量水研匀后加入客分子药物，用研磨机研成糊状后低温干燥得包合物。

我们以包合物的包合率和得率为指标，通过实验比较搅拌、研磨、超声三种制备方法，计算综合评分，筛选综合评分最高的搅拌法制备薏苡素HP-β-CD包合物。

③薏苡素分子进入HP-β-CD空腔通过非共价结合形成复合物，这是一个包合和解包的可逆动态过程，薏苡素分子不断的进出HP-β-CD空腔，控制反应温度、薏苡素和HP-β-CD两者浓度、pH等反应条件会使反应向有利于形成包合物方向转移。所以，为了得到更多包合物，最大限度的加入了HP-β-CD量，也就是在HP-β-CD饱和溶液中进行复合反应，HP-β-CD溶液的浓度≥50％。

④HP-β-CD比β-CD更易与合适客体药物分子形成复合物，因羟丙基取代2，3位羟基H原子后增加了CD空腔长度，羟丙基上羟基也可能会与客体药物分子形成新的氢键，增加复合物稳定性。理论和实验研究表明，HP-β-CD与客体药物分子主要形成1∶1复合物；但也有形成2∶1复合物和3∶1复合物等。我们在恒温条件下配制HP-β-CD饱和水溶液，分别按照HP-β-CD与薏苡素摩尔比为0.5︰1，1︰1，2︰1，3︰1，4︰1等加入薏苡素，搅拌一定时间后分装在西林瓶中冷冻干燥，分取冻干粉加无水乙醇快速萃取游离薏苡素，高效液相色谱法测定薏苡素含量(也可以加无水乙醇对萃取游离薏苡素后的冻干粉回流解包测定被包合的薏苡素含量)，计算其包合率和包合物得率。结果显示，开始时随着投料比的增大，薏苡素包合物的包合率和得率也逐渐增大，当HP-β-CD与薏苡素投料比为3︰2时，包合率和得率均达到最大值，继续增加投料比，包合率和包合物得率反而呈现减小趋势。这可能是当投料比较小时，HP-β-CD不足以容纳所有的薏苡素；当投料比过大时，可能会因溶液中的HP-β-CD过多，溶液黏度过大，影响薏苡素分子的扩散而不利于包合。为进一步考察投料比对包合率和得率的影响，我们又选取HP-β-CD与薏苡素摩尔比为1.5︰1、2︰1、2.5︰1继续进行了星点设计-响应面实验，确定了最佳摩尔比为：HP-β-CD摩尔数︰薏苡素摩尔数＝1.5︰1(因为HP-β-CD是不同取代的混合物，所以加入的薏苡素质量是HP-β-CD质量的3.5％～5.5％时，相当于HP-β-CD摩尔数︰薏苡素摩尔数＝1.5︰1)。

β-CD与环氧丙烷在低温下反应制备HP-β-CD时，在强碱性条件下2、3、6位O都被活化，但是6位伯羟基上的O位阻最小，羟丙基最易与其结合，所以取代6位的H更容易发生，因而更多的生成6-HP-β-CD；弱碱性条件下2位-OH最易活化，酸性最强，因此生成更多的2-HP-β-CD。β-CD分子上有众多羟基(21个)，所有羟丙基可以平均分配在每个葡萄糖分子上，也可以只结合在同一个葡萄糖分子上，或者羟丙基依次相连形成低聚侧链，所以形成的HP-β-CD是无定形混合物。

β-CD特有的内疏水外亲水无顶圆锥状空腔结构，易容纳客体药物分子，使包合的药物分子水溶解度增强，HP-β-CD破坏了β-CD分子内氢键，结晶性较β-CD降低，水溶解度和包合能力都大幅度提高。但羟丙基取代度过高也会产生空间位阻，阻碍客体药物分子进入空腔内部。所以选择合适取代度和取代基分布也是提高包合率的重要条件。

⑤由于薏苡素水溶性较差，直接加进HP-β-CD的水溶液中包合效果不佳，故用易溶性有机溶剂先将其进行溶解，考虑到制剂生产过程中的方便易得性和安全性等因素，选择无水乙醇为溶媒，加入薏苡素质量5～8倍的无水乙醇可使薏苡素完全溶解成浓溶液，少量的无水乙醇在包合过程中很快被挥发掉不会影响包合反应。乙醇量不能过多，因其可竞争性取代薏苡素并占据HP-β-CD空穴中位置而具有解包合作用。

⑥为了考察温度对包合反应的影响，我们分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下配制同样浓度HP-β-CD水溶液，按照HP-β-CD与薏苡素摩尔比＝3︰2加入薏苡素乙醇溶解液，以500r/min速度搅拌5h后分装在西林瓶中冷冻干燥，分取冻干粉加无水乙醇快速萃取游离薏苡素，高效液相色谱法测定薏苡素含量(也可以加无水乙醇对萃取游离薏苡素后的冻干粉回流解包测定被包合的薏苡素含量)，计算其包合率和包合物得率。结果显示，包合率和得率开始时随温度升高而逐渐增大，当包合温度达到60℃时，包合率和得率均达到最大值，之后当温度继续升高时，包合率和得率反而下降。分析出现这一现象可能因为温度升高，溶液粘度下降，加快分子的扩散，有利于包合物的形成；但当达到一定温度时，再升高温度就会加剧分子热运动，导致脱包使药物流出包合腔中，从而降低了包合物的稳定性；而且HP-β-CD是多羟基与水分子形成氢键而溶于水的，温度升高使HP-β-CD分子热运动加剧也会破坏与水分子间氢键而降低亲水性，从而降低了对薏苡素的包合能力。进一步选择包合率和包合物得率综合评分相近的50℃、60℃、70℃温度进行了星点设计-响应面实验，确定最佳包合温度范围是50℃～60℃。

⑦为了考察包合时间对反应效率的影响，在50℃条件下配制同样浓度HP-β-CD水溶液，按照HP-β-CD与薏苡素摩尔比＝3︰2加入薏苡素乙醇溶解液，以500r/min速度分别搅拌1h、3h、5h、8h、12h后分装在西林瓶中冷冻干燥，分取冻干粉加无水乙醇快速萃取游离薏苡素，高效液相色谱法测定薏苡素含量(也可以加无水乙醇对萃取游离薏苡素后的冻干粉回流解包测定被包合的薏苡素含量)，计算其包合率和包合物得率。结果显示，薏苡素HP-β-CD包合物的包合率和包合物得率随时间的延长逐渐增大，当包合时间为5h时，包合率和得率均为最大值，之后随着时间的延长，包合率和包合物得率略有下降。分析原因是包合过程是一种客体分子进入到主体分子空腔内并通过分子间氢键相结合的过程，增加包合时间有利于主客体分子充分接触而形成包合物，但由于包合物的形成是一动态平衡过程，到达饱和状态后，再增加包合时间也不会提高包合效率，反而搅拌时间过长导致了部分薏苡素药物分子脱包合。根据上述单因素影响实验结果，我们选择2、4、5h进行星点设计-响应面实验，进一步考察了包合时间对包合率和得率的影响，确定了包合反应时间是2～5h。

⑧为了考察搅拌速率对反应效率的影响，在50℃条件下配制同样浓度HP-β-CD水溶液，按照HP-β-CD与薏苡素摩尔比＝3︰2加入薏苡素乙醇溶解液，分别以200r/min、400r/min、600r/min、800r/min、1000r/min的速度搅拌5h后，分装在西林瓶中冷冻干燥，分取冻干粉加无水乙醇快速萃取游离薏苡素，高效液相色谱法测定薏苡素含量(也可以加无水乙醇对萃取游离薏苡素后的冻干粉回流解包测定被包合的薏苡素含量)，计算其包合率和包合物得率。结果显示，薏苡素HP-β-CD包合物的包合率和包合物得率随搅拌速度增大而增大，当搅拌速度为600r/min时，包合率和得率均为最大值，之后随着搅拌速度的增加，包合率和包合物得率略有下降的趋势。分析原因是，当搅拌速度较低时，影响分子扩散接触的频率；但速度过快时，也不利于包合。因为包合物的形成取决于提供空穴的主分子和进入空穴的药物客分子两者的主体结构和两者的极性。包合物的稳定性依赖于主客分子间范德华引力的强弱。如色散力、偶极间引力、氢键、电荷迁移力等，这种结合力有时为单一作用力，但多数为几种作用力的协同作用。另一方面，客分子的大小，分子形状应与主分子能提供的空间相适应。若客分子太小，就可以自由进出主分子洞穴，包合力弱；若客分子太大，进入主分子空洞内困难或只有一部分嵌入洞穴，包合力也弱；只有当主、客分子大小适当时，进入洞穴后间隙小，产生足够强度的主客分子间吸引力，才能够形成稳定的包合物。而客分子进入与其大小较为相当的洞穴应该是较为缓慢的过程，慢速搅拌带来的向心力将客分子一点点推进主分子的洞穴，过快搅拌带来的离心力有可能拽出正在进入洞穴的客分子。总体来说，搅拌速度对包合的影响较小，包合率和包合物得率综合评分都比较接近，所以选择了300r/min～600r/min这样一个比较宽的搅拌速率范围。

⑨HP-β-CD溶解度很高，一般≥50％。HP-β-CD包合薏苡素后仍然溶解在水中，用降温的方法不易析出，加有机溶剂不符合工业化生产低成本和环保要求，且有机溶剂大多具有解包作用，故采用干燥的方法去除水分。因为HP-β-CD属于亲水性高分子物质，溶液高粘度的特性使包合反应液粘性较大，尤其在较高浓度的时候，所以任何一种热干燥方法多半使体系形成较硬外壳结构致密，阻止内部水分的蒸发而使干燥不彻底，所以采用冷冻干燥的方法去除水分。HP-β-CD本身的骨架结构使表层外壳疏松，有利于水分升华。

⑩冷冻干燥工艺参数对薏苡素HP-β-CD包合物冻干粉品质是有影响的。首先是预冻温度，从理论上讲，产品预冻温度应选择低于共晶点(物料中水分全部冻结)温度5～15℃为宜，本发明经美国PerkinElmer公司产DSC-8500型差示扫描量热仪测定制备的薏苡素HP-β-CD包合物共晶点为-35.80℃，见附图2，横坐标为温度，纵坐标为放热量；预冻温度决定预冻速率，预冻速率会直接影响升华干燥速率：预冻速率慢，冻结过程中易形成量少但粗大的冰晶；预冻速率快，则形成的冰晶量多却细小；在冻干过程中，冰晶越小，其升华后留下的空隙就越小，水蒸气逸出通道细小，阻力大，使冻干速率减慢；冰晶大则升华后形成较宽敞通道，水蒸气的逸出阻力小，冻干速率较快。一定预冻温度下的预冻时间要适当，预冻时间过短，物料冻结不彻底，存在的液体水在干燥时会迅速蒸发，造成液体的浓缩，使冻干产品体积缩小，而且溶解在溶液中的气体会在真空条件形成气泡冒出，使冻干产品鼓泡喷瓶等，影响冻干产品的质量；预冻时间过长，增加制冷和负荷，耗能大。本发明经实验选择预冻温度为-45℃～-75℃，预冻时间为2～5h，制备的薏苡素HP-β-CD包合物在预冻时完全冻结，冻干过程中产品未出现萎缩、空洞等问题。

升华干燥温度是影响冷冻干燥进程的重要因素，主要体现在加热搁板温度的控制，控制的原则是:尽量使升华面温度接近其共熔点(冻结物料在加热过程中刚出现熔化时的温度)但又必须低于共熔点。本发明经美国PerkinElmer公司产DSC-8500型差示扫描量热仪测定制备的薏苡素HP-β-CD包合物共熔点为-7.54℃，见附图3，横坐标为温度，纵坐标为吸热量。当升华阶段结束后，物料的大部分水分已除去，此时应提高加热温度，进一步降低水分含量。解析温度越高、解析干燥时间越长，越有利于制品的冻干。但实验发现本发明条件升华干燥36～48h时段冻干制品含水量达到要求(3～5％)，结合产品生产的能耗，未再升温解析干燥，确定冻干的温度为-50℃～-20℃，冻干时间为36～48h，冻干中冻结的薏苡素HP-β-CD包合物未出现融化、塌陷等问题。

冻干室的操作压力影响冷冻干燥的传热传质过程。压力高，传热效率好，但不利于水蒸汽的顺利逸出；压力低，物料内外压差大，传质动力高传质效果好，冰的升华也随之加快，但压强过低传热效率也随之下降，干燥原料不易获得热量，造成干燥速率降低。本发明经实验确认冻干薏苡素HP-β-CD包合物的理想压力是45Pa。

增大物料表面积，减小物料厚度，可提高冷冻干燥速率。物料的干燥是由外层向内层推进，冻干时间随冻结物料厚度的增加而延长。减少物料厚度，可降低热、质传递通过干燥层的阻力，使干燥速率提高。但物料过薄，干燥颗粒较大，复水性较差。本发明经实验确认薏苡素HP-β-CD包合物溶液在瓶体直径2cm、容积10ml的西林瓶中分装质量为3～4g时，薏苡素HP-β-CD包合物冻干粉疏松，复水性能良好。

附图说明

图1为薏苡素化学结构图

图2为以10.00℃/min的降温梯度从25.00℃冷却至-50.00℃时测定薏苡素HP-β-CD包合物共晶点的差示扫描量热图。

图3为以10.00℃/min的升温梯度从-50.00℃加热至25.00℃时测定薏苡素HP-β-CD包合物共熔点的差示扫描量热图。

图4为薏苡素-HP-β-CD包合物的成型性表征-扫描电子显微镜观察图。

图5为薏苡素-HP-β-CD包合物的成型性表征-紫外吸收光谱图。

图6为薏苡素-HP-β-CD包合物的成型性表征-红外吸收光谱图。

图7为薏苡素-HP-β-CD包合物的成型性表征-差示扫描量热分析图。

图8为薏苡素-HP-β-CD包合物的成型性表征-X射线衍射谱图。

图9为薏苡素标准品HPLC色谱图。

图10为薏苡素-HP-β-CD包合物供试品HPLC色谱图。

图11为HP-β-CD(薏苡素阴性供试品)HPLC色谱图。

图12为薏苡素含量测定的标准曲线。

图13为薏苡素和薏苡素-HP-β-CD的累计释药曲线。

图14为大鼠血浆色谱图：A是空白血浆；B是空白血浆+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后血浆样品+内标(斑蝥素)。

图15为大鼠心脏组织色谱图：A是空白心脏组织；B是空白心脏组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后心脏组织样品+内标(斑蝥素)。

图16为大鼠肝脏组织色谱图：A是空白肝脏组织；B是空白肝脏组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后肝脏组织样品+内标(斑蝥素)。

图17为大鼠脾脏组织色谱图：A是空白脾脏组织；B是空白脾脏组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后脾脏组织样品+内标(斑蝥素)。

图18为大鼠肺脏组织色谱图：A是空白肺脏组织；B是空白肺脏组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后肺脏组织样品+内标(斑蝥素)。

图19为大鼠肾脏组织色谱图：A是空白肾脏组织；B是空白肾脏组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后肾脏组织样品+内标(斑蝥素)。

图20为大鼠脑组织色谱图：A是空白脑组织；B是空白脑组织+薏苡素+内标(斑蝥素)；C是给药后脑组织样品+内标(斑蝥素)。

图21为薏苡素及其包合物大鼠灌胃给药体内药时曲线(平均值±SD，n＝6)。

图22薏苡素及其包合物灌胃给药后在各时间点各组织中的药物分布情况(n＝6)。

图23为薏苡素及其包合物对A549细胞生长抑制的影响(x±s，n＝3)。

图24为Hoechst33258荧光染色检测薏苡素对A549细胞的形态学变化(放大倍数：×200；A，B，C，D分别为薏苡素浓度0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L的观察结果)。

图25为Hoechst33258荧光染色检测薏苡素-HP-β-CD包合物对A549细胞的形态学变化(放大倍数：×200；A，B，C，D分别为薏苡素浓度0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L的观察结果)。

图26为薏苡素使A549细胞凋亡的流式细胞图(A，B，C，D分别为薏苡素浓度0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L时的作用结果)。

图27为薏苡素-HP-β-CD包合物使A549细胞凋亡的流式细胞图(A，B，C，D分别为薏苡素浓度0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L时的作用结果)。

图28为薏苡素及其包合物对A549细胞凋亡率的影响数据处理结果示意图(x±s，n＝3)

具体实施方式

一、薏苡素-HP-β-CD包合物的制备

精密称取分子量1617的HP-β-CD75g置于250mL烧杯中，加100mL蒸馏水，60℃、450r/min磁力搅拌至溶解。按照HP-β-CD与薏苡素摩尔比＝3︰2精密称取分子量165的薏苡素5.6g，加30ml无水乙醇使薏苡素溶解后缓慢滴入75％HP-β-CD溶液中，继续60℃、450r/min磁力搅拌5h后停止加热，既得薏苡素-HP-β-CD包合物，将其分装在瓶体直径2cm、容积10ml的西林瓶中，分装质量为3.5g。采用美国LABCONCO公司产FreeZone.1型冷冻干燥机，先开制冷机，在-55℃条件下预冻3h；继续开启压缩机，将冻结的薏苡素-HP-β-CD包合物放至干燥室，连接好温度探头，密封后开启真空泵抽真空，当压力降至45Pa时，开启加热板使温度逐渐升至-20℃，继续加热至操作界面显示的物料温度及物料质量保持恒定不变时，预示干燥结束，冻干时间为36h，得薏苡素-HP-β-CD包合物冻干粉总计66.66g，包合物产品得率＝[包合物实际质量/(HP-β-CD+薏苡素投料量)]×100％＝[66.66/(75+5.6)]×100％＝82.7％。

二、薏苡素-HP-β-CD包合物成型性表征

(一)场发射扫描电子显微镜SEM观察

取少量薏苡素、HP-β-CD、两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物，经导电胶粘样、喷金镀膜后，在15.0KV高真空模式下，SEM600倍放大结果见附图4所示。图4中的A、B、C、D分别为薏苡素、HP-β-CD、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的SEM镜下显像情况：薏苡素呈现为板状结晶；HP-β-CD为表面有小孔的扁球状；两者的物理混合物可同时观察到薏苡素的板状及HP-β-CD的扁球状结晶；薏苡素HP-β-CD包合物则为凹凸不规整的碎片状，其物相结构明显不同于两者物理混合物，说明HP-β-CD与薏苡素形成包合物后主客分子的原晶格排列都发生变化，形成了新的物相。

(二)紫外光谱特征比较

分别精密称定薏苡素2.1mg、HP-β-CD 30.1mg、两者物理混合物32.8mg(其中薏苡素2.09mg)、薏苡素CDP包合物31.8mg(含薏苡素2.02mg)置于5ml容量瓶中，加DMSO溶解并定容至刻度，以DMSO为空白对照，采用美国Varian公司产Cary 5000型紫外-可见-近红外吸收光谱仪，在200～400nm波长范围内扫描，各样品紫外吸收光谱测定结果如图5所示。图5中的A、B、C、D分别为HP-β-CD、薏苡素、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的紫外吸收光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸收度；薏苡素分别在232nm和290nm有吸收峰，HP-β-CD在这两个波长处附近都没有吸收，薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物以及薏苡素-HP-β-CD包合物的紫外吸收图谱是两者图谱的简单叠加，也与薏苡素的紫外吸收图谱一致。采用紫外检测器的HPLC法测定包合物中薏苡素含量时，HP-β-CD不产生干扰。

(三)红外光谱特征比较

分别取HP-β-CD 1.9mg、薏苡素1.8mg、两者物理混合物2.5mg(其中薏苡素0.159mg)、薏苡素HP-β-CD包合物2.2mg(含薏苡素0.140mg)，置于红外灯下干燥后与KBr混合研成细粉后压片，采用美国Varian公司产Cary 610/670红外光谱仪，在4000～400cm-1范围内测定各自的红外吸收光谱如图6所示。在图6中的A、B、C、D分别为HP-β-CD、薏苡素、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的红外吸收光谱，横坐标为波数，纵坐标为透光率；A、B、C、D图谱各不相同，C、D相似度较高；薏苡素图谱中在3097cm-1和3160cm-1分别是C-H、-NH-伸缩振动吸收峰，这两个峰在C、D图谱中消失，分析是被HP-β-CD的O-H伸缩振动强峰所掩盖或由于薏苡素分子进入HP-β-CD疏水内腔中C-H、-NH-振动受到抑制；薏苡素在1790cm-1左右出现羰基C＝O伸缩振动吸收峰，而包合物形成后该峰虽有体现但强度极大减弱，有可能是因为薏苡素的羰基受HP-β-CD屏蔽或与HP-β-CD中羟基形成氢键使羰基键强削弱所致。HP-β-CD图谱B中O-H的伸缩振动特征吸收峰3401cm-1在薏苡素-HP-β-CD包合物的红外吸收光谱图D中降到3387cm-1，分析是由于薏苡素的氨基、羰基与HP-β-CD的羟基形成氢键，-OH健强减弱，振动峰向低频位移。以上IR吸收差异说明薏苡素-HP-β-CD包合物的形成。

(四)差示扫描量热分析

取HP-β-CD 12.84mg、薏苡素1.39mg、两者物理混合物13.54mg(其中薏苡素0.86mg)、薏苡素-HP-β-CD包合物16.04mg(含薏苡素1.02mg)，采用美国PerkinElmer公司产8500型差示扫描量热仪进行DSC实验，由室温开始10℃/min升温，吹扫气(N2)20mL/min，记录的温度范围40～200℃，结果如图7所示。图7中的A、B、C、D分别为薏苡素、HP-β-CD、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的差示扫描量热图谱，横坐标为温度，纵坐标为吸热量；图A显示薏苡素的熔点是155.84℃，B显示HP-β-CD的熔点是109.72℃，图C呈现熔点为102.62℃(归属HP-β-CD)和155.49℃(归属薏苡素)两个吸热峰，图D呈现的94.05℃吸热峰代表薏苡素HP-β-CD包合物的熔点，说明薏苡素被包合后结晶度大幅度降低，形成新的物相。

(五)X射线衍射谱比较

分别取薏苡素7.4mg、HP-β-CD 8.2mg、两者物理混合物8.6mg(其中薏苡素0.55mg)、薏苡素-HP-β-CD包合物8.2mg(含薏苡素0.52mg)，采用德国Bruker AXS公司产D8Advance多晶X射线衍射仪，测试条件为：Cu-Kα辐射，Lynxeye阵列探测器，管电压40kV，管电流40mA，扫描角度范围为5°～40°，扫描速度为5°/min，进行X-射线衍射(XRD)检测，结果见图8。图8中的A、B、C、D分别为薏苡素、HP-β-CD、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的XRD图谱，横坐标为峰位，即衍射峰的2θ位置，代表衍射角；纵坐标为衍射强度，用每秒收集到的光子个数CPS-counts per second来表示。薏苡素为晶体化合物，有多个尖锐的特异性结晶峰；HP-β-CD的衍射图谱中表现为弥散峰，没有结晶峰；薏苡素与HP-β-CD物理混合物中既有薏苡素的结晶峰，又有HP-β-CD的弥散峰，是两者峰形的简单叠加；在薏苡素-HP-β-CD包合物衍射图谱中，薏苡素在7.88°、16.71°处的特征峰明显减弱，且在10.97°、23.82°、31.95°、36.5°四处的特征峰消失，主要表现为类似于HP-β-CD的弥散峰形，X射线衍射的峰位由晶胞大小和形状决定；峰强(高)是由晶胞里原子的种类和原位置决定的，表明薏苡素被包合后结晶度大幅度降低，化学键强和晶格排列都与游离的薏苡素不同，即形成了新的物相。

三、高效液相色谱-HPLC测定制备的薏苡素-HP-β-CD包合物中薏苡素含量及HP-β-CD对薏苡素的包合率

1.色谱条件

色谱柱：Symmetry C18(5μm 4.6×250mm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水溶液，等度洗脱：A︰B＝30︰70；流速：1.0mL/min；柱温：25±5℃；检测波长：232nm；进样量：20μL。

2.溶液配制

2.1薏苡素标准品储备溶液的配制

精密称取薏苡素标准品5.0mg，置于25mL棕色容量瓶，加入流动相定容至刻度，摇匀，配制成0.2mg/mL薏苡素的标准储备液，于4℃冷藏保存。

2.2薏苡素对照品溶液的配制

取2.1项下薏苡素标准储备液0.3mL置于10mL棕色容量瓶中，用流动相定容，摇匀，得薏苡素对照品溶液。

2.3供试品溶液的配制

①精密称取一项制备的薏苡素-HP-β-CD包合物12.0mg置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，超声1h后离心15min定量吸取上清，挥去无水乙醇，加入流动相定容至100mL，摇匀，得解包薏苡素-HP-β-CD包合物供试液。

②精密称取薏苡素-HP-β-CD包合物12.0mg加沸程30～60℃的石油醚约3ml分次快速萃取至萃取液无薏苡素检测出来，1～2次即可萃取完全；将无游离薏苡素的包合物置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，超声1h后离心15min定量吸取上清，挥去无水乙醇，加入流动相定容至100mL，摇匀，得解包薏苡素-HP-β-CD包合物供试液。

2.4阴性样品溶液的配制

按照薏苡素-HP-β-CD包合物处方比例，不加薏苡素，按一项下方法制备阴性供试品，按上述薏苡素-HP-β-CD包合物供试液配制方法制得阴性供试液。

3.定量方法可靠性考察

3.1紫外定量检测波长的确定

根据薏苡素、HP-β-CD、薏苡素和HP-β-CD两者物理混合物、薏苡素-HP-β-CD包合物的紫外光谱特征(见二项下(二)及图5的实验结果)，兼顾检测包合物及生物样品中薏苡素的灵敏度和精密度，选择232nm作为薏苡素定量波长。

3.2专属性

取2.项下薏苡素对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按照1.项色谱条件进行测定，HPLC结果见图9、10、11。横坐标为保留时间，分钟(min.)为单位，是定性指标；纵坐标是信号强度，即用吸收度(AU-Absorbance unit，1Au＝1000mV)表示的峰高(仪器可自动积分给出峰面积)，是定量指标。图9显示薏苡素在7.147min出峰，图10显示薏苡素在7.144min出峰，图11显示4～20min范围未出现色谱峰，即HP-β-CD对薏苡素的含量测定无干扰，表明该方法具有良好的专属性。

3.3标准曲线

分别精密吸取2.1项下薏苡素对照品储备溶液62.5、125、250、625、1250、1875μL于5mL棕色容量瓶，流动相稀释并定容，配制成薏苡素浓度分别为2.5、5、10、25、50、75μg/mL的系列标准溶液。按1.项色谱条件进行测定，记录薏苡素的峰面积。以薏苡素浓度(μg/mL)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到薏苡素含量测定的回归方程：y＝108096x-48927(R2＝0.9995)。结果表明：在2.5～75μg/mL范围内线性良好。标准曲线如图12。

3.4精密度

分别取3.3项下配制的5、25、75μg/mL的3份薏苡素标准品溶液，按1.2项下色谱条件连续测定5次，记录仪记录薏苡素的峰面积，考察精密度。结果见表1：不同浓度范围下的RSD％值分别为0.65、0.77、0.93，表明该方法精密度良好。

表1薏苡素HPLC含量测定方法精密度实验结果

3.5稳定性

分别取3.3项下配制的5、25、75μg/mL的3份薏苡素标准品溶液，在室温下放置0、2、6、12、24h后按1.项色谱条件进行测定，记录薏苡素的峰面积，考察对照品溶液日内测定的稳定性。结果见表2：不同时间下测定的峰面积RSD％分别为1.00、1.39、1.15，表明24h内薏苡素含量测定稳定性良好。

表2薏苡素HPLC含量测定方法稳定性实验结果

3.6加样回收率

精密吸取9份薏苡素-HP-β-CD包合物供试品溶液(薏苡素浓度4.7μg/mL)各1mL，分为3组，每组3份。每组分别精密加入浓度为5.0μg/mL薏苡素标准品溶液各0.5、1、1.5mL，再各加流动相1.5、1、0.5mL以确保总体积为3mL，混匀，配成低、中、高不同浓度的溶液。按1.项色谱条件进行测定，记录薏苡素的峰面积，考察加样回收率。结果见表3：加样回收率平均值为100.02％，RSD％为1.07，高、中、低三个浓度测得的回收率均符合含量测定要求。

表3薏苡素HPLC含量测定方法加样回收率实验结果

4.样品测定

称取一项制备的薏苡素-HP-β-CD包合物12.02mg，按2.3项下①制备供试品溶液，按1.项色谱条件进样三次，记录薏苡素的峰面积，取平均值为578678，按3.3项下标准曲线计算制备的包合物产品含薏苡素4.83％；称取一项制备的薏苡素-HP-β-CD包合物11.98mg，按2.3项下②制备供试品溶液，按1.项色谱条件进样三次，记录薏苡素的峰面积，取平均值为491337，按3.3项下标准曲线及制备的包合物薏苡素含量计算包合物的平均包合率：包合率＝﹝被包合的薏苡素质量/(被包合的薏苡素质量+未被包合而游离的薏苡素质量)﹞×100％＝﹝0.4998/(0.4998+0.0788)﹞×100％＝86.38％。

四、薏苡素-HP-β-CD包合物与薏苡素体外释放比较

采用透析袋(截留分子量为8000～14000)法考察薏苡素及薏苡素-HP-β-CD包合物体外释药情况。取10mg薏苡素和207mg薏苡素-HP-β-CD包合物(含薏苡素10mg)置于同样条件的两个透析袋中，分别加5mL pH6.5的磷酸盐缓冲溶液PBS，将含药透析袋置于装有40mLPBS缓冲液的EP管中并在37℃的恒温振荡器中振荡。分别于1min、5min、10min、20min、40min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h取3mL，并补充等量同质同温的缓冲液，用0.22μm微孔滤膜滤过，采用HPLC法检测，计算EP管溶液中薏苡素浓度，计算药物累计释放率＝(药物累计释放量/药物总质量)×100％，结果见图13：横坐标为时间，纵坐标为累计释药百分率。图13显示各取样时间点薏苡素-HP-β-CD包合物中薏苡素向EP管中扩散的量始终均高于游离薏苡素，8、10、12h各点，薏苡素-HP-β-CD包合物体外累计释放百分率为(80.19±2.39)％，是薏苡素体外累计释放百分率(31.47±2.0)％的2.55倍，说明HP-β-CD将薏苡素包合后，能有效促进薏苡素的水溶解度，从而显著增加其在pH＝6.5PBS缓冲溶液中的释放速率和释放程度。

五、薏苡素-HP-β-CD包合物药动学及组织分布实验

根据2015年版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》相关内容，本实验将薏苡素及其包合物经灌胃给药后，测定其在大鼠体内的血药浓度和各组织中的浓度，计算相关的药动学参数和相对生物利用度，对其大鼠体内的药动学规律及组织分布情况进行比较。

采用HPLC测定生物样品中薏苡素的含量，为更有效地避免生物组织中繁杂成分的干扰，采用内标法(斑蝥素为内标物)进行定量分析并对该方法的专属性、精密度、稳定性等进行考察。

1.动物

SD大鼠(200±10g)，雌雄各半，扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号为SCXK(苏)2017-0007，实验前常规饲养一周。

2实验方法与结果

2.1建立生物样品中薏苡素的HPLC测定方法

2.1.1溶液配制

薏苡素对照品储备溶液：精密称取薏苡素标准品10mg，置于25mL棕色容量瓶，用流动相定容至刻度，配制成400μg/mL薏苡素的标准储备液，于4℃冷藏保存，备用。

薏苡素系列标准溶液：精密吸取薏苡素对照品储备溶液适量，流动相稀释配制成浓度为0.5、1.25、2.5、5、10、25、50、75、100、200、400μg/mL的薏苡素系列标准溶液，4℃保存，备用。

内标溶液：精密称取内标物质斑蝥素对照品7.5mg于25mL容量瓶中，流动相溶解并定容，得300μg/mL的斑蝥素储备液，4℃保存，备用。

2.1.2空白生物样品采集

空白血浆：大鼠常规性饲养一周，自由进食饮水，实验前1天禁食不禁水12h，眼眶静脉丛取血，将全血置于肝素管中，于10000rpm离心10min分离得大鼠空白血浆，-20℃保存备用。

空白组织：大鼠常规性饲养一周，自由进食饮水，实验前1天禁食不禁水12h后处死，取出大鼠各组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)，用生理盐水冲洗各组织表面血液后用滤纸吸干表面水分，称取重量后按质量(g)︰体积(mL)＝1︰4加入4倍生理盐水，高速匀浆机匀浆组织样品后分装于5mL离心管，于10000rpm离心10min，吸取上清液，-20℃保存备用。

2.1.3大鼠血浆及组织标准溶液的配制

大鼠血浆标准溶液：取大鼠空白血浆300μL置于1.5mL离心管中，加入2.1.1项下所配制的浓度为2.5、10、25、50、100、200、400μg/mL薏苡素标准品溶液20μL，使血浆中药物浓度分别为0.16、0.63、1.56、3.13、6.25、12.50、25μg/mL，即得薏苡素大鼠血浆标准溶液，备用。

大鼠组织标准溶液：取大鼠空白组织匀浆上清液300μL置于1.5mL离心管中，加入2.1.1项下所配制的浓度为0.5、1.25、2.5、5、10、25、50μg/mL薏苡素标准品溶液20μL，使各组织样品中药物浓度分别为0.03、0.08、0.16、0.31、0.63、1.56、3.13μg/mL，即得薏苡素大鼠组织标准溶液，备用。

2.1.4生物样品的处理溶液

大鼠血浆样品：取薏苡素大鼠血浆样品上清液置于1.5mL离心管，加内标溶液(300μg/mL，斑蝥素)80μL，加入乙腈600μL，涡旋混合2min，于10000rpm离心10min，吸取上清液，用0.22μm滤膜过滤，待测。

大鼠组织样品：取薏苡素大鼠组织样品上清液置于1.5mL离心管，加内标溶液(300μg/mL，斑蝥素)80μL，加入乙腈600μL，涡旋混合2min，于10000rpm离心10min，吸取上清液，用0.22μm滤膜过滤，待测。

2.1.5色谱条件

色谱柱：Symmetry C18(5μm 4.6×250mm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水溶液，等度洗脱：A∶B＝30∶70；流速：1.0mL/min；柱温：25±5℃；检测波长：232nm；进样量：20μL。

2.1.6方法学验证

2.1.6.1专属性

分别取大鼠空白血浆及空白组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)，按照2.1.4项处理(不加内标)，配制成空白血浆及空白组织样品；分别取300μL大鼠空白血浆及空白组织加入20μL薏苡素标准品溶液，按照2.1.4项处理，配制成含药血浆及组织样品；薏苡素及其包合物灌胃给药后，取大鼠血浆及组织脏器，按照2.1.4项处理，配制成给药后血浆及组织样品。

上述样品，按2.1.5项进样分析，记录薏苡素和斑蝥素(内标)的保留时间，考察代谢产物和内源性物质是否对药物和内标的测定产生干扰，结果见图14～20，各图谱显示，在所建立的色谱条件下，薏苡素峰与内标峰的分离度及峰形均良好，标准对照及大鼠血浆和各组织中薏苡素及内标物的保留时间分别约为7.136～7.160min、14.036～14.073min范围内，内源性物质对样品的检测无干扰，方法专属性良好，可用于大鼠血浆及各组织样品中薏苡素的含量测定。

2.1.6.2标准曲线

分别取2.1.3项下配制的大鼠血浆标准溶液及组织标准溶液，按照2.1.4项处理，按2.1.5项进样分析，记录薏苡素峰面积Acoixol与内标峰面积AIS，计算薏苡素与内标峰面积比值Y(Acoixol/AIS)，以薏苡素血浆浓度或组织浓度x为横坐标，峰面积比值Y为纵坐标进行线性回归，建立标准曲线，见表4。

表4薏苡素生物样品(大鼠血浆及组织)中的标准曲线

结果表明，大鼠血浆及组织脏器中薏苡素在相应的浓度范围内，所建立的标准曲线线性关系良好，可用于薏苡素的体内分析。

2.1.6.3精密度试验

分别吸取2.1.1项下配制的2.5、100、400μg/mL三种浓度薏苡素标准溶液20μL，各加入大鼠空白血浆300μL，涡旋混合，配成血浆浓度分别为0.16、6.25、25μg/mL；分别吸取2.1.1项配制的0.5、5、50μg/mL三种浓度薏苡素标准溶液20μL，各加入大鼠空白组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)300μL，涡旋混合，配成各组织匀浆浓度分别为0.03、0.3.13μg/mL。按照2.1.4项处理，按2.1.5项进样分析，同一天内各测3次，连续测定3天，记录薏苡素与内标的峰面积，以内标法定量，考察日内、日间精密度，结果见表5。

表5薏苡素生物样品日内、日间精密度结果(n＝3)

薏苡素在大鼠血浆及组织脏器中精密度考察结果表明，低、中、高浓度的日内精密度RSD为1.77～7.46％，日间精密度RSD为1.86～8.86％，满足生物样品含量测定的要求，表明该方法精密度良好。

2.1.6.4稳定性试验

取2.1.6.3项下配制的浓度分别为0.16、6.25、25μg/mL大鼠血浆溶液和浓度分别为0.03、0.31、3.13μg/mL各组织匀浆溶液各3份。经2.1.4项处理后分别于4℃保存24h、反复冻融3次后，按2.1.5项进样分析，记录薏苡素与内标的峰面积，以内标法定量，考察稳定性，结果见表6。

表6薏苡素生物样品在不同条件下的稳定性(n＝3)

稳定性试验结果表明，大鼠血浆及各组织中薏苡素的室温稳定性及冻融稳定性RSD均小于10％，符合生物样品稳定性要求，说明薏苡素生物样品稳定性良好。

2.1.6.5回收率试验

取2.1.6.3项下配制的浓度分别为0.16、6.25、25μg/mL大鼠血浆溶液和浓度分别为0.03、0.31、3.13μg/mL各组织匀浆溶液各3份。按照2.1.4项处理，按2.1.5项进样分析，记录薏苡素峰与内标峰面积。按公式：方法回收率(％)＝(样品测得量/实际加入量)×100％，分别计算生物样品低、中、高浓度的回收率，平行测定3次，结果见表7。

表7大鼠血浆和各组织中薏苡素的回收率(n＝3)

回收率试验结果表明，大鼠血浆及各组织中回收率在90％～106％，RSD值均小于7％，符合生物学样品测定的要求。

2.2薏苡素包合物大鼠药动学实验

2.2.1动物分组及给药

分组：12只雄性SD大鼠，适应实验环境三天。随机分为两组，薏苡素组和薏苡素包合物组，每组6只。给药前禁食12h，自由饮水。

给药：按100mg/kg薏苡素剂量，灌胃给与薏苡素(水分散)和薏苡素包合物(水溶解)。

2.2.2药动学实验方法

给药后5min、10min、15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h眼眶静脉丛取血约0.5mL，将全血置于肝素管中，于10000rpm离心10min，吸取上层血浆，按照2.1.4项处理，按2.1.5项进样分析，记录峰面积，计算薏苡素与内标峰比，代入标准曲线，计算薏苡素血药浓度。以取样点时间(t)为横坐标，薏苡素血药浓度为纵坐标，绘制药时曲线。

2.2.3药动学数据处理

采用Microsoft Excel对所测得的数据进行整理分析，用药物动力学分析软件DAS2.0对大鼠体内的药动学数据进行拟合处理，求出相关药动学参数，实验数据均以平均值±SD表示，见表8和表9。

表8薏苡素及其包合物大鼠灌胃给药后血药浓度(平均值±SD，n＝6)

注：ND为未检测到药物浓度

表9薏苡素及其包合物大鼠灌胃给药药动参数(平均值±SD，n＝6)

注：与薏苡素组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

薏苡素及其包合物灌胃给药后，将各个时间的药时数据(表8～9)采用DAS 2.0软件进行处理，经模型拟合，得到大鼠体内药时曲线见图21，对大鼠个体进行二室模型分析，计算出大鼠血浆中的药动学参数结果见表9。大鼠灌胃薏苡素后，达峰浓度Cmax为14.90±2.82μg/mL，消除半衰期t1/2Z为0.83±0.44h，平均滞留时间MRT(0～10)为1.00±0.13h，时间-血药浓度曲线下面积AUC(0～10)为15.51±3.79μg/L·h。大鼠灌胃薏苡素包合物后，达峰浓度Cmax为17.48±2.33μg/mL，消除半衰期t1/2Z为1.97±0.63h，平均滞留时间MRT(0～10)为2.37±0.23h，较薏苡素组明显延长(p＜0.01)，时间-血药浓度曲线下面积AUC(0～10)为35.60±6.09μg/L·h，较薏苡素组明显延长(p＜0.01)。结果表明：薏苡素制成包合物后可增加其在体内的吸收能力；同时也减慢消除速度，延长体内的作用时间，增加药效。

2.3薏苡素包合物大鼠组织分布研究

按照2.2.1项下方法给药后，于0.25h、0.5h、1h、3h、6h、10h处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑各组织，分别用生理盐水冲洗后，滤纸吸干表面水分，称重，加入4倍量生理盐水匀浆，于10000rpm离心10min，吸取组织上清液，按2.1.4处理后进样分析，记录峰面积，代入标准曲线计算药物于各个时间点在心、肝、脾、肺、肾、脑中含量(μg)，再根据大鼠各个脏器的重量，换算为各组织中浓度(μg/g)，结果见表10、11和图22，图22中纵坐标是组织中薏苡素浓度。

表10大鼠灌胃给药薏苡素后各时间点组织中药物浓度(平均值±SD，n＝6)

表11大鼠灌胃给药薏苡素包合物后各时间点组织中药物浓度(平均值±SD，n＝6)

综合上述图表，薏苡素及薏苡素包合物灌胃给药后在大鼠体内的组织分布有如下特点：薏苡素及包合物在各组织器官中药物浓度大小依次为：肾>肝>脾>心>肺>脑。在0.25h时，包合物组在各组织中的浓度均低于薏苡素组；在0.5h时，包合物组在各组织中的浓度较薏苡素组快速升高；在1h后，包合物组在各组织的浓度均高于薏苡素组；在6h时，薏苡素组的心、脾、肺、脑中药物浓度已低于检测限；而包合物组的各组织中药物浓度均能检测到。此外，薏苡素组在0.25h时各组织中药物浓度达到最大值；而包合物组在0.5h时各组织(除肾)中薏苡素浓度达到最大值。总的趋势来看，薏苡素组及包合物组在肾、肝中药物含量明显大于其它脏器，包合物在肾中的含量下降速度比薏苡素的缓慢。值得注意的是，脑组织中也能检测到薏苡素的含量，薏苡素在脑部的含量随时间延长迅速下降，而薏苡素包合物下降速度缓慢说明包合物可减缓药物在脑部的消除速度，增加其在脑部的滞留时间，提示“康莱特注射液”对癌患的镇痛作用很有可能是所含成分薏苡素所为。

为避免生物体内繁杂成分干扰和消除测定不稳定因素，选择内标法进行色谱定量分析，根据薏苡素的理化性质，选择与它结构相似、保留时间相接近、能达到基线分离的化合物作为内标。预实验在流动相(乙腈︰0.1％磷酸水溶液＝30︰70)下考察了备选内标物黄芩素、槲皮素、芹菜素、斑蝥素等化合物，其中斑蝥素的峰形较好、无干扰，保留时间与薏苡素接近且性质稳定，因此选择斑蝥素作为薏苡素定量的内标物。

考虑到动物之间个体差异较大，为了减少误差，本实验选择大鼠为实验动物，尽量在从同一只多次取样，进行血药浓度和组织分布实验。在进行灌胃给药预实验时，曾选用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿-异丙醇(氯仿:异丙醇＝95︰5，V/V)等多种提取剂对血浆及组织中薏苡素进行提取。结果发现，甲醇、乙酸乙酯提取率都小于50％，氯仿-异丙醇的提取率介于25～75％之间，误差较大，而乙腈的平均提取率大于90％，故本实验采用乙腈沉淀法提取血浆及各组织中薏苡素。

本实验采用DAS 2.0软件对薏苡素的血药浓度-时间数据进行分析，结果表明薏苡素经HP-β-CD包合后可以提高其口服生物利用度。薏苡素包合物给药后的达峰血药浓度Cmax(17.48±2.33μg/mL)与薏苡素给药后的Cmax(14.90±2.82μg/mL)相比有所提高。薏苡素包合物给药4h后的血药浓度(2.90±0.68μg/mL)均远远大于薏苡素的血药浓度(0.32±0.20μg/mL)。薏苡素包合物在大鼠体内的药时曲线下面积AUC(0～10)显著提高(p＜0.01)，是薏苡素的232.83％。此外，与薏苡素的消除半衰期t1/2Z(0.83±0.44h)相比，薏苡素包合物的消除半衰期t1/2Z(1.97±0.63h)显著延长(p＜0.01)，平均滞留时间MRT(0～10)显著延长(p＜0.01)。结果表明：经HP-β-CD包合后可增加薏苡素在体内的吸收，同时也能减慢薏苡素在体内的消除速度，延长其在体内的作用时间。

本实验还考察了大鼠灌胃给药后，薏苡素及其包合物在各组织中的分布规律。结果显示：大鼠灌胃给药后，药物在各组织中分布随着时间而变化，薏苡素及包合物在各组织器官中药物浓度大小依次为：肾>肝>脾>心>肺>脑。在0.25h时，包合物组在各组织中的浓度均低于薏苡素组；在0.5h时，包合物组在各组织中的浓度升高速率较薏苡素组为快；在1h后，包合物在各组织的浓度均高于薏苡素组；在6h时，薏苡素组的心、脾、肺、脑中药物浓度已低于检测限；而包合物组的各组织中药物浓度均能检测到。此外，薏苡素组在0.25h时各组织中药物浓度达到最大值；而包合物组在0.5h时各组织(除肾)中薏苡素浓度达到最大值。通过对比可以说明HP-β-CD可提高薏苡素在组织脏器中的浓度，延迟药物浓度的达峰时间从而延缓薏苡素在体内的释放；包合物组在各组织中的含量下降速度比薏苡素组的缓慢，说明制成包合物后可延缓薏苡素在体内的消除过程。

在各种组织脏器中，薏苡素及其包合物均趋于向肾、肝中分布，且在肾、肝中药物含量显著大于其他脏器；薏苡素在肾中含量下降迅速，而包合物在肾中的含量下降速度缓慢，说明将薏苡素制成包合物后可延缓其在体内的代谢消除。特别值得注意的是，脑组织中也能检测到薏苡素的含量，说明薏苡素能透过血脑屏障，提示薏苡素可能作用于脑部的中枢神经而发挥镇痛作用；制成包合物后薏苡素在脑部含量随时间延长缓慢下降，说明包合物可延长薏苡素在脑部的滞留时间。

六、薏苡素-HP-β-CD包合物对人非小细胞肺癌A549的体外抑制作用

(一)细胞系

人非小细胞肺癌购自中科院上海研究所。

(二)溶液的配制

1.薏苡素溶液的配制

精密称取薏苡素49.52mg，使用0.1mlDMSO助溶，加14.89ml培养基，得薏苡素浓度为0.1211mg/L的薏苡素原料药母液，分别精密吸取上述溶液62.5、125、250、500μL于50mLEP管中，分别加49.9375、49.875、49.75、49.5ml培养基稀释，得薏苡素浓度为0.1514、0.3028、0.6055、1.211μg/L薏苡素溶液，于4℃保存。

2.薏苡素包合物溶液的配制

精密称取薏苡素包合物1024.84mg(含薏苡素49.50mg)，加14.98ml培养基，得薏苡素浓度为0.1211mg/L的薏苡素包合物母液，分别精密吸取上述溶液62.5、125、250、500μL于50mL EP管中，分别加49.9375、49.875、49.75、49.5ml培养基稀释，得薏苡素浓度为0.1514、0.3028、0.6055、1.211μg/L的薏苡素包合物溶液，于4℃保存。

3.PBS的配制

将0.2g KH₂PO₄；0.2g KCl；1.54g Na₂HPO₄·12H₂O和8g NaCl全部溶于超纯水中，定容到1L，高压后经0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃保存。

4.MTT的配制

称取0.5g MTT粉末全部溶于PBS中，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，于-20℃避光保存。

(三)实验方法与结果

1.MTT实验

取对数生长期的A549细胞，消化并吹打细胞成单悬液，通过细胞计数调整细胞浓度，按照每孔4000个细胞种入96孔板，放细胞培养箱培养过夜。细胞完全贴壁后，分别将薏苡素浓度为0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L的薏苡素、薏苡素包合物培养基溶液按照每孔100μL加入对应孔中，每组设置5个复孔，平行条件下铺三块板子。在药物孵育24，48，72h后，每孔加入10μL MTT试剂(5mg/mL)。将板放回细胞培养箱培养4h，吸去上层培养基，每孔加入100μL的DMSO试剂，置于摇床轻轻摇晃10min，使蓝色结晶完全溶解，570nm波长下酶标仪检测，结果见表12、13和图23，图23中纵坐标是细胞生长抑制率，横坐标是薏苡素浓度。

表12薏苡素对A549细胞生长抑制的影响(x±s，n＝3)

表13薏苡素包合物对A549细胞生长抑制的影响(x±s，n＝3)

注：与薏苡素组比较*P＜0.05，**P＜0.01

MTT结果显示不同浓度的薏苡素对人肺癌A549的增殖生长均有一定的抑制作用，其抑制率与薏苡素的给药剂量浓度及作用时间都呈现了明显的依赖性变化趋势。Graphpad软件的统计分析表明，薏苡素及其包合物作用于A549细胞24、48、72h的IC50分别为3.008μg/L、1.326μg/L、0.592μg/L和1.244μg/L、0.616μg/L、0.254μg/L。与薏苡素组相比，同剂量的薏苡素包合物组对A549细胞的生长抑制作用明显提高，且均具有统计学意义(P＜0.05)。因薏苡素在形成包合物后溶解度显著提高，更容易通过细胞膜被摄取进细胞内。在药物作用24小时后，与薏苡素组相比，薏苡素包合物对A549细胞生长抑制作用更显著(P＜0.01)，且IC50为1.244μg/L，因此选择0.3028、0.6055、1.211μg/L三种浓度作用24h进行后续实验。

2.细胞凋亡实验

2.1Hoechst染色实验

取对数生长的A549细胞，消化并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，按每孔2mL接种至6孔板中，放回细胞培养箱培养过夜。待细胞完全贴壁后，分别将薏苡素浓度为0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L的薏苡素及包合物的培养基溶液按照每孔2mL的体积加入孔中，孵育24h后吸去上层培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞表面，重复三次，然后每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛完全覆盖细胞表面，固定30min后吸去上清，PBS洗去固定液。每孔加入0.1ml的Hoechst33258染色液，室温避光染色10min，再用PBS洗去染色液，紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察，结果见图24和图25。

经过Hoechst33258荧光染色，在荧光显微镜下可见A549细胞的细胞核均被染上荧光，除了空白对照组，在不同浓度的薏苡素及其包合物作用后，其他组均生成不同数量的凋亡小体，凋亡小体的数量与浓度呈正相关的关系，这说明薏苡素能够诱导A549发生凋亡，从而抑制A549生长。同时可以观察到在相同剂量下，相较于薏苡素组，薏苡素包合物组生成了更多的凋亡小体，表明形成包合物后显著提高了薏苡素对A549细胞的促凋亡作用。

2.2细胞凋亡率的检测

取对数生长的A549细胞，消化并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，按每孔2mL接种至6孔板中，放回细胞培养箱培养过夜。待细胞完全贴壁后，分别将含不同浓度(0.1514、0.3028、0.6056、1.2112μg/L)的薏苡素及包合物的培养基按照每孔2mL的体积加入孔中，孵育24h，收集悬浮细胞后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，2000rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞2次。加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，转移至流式管中，在避光的环境下分别加入5μL Annexin V-FITC，5μL PI染色液，充分混匀后使用流式细胞仪进行进样检测，用flowjo软件进行数据分析，计算细胞凋亡率，结果见图26、27和28。图26和27为A549细胞凋亡的流式细胞图；图28为薏苡素及其包合物对A549细胞凋亡率的影响数据处理图示，纵坐标为凋亡率。

实验结果显示，薏苡素及薏苡素-HP-β-CD包合物作用于A549细胞后，细胞的早期凋亡和晚期凋亡比率随薏苡素浓度升高呈现出依赖性增加，表明薏苡素对A549的增殖抑制作用与其诱导细胞凋亡有关。同时可以发现在相同剂量下，与薏苡素组相比，薏苡素-HP-β-CD包合物诱导A549细胞凋亡更加明显，且均具有统计学意义(P＜0.01)，表明形成包合物后显著提高了薏苡素对A549细胞的促凋亡作用。

Claims (6)

1.薏苡素制剂的特征在于它是薏苡素羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合物冻干粉，其有效成份薏苡素含量≥3％，薏苡素被HP-β-CD包合的包合率≥65％。

2.如权利要求1所述薏苡素制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)定量称取HP-β-CD加到一定量蒸馏水中，恒温磁力搅拌至溶解，得一定浓度的HP-β-CD溶液；

2)定量称取薏苡素，用少量无水乙醇溶解后滴入1)项制备的HP-β-CD溶液中，继续恒温磁力搅拌得薏苡素HP-β-CD包合物溶液；

3)将2)项制备的薏苡素HP-β-CD包合物溶液分装在西林瓶中，放入冰箱中预冻后冷冻干燥得薏苡素HP-β-CD包合物冻干粉即为薏苡素制剂。

3.根据权利要求2所述薏苡素制剂的制备方法，其特征在于所述步骤1)中HP-β-CD溶液的浓度≥50％；恒温的温度是50℃～60℃；搅拌的速率是300r/min～600r/min。

4.根据权利要求2所述薏苡素制剂的制备方法，其特征在于所述步骤2)中，用于溶解薏苡素的无水乙醇的质量是薏苡素质量的5～8倍；称取的薏苡素质量是HP-β-CD质量的3.5％～7.5％；恒温的温度是50℃～60℃；搅拌的速率是300r/min～600r/min；搅拌的时间是2～5h。

5.根据权利要求2所述薏苡素制剂的制备方法，其特征在于所述步骤3)中，薏苡素HP-β-CD包合物溶液在瓶体直径2cm、容积10ml的西林瓶中分装质量为3～5g；预冻温度为-45℃～-75℃，预冻时间为2～5h；升华干燥的温度为-50℃～-20℃，冻干时间为36～48h；冻干室操作压力为45Pa。

6.根据权利要求2所述薏苡素制剂的制备方法，其制剂产品得率≥75％。