CN108956968A - 诊断增殖性紊乱的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及诊断增殖性紊乱的方法。具体地，本申请涉及诊断和/或预测增殖性紊乱尤其是脑癌(例如胶质瘤)的方法。特别地，本申请提供了仅通过测定或分析血液(特别是血清)便利地检测恶性肿瘤的方法。血清中的细胞因子和/或血管生成因子已经被发现在表明受试者中脑癌的存在方面是出人意料地强大的。此外，血液样品的光谱分析尤其是ATR‑FTIR分析已经被展示在产生可以与受试者中恶性肿瘤的存在、程度、严重性或侵袭性关联的特征方面是出人意料地有效的。

Description

诊断增殖性紊乱的方法
本申请是申请日为2013年11月14日，申请号为201380070471.3，发明名称为“诊断增殖性紊乱的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及诊断和/或预测增殖性紊乱尤其是脑癌例如胶质瘤的方法。本发明还涉及相关的诊断试剂盒和有关的分析工具(例如数据库、计算机软件等)。
背景技术
增殖性紊乱例如癌症由不受控制的和不受调节的细胞增殖引起。这样的细胞增殖可以导致相关受试者中的肿瘤形成。
通常，肿瘤例如脑肿瘤最初在临床上通过多种熟知的预筛成像技术的方式在受试者中被鉴定出，所述预筛成像技术例如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、X-射线和正电子放射成像(PET)。然而，这样的成像技术考虑到设备自身和操作其所需要的人力资源的高成本，部署是昂贵的。一些这样的成像技术需要有高等资质的专业人员的复杂操作，并且一些在可以得出结论之前需要耗时的分析。此外，如果有的话，这样的技术很少区分良性和恶性肿瘤。这样，总是需要最终的活组织检查以确认给定的肿瘤的恶性或良性。
活组织检查需要侵入性手术以提取相关组织样品。在脑肿瘤的情况下，活组织检查通常需要钻孔进入受试者的颅骨，其是高度危险的且需要技能的外科手术操作。经历这样的活组织检查的受试者之后通常需要住院两至三天，其提出不期望的护理负担。活组织检查被成功执行之后，在相关肿瘤的恶性或良性被实际确定之前可能耗费很长一段时间。
因此，提供有成本效益的、需要最少的人力资源和技术来操作并且不包括耗时分析的预筛工具是高度期望的。此外，提供有助于以适当的高准确度而没有活组织检查固有的缺点的相对快速确定肿瘤的恶性或良性的预筛技术是期望的。
在近期，血液中的多种生物标志物已经被鉴定为特定疾病的有用指示物。例如，细胞因子、趋化因子和生长因子是介导一系列生理反应的细胞信号蛋白，并且与多种疾病相关。这样的分子通常通过生物测定或免疫测定来检测，生物测定或免疫测定二者考虑到通常一次仅可以分析一种分析物而可能是耗时的。然而，在更近的时期，被设计以测量如血清、血浆和组织培养物上清液的多种基质中的多种细胞因子、趋化因子和生长因子的基于磁珠的多重测定方法已经变得更易于以试剂盒，例如Bio-Plex ProTM(参见Bio-Plex ProTMAssay Handbook-http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/ 10014905.pdf)获得。然而，与特定生物标志物与特定疾病的关联有关的复杂性已经推迟了医学诊断领域的发展，并且这样的关联目前是固有地不可预测的。此外，这样的测定依旧需要合理水平的技术，并且这样的测定也破坏调查中的样品，使得对同一样品进行重复测定是不可能的。因此结果的验证是更难的。
在医学诊断领域中的其他发展中，最近研究已经显示红外(IR)光谱法在血清分析以区分心肌梗塞与其他胸痛中的潜力[Petrich W,Lewandrowski KB,Muhlestein JB,Hammond MED,Januzzi JL,Lewandrowski EL,Pearson RR,Olenko B,Fruh J,Haass M,Hirschi MM,Kohler W,Mischler R,Mocks J,Ordonez-Llanos J,Quarder O,Somorjai R,Staib A,Sylven C,Werner G,Zerback R Analyst,134(6),2009；1092-1098]。如果诸如此类的光谱诊断方法可以在临床上是可行的，其对于临床医生和患者则可以是高度期望的，因为它们潜在地提供非破坏性、快速、有成本效益的、易于操作的床旁(point-of-care)状况诊断。然而，目前看来，考虑到面对样品方差时其可疑的可靠性，这样的光谱诊断技术的适用性在某些范围中是稍微受限的。
发明内容
因此，本发明的目的是解决现有技术所固有问题的至少一种。另一个目的是提供简单的、可靠的和有成本效益的床旁诊断方法，所述方法需要最少的人力资源和技术来操作，是不耗时的，并且所述方法有助于以适当的高准确度快速确定肿瘤的恶性/良性。
根据本发明的第一方面，提供了一种诊断和/或预测受试者中脑癌的方法，所述方法包括在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定受试者的血液样品(或其组分)。
根据本发明的第二方面，提供了一种诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的方法，所述方法包括对所述受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征。
根据本发明的第三方面，提供了一种检测受试者中癌细胞的方法，所述方法包括第一方面或第二方面的诊断和/或预测脑癌或增殖性紊乱的方法的步骤。
根据本发明的第四方面，提供了一种诊断肿瘤(合适地脑瘤，例如胶质瘤)是恶性的还是良性的方法，所述方法包括第一方面或第二方面的诊断和/或预测脑癌或增殖性紊乱的方法的步骤。
根据本发明的第五方面，提供了一种监测受试者对增殖性紊乱的手术或治疗性处理的反应性的方法，所述方法包括第一方面或第二方面的诊断和/或预测脑癌或增殖性紊乱的方法的步骤。
根据本发明的第六方面，提供了用于诊断和/或预测受试者中脑癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括被配置以接收来自受试者的血液样品(或其组分)并且在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述血液样品(或其组分)的装置；和将所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地，与前述提到的相同)。
根据本发明的第七方面，提供了用于诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括被配置以接收来自受试者的血液样品(或其组分)并且对所述受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生血液样品(或其组分)特有的光谱特征的装置；和将所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地，与前述提到的相同)。
根据本发明的第八方面，提供了来自在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定受试者的血液样品(或其组分)的数据用于确定受试者中脑癌的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的用途。
根据本发明的第九方面，提供了受试者的血液样品(或其组分)的光谱特征用于确定受试者中增殖性紊乱的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的用途。
根据本发明的第十方面，提供了数据库，所述数据库包括多个数据集，每一个集与特定受试者的特定血液样品(或其组分)中的一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子有关，每一个集与涉及所述特定受试者中的脑癌的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
根据本发明的第十一方面，提供了数据库，所述数据库包括多个光谱特征，每一个特征与特定受试者的特定血液样品(或其组分)有关，每一个特征被与涉及所述特定受试者中的增殖性紊乱的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
根据本发明的第十二方面，提供了计算机可读介质(例如光盘)，所述计算机可读介质包括如本文定义的数据库。
根据本发明的第十三方面，提供了安装有诊断计算机软件的计算机，所述诊断计算机软件被配置以操作计算机基于受试者的血液样品的光谱特征执行与增殖性紊乱有关的预测性诊断和/或预测。
根据本发明的第十四方面，提供了计算机可读介质，所述计算机可读介质含有如本文定义的诊断计算机软件。
合适地，增殖性紊乱是癌症，合适地人类癌症，合适地脑癌(和/或相关的肿瘤)。
与本发明的一个方面有关的特征(包括任选的、合适的和优选的特征)也可以是与本发明的任何其他方面有关的特征(包括任选的、合适的和优选的特征)。
具体地，本申请提供了以下内容：
项目1.一种诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的方法，所述方法包括对所述受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征；其中所述光谱分析是衰减全反射FTIR(ATR-FTIR)，其中在IR分析期间，“ATR晶体”支持所述血液样品。
项目2.如项目1所述的方法，其中被诊断和/或预测的所述增殖性紊乱是脑癌(和/或相关的肿瘤)。
项目3.如项目2所述的方法，其中所述脑癌是胶质瘤。
项目4.如项目1至3中任一项所述的方法，其中所述血液样品的膜在FTIR分析之前被施加至所述ATR晶体的表面。
项目5.如项目4所述的方法，所述方法包括将0.5-1.5μL所述血液样品沉积在ATR晶体的表面上并且允许所述血液样品干燥以产生合适厚度的血液样品膜。
项目6.如项目4所述的方法，其中干燥在标准的环境温度和压强(SATP)下持续4和16分钟之间或在产生相同干燥水平的其他等效条件下实现。
项目7.如项目4至6中任一项所述的方法，其中所述血液样品膜具有在+/-40μm或更小的公差内的基本上均一的厚度。
项目8.如项目4至7中任一项所述的方法，其中所述血液样品膜跨所述ATR晶体的所述表面(或至少其暴露至IR分析的部分)具有在1和200μm之间的最大膜厚度(即，最大厚度的点)。
项目9.如任一前述项目所述的方法，其中所述血液样品特有的所述光谱特征(即，特征区)是在900和1800cm-1之间的光谱。
项目10.如任一前述项目中任一项所述的方法，其中将光谱获得的特征与数据库(例如“训练集”)中储存的多个预先关联的特征比较，以便得出与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联。
项目11.如任一前述项目中任一项所述的方法，其中基于通过“训练”(例如通过模式识别算法)预先关联的分析物的数据库开发的预测模型将光谱获得的特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
项目12.如任一前述项目所述的方法，其中所述血液样品是血清或血浆。
项目13.如项目12所述的方法，其中所述血液样品是血清。
项目14.如项目13所述的方法，其中所述血清是人全血清。
项目15.如任一前述项目所述的方法，其中所述方法另外包括在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述受试者的血液样品(或其组分)。
项目16.一种诊断和/或预测受试者中脑癌的方法，所述方法包括在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述受试者的血液样品(或其组分)。
项目17.如项目15或16中任一项所述的方法，其中所述细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、Exotaxin、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、ICAM-1、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL、VCAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、IGFBP-1、IL-18、PAI-1、VEGF C的人细胞因子和/或血管生成因子；或选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、Exotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-α、IL-15、IL-18、碱性FGF、LIF、M-CSF、MIG、MIP-2、PDGF-BB、VEGF的小鼠细胞因子和/或血管生成因子。
项目18.如项目15至17中任一项所述的方法，其中所述细胞因子和/或血管生成因子分析物选自IL-8、IL-10、IFN-γ、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF、FGF。
项目19.如项目15至18中任一项所述的方法，其中所述细胞因子和/或血管生成因子分析物选自IL-8、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF、FGF。
项目20.如项目15至19中任一项所述的方法，所述方法还包括将与所述血液样品(或其组分)的测定/分析相关的分析结果/数据与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
项目21.如项目20所述的方法，其中将所述分析结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联包括所述分析结果与参考标准或与已经与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果预先关联的之前的分析结果(例如储存在数据库中的预先关联的分析结果)的初始比较。
项目22.如项目15至21中任一项所述的方法，其中所述血液样品用免疫测定来测定。
项目23.如项目15至22中任一项所述的方法，其中所述血液样品使用被设计以测量多种细胞因子和/或血管生成因子的基于磁珠的多重测定来测定。
项目24.如项目23所述的方法，其中所述测定合适地使用多种荧光染色的珠以在单个测定(例如单个孔)中同时检测多种细胞因子和/或血管生成因子。
项目25.一种诊断肿瘤是恶性的还是良性的方法，所述方法包括根据项目1至24中任一项所述的诊断和/或预测脑癌或增殖性紊乱的方法的步骤。
项目26.一种用于诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括被配置以接收来自所述受试者的血液样品(或其组分)并且对所述受试者的所述血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征的装置；和将所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地，与被配置以接收血液样品的所述装置相同)；其中所述光谱分析是衰减全反射FTIR(ATR-FTIR)，其中在IR分析期间，“ATR晶体”支持所述血液样品。
项目27.一种用于诊断和/或预测受试者中脑癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括被配置以接收来自所述受试者的血液样品(或其组分)并且在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述血液样品(或其组分)的装置；和将所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地，与被配置以接收血液样品的所述装置相同)。
项目28.如项目26至27中任一项所述的诊断试剂盒，其中用于测定或分析所述血液样品的所述装置与用于关联所述结果或有助于所述结果的关联的所述装置相同。
项目29.如项目26至28中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述关联装置包括计算机或与计算机通讯，所述计算机安装有诊断计算机软件，所述诊断计算机软件被配置以操作所述计算机基于受试者的血液样品的光谱特征执行与增殖性紊乱有关的预测性诊断和/或预测。
项目30.如项目26至29中任一项所述的诊断试剂盒，其中被配置以接收血液样品的所述装置被配置以自动制备需要的厚度和干燥的血液样品(或其组分)。
项目31.一种方法或诊断试剂盒，所述方法或诊断试剂盒基本上如上文参考实施例和附图所描述的。
附图说明
本发明的实施方案在下文进一步参考附图被描述，其中：
图1至7分别显示了关于IL-8、血管生成素、卵泡抑素、HGF、瘦蛋白、PDGF-BB和PECAM-1的“对照均值”(浅灰)和“胶质瘤均值”(深灰)以及误差线的图形表示。
图7A至7F分别显示了关于FGF、G-CSF、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素和sVEGFR1的“对照均值”(深灰-左)、“低级别胶质瘤均值”(浅灰-中)以及“高级别胶质瘤均值”(中灰-右)以及误差线的图形表示。
图8是PECAM-1和PDGF-BB的散布图形相关性图(scatter-graphical correlationchart)，显示了50名胶质瘤患者中PECAM-1和PDGF-BB水平之间的关系并且展示了线性程度和0.45的相关系数。
图8A-8G显示了胶质瘤和非癌性脑组织之间的摄像免疫组织化学的比较，即：A)显示阳性染色和未染色的肿瘤细胞的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；B)显示阴性染色的血管的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；C)显示阴性染色的血管的放大40倍的非癌性脑组织；D)显示间质性染色的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；E)显示间质性染色尤其是轴突束染色的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；F)显示阴性染色的血管的放大40倍的非癌性脑组织；G)显示阳性细胞质染色的脉络丛组织。
图9显示了血清样品1(全血清)的膜的白光干涉图谱。
图10显示了血清样品3(10kDa以上组分被移除的血清)的膜的白光干涉图谱。
图11显示了血清样品类型1-4的每一个的FTIR光谱特征的代表性样品。
图12(取自Filik J,Frogley MD,等人，Analyst,2012，137，853)显示了在ATR晶体上不同平均膜厚度下的牛血清白蛋白(BSA)的样品的叠加的FTIR光谱特征。
图13(取自Goormaghtigh E,等人，Biochimica et Biophysica Acta,1999，1422，105)是显示a)存在于血清样品中的两种特征性酰胺，酰胺I(1650cm-1)和酰胺II(1550cm-1)的面积比如何随BSA膜厚度而变化；和b)酰胺I(1650cm-1)和TSPA内标(835cm-1)的面积比如何随BSA膜厚度而变化的图形表示。
图14显示了在室温干燥0、2、4、6、8、16和32分钟的人全血清的多种叠加的光谱特征。
图15是阐明当使用预测模型评估“盲集”时，全血清预测模型的训练集准确度的图表。
图16是阐明当针对预测模型评估相关的“盲集”时，血清类型3预测模型的训练集准确度的图表。
图17显示了在离心过滤器中(左)的0.5ml血清，并且其被离心使得过滤器截留大于千道尔顿范围(100、10或3kDa)的所有血清成分，仅允许含有在最大范围以下的成分的血清滤液通过。
图18显示了在室温干燥0、2、4、6、8、16和32分钟的人全血清的多种叠加的ATR-FTIR光谱特征。光谱已经被偏调(offset)以便易于可视化。
图19A-D显示了(A)全血清光谱(900-3900cm-1)和(B)相比于预处理的数据(噪音降低(30PC)和矢量归一化)的指纹区(900-1800cm-1)(C)预处理的全血清光谱和(D)预处理的指纹区的原始的且未加工的光谱数据。可变的CO2区(2300-2400cm-1)已经被移除。
具体实施方式
定义
除非另外说明，说明书和项目书中使用的以下术语具有以下陈述的下面的含义。
本文中，“诊断”或“预测”通常包括确定脑癌或增殖性紊乱的存在、程度、严重性和/或侵袭性。这样，确定有利的或不利的诊断结果或预测结果通常包括确定脑癌或增殖性紊乱的存在、程度、严重性和/或侵袭性。在特定的实施方案中，“诊断”或“预测”可以指仅存在脑癌或增殖性紊乱。
本文中，关于“血液样品”包括全血样品或其组分(例如血清或血浆)的样品。
本文中，“血浆”指的是通常以悬液的形式将血细胞容纳在全血中的血液的淡黄色/浅黄色液体组分。它构成总血容量的约55％。它是细胞外液(所有的细胞外体液)的血管内液部分。它大部分是水(按体积计93％)并且含有溶解的蛋白(主要蛋白是纤维蛋白原、球蛋白和白蛋白)、葡萄糖、凝血因子、矿质离子(Na+、Ca++、Mg++、HCO3 -、Cl-等)、激素和二氧化碳(血浆是用于***产物运输的主要介质)。需要注意的是，对于血浆样品，EDTA血浆和柠檬酸盐血浆二者均是合适的，而肝素血浆是次优选的，因为这种血浆可以吸收某些细胞因子。
本文中，“血清”指的是既不是血细胞(血清不含有白细胞或红细胞)也不是凝血因子的组分；它是纤维蛋白原被移除的血浆。
本领域中熟知“细胞因子”为由大量细胞分泌的细胞信号蛋白分子，并且是细胞间通讯中广泛使用的一类信号分子。细胞因子可以归类为蛋白、肽或糖蛋白；术语“细胞因子”包括遍及体内由不同胚胎来源的细胞产生的大的和不同家族的调节因子。一些“细胞因子”还可以被认为是“血管生成因子”，并且反之亦然。
本领域中熟知“血管生成因子”为血管生长因子。在本发明的上下文中，考虑到“细胞因子”与“血管生成因子”作为增殖性紊乱的生物标志物的联合作用，通常它们被共同地考虑，如在实施例中和整个说明书中所展示的。
本文中，关于“测定(assay)”或“测定(assaying)”包括任何形式的分析，包括标准生物测定(例如生物测定、免疫测定等)和甚至光谱分析。在特定的实施方案中，测定不涉及光谱分析。
如本文使用的，“受试者”指的是动物，优选地哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人类受试者。在其他实施方案中，受试者是非人类哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马等。
遍及本说明书的描述和项目，词语“包括”和“包含”和它们的变形意指“包括但不限于”，并且它们不预期(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。遍及本说明书的描述和项目，单数包含复数，除非上下文另外要求。尤其，在使用不定冠词时，说明书被理解为意指复数形式以及单数形式，除非上下文另外要求。
联合本发明的特定的方面、实施方案或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团被理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与其不相容。本说明书(包括任何附随的项目书、摘要和附图)中公开的所有特征、和/或这样公开的任何方法或过程的所有步骤可以在任何组合中被组合，除了其中这样的特征和/或步骤中的至少一些是互相排斥的组合。本发明不受任何前述实施方案的细节的限制。本发明延伸至本说明书(包括任何附随的项目书、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或延伸至这样公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。
读者的注意力关注到当前与本说明书一起递交或在本说明书之前递交的与本申请有关的并且随本说明书公开供公众查阅的所有论文和文件，并且所有这样的论文和文件的内容通过引用被并入本文。
为免生疑问，在此声明，本说明书中前文在标题“背景”下公开的信息是与本发明相关的并且被理解为本发明的公开内容的部分。
如本文使用的，“肽”和“蛋白”可以互换被使用并且意指通过肽键连接的至少两个共价附接的氨基酸。术语蛋白包含纯化的天然产物或使用重组或合成技术可以部分地或全部地制备的产物。术语肽和蛋白可以指蛋白的聚集物，例如二聚体或其他多聚体；融合蛋白；蛋白变体或其衍生物。该术语还包括蛋白的修饰形式，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、泛素化等修饰的蛋白。蛋白可以包含不通过核苷酸密码子编码的氨基酸。
“蛋白修饰”或“蛋白突变”意指多肽序列中的氨基酸取代、***、和/或缺失，或化学地连接至蛋白的部分的改变。例如，修饰可以是附接至蛋白的改变的碳水化合物或PEG结构。本发明的蛋白可以包括至少一种这样的蛋白修饰。
保守取代：一个或更多个氨基酸取代(例如1、2、5或10个残基)具有相似生物化学特性的氨基酸残基。通常，保守取代对获得的多肽的活性具有很少至没有的影响。例如，接触阶段因子(contact phase factor)抑制性肽中的保守取代可以是基本上不影响肽抑制接触阶段因子的能力的氨基酸取代或氨基酸取代的组合。
取代的变体是其中氨基酸序列中至少一个残基已经被移除并且不同的残基***其位置的那些。可以取代蛋白中初始氨基酸并被认为是保守取代的氨基酸的实例包括：Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；以及Ile或Leu取代Val。
在一个实施方案中，取代可以是在Ala、Val Leu和Ile中；在Ser和Thr中；在Asp和Glu中；在Asn和Gln中；在Lys和Arg中；和/或在Phe和Tyr中。
关于在其他位置中的保守取代的另外的信息可见于Ben-Bassat等人(J.Bacteriol.169:751-7,1987)、O'Regan等人(Gene 77:237-51,1989)、Sahin-Toth等人(Protein Sci.3:240-7,1994)、Hochuli等人(Bio/Technology 6:1321-5,1988)、WO 00/67796(Curd等人)以及可见于遗传学和分子生物学的标准教科书。
术语“修饰的蛋白”或“突变的蛋白”包括具有氨基酸的至少一种取代、***和/或缺失的蛋白。修饰的或突变的蛋白可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸修饰(选自取代、***、缺失和其组合)。
功能上等同的：具有等同的功能。在接触阶段因子抑制性肽的情况下，功能上等同的分子包括保持抑制相同接触阶段因子的功能的不同分子。例如，功能等同物可以通过接触阶段因子抑制性肽中的序列改变来提供，其中具有一种或更多种序列改变的肽保持未改变的肽抑制一种或更多种接触阶段因子的能力。
序列改变的实例包括，但不限于保守取代、缺失、突变和***。在一个实例中，给定的多肽结合一种活性物，且功能上等同的是结合相同活性物的多肽。因此功能等同物包括与多肽具有相同结合特异性并且可以被用于取代所述多肽的肽。在一个实例中，功能等同物包括其中结合序列是不连续的多肽，其中活性物结合线性表位。
纯化的：术语纯化的不需要绝对纯度；而是，它预期作为相对术语。因此，例如纯化的肽制品是其中肽或蛋白比该肽或蛋白在其细胞内环境中更富集，使得肽与可能伴随其的细胞组分(核酸、脂类、碳水化合物和其他多肽)基本上分离的制品。在另一个实例中，纯化的肽制品是其中肽基本上不含污染物的制品，所述污染物例如可以在肽的化学合成之后存在的那些。
本发明涉及与本公开内容的蛋白或肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性的蛋白和肽(例如细胞因子和/或血管生成因子)，例如96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多；这样的蛋白可以具有本公开内容的对应的蛋白或肽的活性。
本领域技术人员将理解这些序列同一性范围被提供仅用于指导；可能的是可以获得落在提供的范围之外的非常重要的同系物。两个氨基酸序列基本上相同的可选(并且不需要是累积的)含义是第一序列的多肽与第二序列的多肽在免疫学上是交叉反应的。
变体、片段或融合蛋白：公开的蛋白包括其变体、片段和融合物。
一般方法学
本发明提供了仅通过测定/分析血液(特别地血清)便利地检测恶性肿瘤、尤其是癌性脑肿瘤的方法。本发明人得出出人意料的发现：血清中的细胞因子和/或血管生成因子指示脑癌的存在。本发明人还发现：在足够小心地制备样品的情况下，来自受试者的血液样品的光谱分析可以产生可以以高准确度与受试者中增殖性紊乱尤其是恶性肿瘤的存在、程度、严重性或侵袭性关联的特征。
如实施例中展示的，本文提供的数据支持以下观点：血液样品中的细胞因子和/或血管生成因子可指示从其取得血液样品的受试者中的脑癌，特别地指示例如胶质瘤的脑癌。此外，本文提供的数据支持以下观点：血液样品的光谱特征可以被用以提供从其取得血液样品的受试者中增殖性紊乱的快速诊断和/或预测。预期本发明的诊断方法广泛应用于多种增殖性紊乱尤其是多种脑癌是合理的。此外，基于本公开内容中概括的发现结果，诊断方法和试剂盒可使用本领域中已知的常规车间技术(routine workshop technique)与任何相关的诊断工具(例如软件等)一起容易地产生。
本发明提供了简单的、可靠地和有成本效益的床旁诊断方法，该方法需要最少的人力资源或技术来操作，是不耗时的并且该方法有助于以合理的高准确度快速确定肿瘤的恶性/良性。例如，示例的ATR-FTIR诊断方法在10分钟内提供诊断结果，同时细胞因子/血管生成因子测定在5小时内提供诊断结果。这对本领域是相当大的贡献。据设想，细胞因子/血管生成因子测定可与光谱分析结合以提供增殖性紊乱尤其是脑癌例如胶质瘤的快速和可靠的诊断。
本发明的方法可用于使临床医生能够作出关于用于正在罹患癌症的或怀疑正在发展癌症的受试者的最好治疗过程的决定。优选的是，诊断方法被用于使临床医生能够决定如何治疗正在罹患癌症的受试者。此外，该方法对于临床医生是有用的，因为它允许他或她监测用于癌症的推定治疗的效力。因此，根据本发明的诊断试剂盒可用于提供关于癌症患者的状况的预测信息，使得临床医生可以实施治疗。试剂盒还可以被用以监测用于癌症的推定治疗的效力。因此，方法和试剂盒对于指导临床医生的癌症治疗方案并且监测这样的治疗方案的效力是非常有用的。有利地，血液中细胞因子和/或血管生成因子的水平可被用作用于多种癌症状况(但是尤其是脑癌例如胶质瘤)的诊断和/或预测标志物。本发明的方法还适用于癌前状况和由致瘤病毒引起的癌症。
增殖性紊乱
增殖性紊乱合适地是癌症、合适地是脑部或脊柱的癌症、最合适地是脑癌(和/或相关的肿瘤)。在特定的实施方案中，脑癌是胶质瘤。
三种主要类型的恶性胶质瘤是星形细胞瘤、室管膜细胞瘤和少突神经胶质瘤。本发明的诊断方法可以用于所有这些类型的胶质瘤。具有存在于主要的三种中的组织学特征的混合的肿瘤被称为混合型胶质瘤，本发明也可以用于其诊断。下表显示了高级别和低级别胶质瘤的亚型。
在特定的实施方案中，脑癌是低级别胶质瘤或高级别胶质瘤。在特定的实施方案中，脑癌是毛细胞性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤胶质瘤亚型中的任何一种。
在特定的实施方案中，脑癌是III级胶质瘤或IV级胶质瘤。
受试者(患者)
受试者合适地是动物，优选地哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人类受试者。在其他实施方案中，受试者是非人类哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马等。
受试者合适地患有或怀疑患有如本文定义的脑癌或增殖性紊乱。在特定的实施方案中，受试者患有或怀疑患有脑癌(尤其是胶质瘤)。
受试者合适地是胶质母细胞瘤或胶质肉瘤患者。在特定的实施方案中，受试者是胶质母细胞瘤患者。
血液样品
通过首先从相关受试者抽取血液合适地获得血液样品。优选地，然后将血液进一步处理，合适地获得其组分(例如血清)。
本发明的方法中使用的血液样品(或其组分)合适地是血清或血浆。在特定的实施方案中，血液样品是血清。在特定的实施方案中，血液样品是人血清。
通过本领域中熟知的方法从相关受试者的血液样品合适地获得血清。
在特定的实施方案中，使用的血清是全血清，最优选地人全血清。全血清可以被直接用于相关测定，尤其是光谱分析。可选地，血清样品可以根据光谱的需要(例如灵敏度)和被分析的样品需要的均一性被稀释。
在另一个实施方案中，使用的血清是离心过滤的血清，其被从中移除了某个分子量以上的分子。例如，血清可以被离心过滤以移除具有100kDa(千道尔顿)以上分子量的组分。在另一个实施方案中，血清可以被离心过滤以移除具有10kDa以上分子量的组分。在另一个实施方案中，血清可以被离心过滤以移除具有3kDa以上分子量的组分。任何或所有上述提到的离心过滤的血清可以被直接用于相关测定，尤其是光谱分析。可选地，离心过滤的血清样品可以根据光谱的需要(例如灵敏度)和被分析的样品需要的均一性被稀释。
在血清(合适地全血清)被用于免疫测定和/或光谱分析的情况下，血清样品通过以下合适地制备：允许抽取的血液样品首先合适地在室温凝结，合适地持续25分钟和1小时10分钟之间。然后将血清合适地离心或过滤以清除沉淀的样品。离心合适地在9000和20000rpm之间、合适地在10000和15000rpm之间，合适地持续5-20min，合适地在2-8℃下执行。血清样品的过滤合适地包括通过0.8/0.22μm双重过滤器过滤以防止设备阻塞。血清然后应该立即被测定或另外被等分并且在-70℃下以单独使用的等分试样储存血清样品。在测定之前，合适地，血清样品用合适的样品稀释剂来稀释。合适地，1体积的血清样品可以用2-5体积的样品稀释剂、合适地用3体积的样品稀释剂来稀释。因为VCAM-1和ICAM-1的生理水平通常被发现在高的多的浓度下，通常需要1:100的样品稀释以实现在标准曲线的可测量范围内的浓度。这样，人们可以如下任选地1:50或1:100稀释血清：1)在样品稀释剂中1:4稀释血清，并且2)使用标准物稀释剂1:25进一步稀释。
细胞因子和血管生成因子
本发明可以合适地包括检测血液样品(或其组分)中一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量(或其存在)。这样，细胞因子和/或血管生成因子可以用作血液样品中的分析物。本发明人的如下出人意料的发现现在使得能够诊断和/或预测大量脑癌：受试者中脑癌和他们的血液中细胞因子和/或血管生成因子的量之间的相关性。受试者的血液中细胞因子和/或血管生成因子用作用于脑癌(尤其是例如胶质瘤的脑癌)的生物标志物的发现是医学诊断领域中的一个重大进步，因为其克服了现有的诊断方法所伴随的许多问题并且允许关于恶性肿瘤例如恶性脑肿瘤的诊断的快速传递。
合适地，分析物(即，细胞因子和/或血管生成因子)是预先确定的。在优选的实施方案中，分析物是人细胞因子和/或人血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、Exotaxin、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、ICAM-1、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL、VCAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、IGFBP-1、IL-18、PAI-1、VEGFC的人细胞因子和/或血管生成因子；或选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、Exotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-α、IL-15、IL-18、碱性FGF、LIF、M-CSF、MIG、MIP-2、PDGF-BB、VEGF的小鼠细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、Exotaxin、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、ICAM-1、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL和VCAM-1的人细胞因子和/或血管生成因子；或选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、Exotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-α、IL-15、IL-18、碱性FGF、LIF、M-CSF、MIG、MIP-2、PDGF-BB、VEGF的小鼠细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、Exotaxin、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、ICAM-1、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL、VCAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、IGFBP-1、IL-18、PAI-1、VEGFC的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、Exotaxin、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、(MCAF)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、ICAM-1、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL和VCAM-1的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、PDGF-BB、TNF-α、VEGF、HGF的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-8、IL-10、IFN-γ、PDGF-BB、HGF的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-8、IL-10、PDGF-BB、HGF的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-8、PDGF-BB、HGF的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和/或血管生成因子分析物包括选自IL-10和PDGF-BB的人细胞因子和/或血管生成因子。
在本发明的特定实施方案中，血管生成因子分析物包括选自卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白和PECAM-1的血管生成因子(合适地人血管生成因子)。
在本发明的特定实施方案中，血管生成因子分析物包括选自卵泡抑素、血管生成素和瘦蛋白的血管生成因子(合适地人血管生成因子)。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、IFN-γ、PDGF-BB、TNF-α、VEGF、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、IGFBP-1、IL-18、PAI-1、VEGF C、G-CSF、FGF。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、PDGF-BB、TNF-α、VEGF、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白和PECAM-1。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、IL-10、IFN-γ、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF、FGF。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、IL-10、IFN-γ、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白和PECAM-1。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、IL-10、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF、FGF。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、IL-10、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白和PECAM-1。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白、PECAM-1，或选自PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF、FGF。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-8、PDGF-BB、HGF、卵泡抑素、血管生成素、瘦蛋白和PECAM-1。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物选自IL-10、PDGF-BB、卵泡抑素、血管生成素和瘦蛋白。
在本发明的特定实施方案中，细胞因子和血管生成因子分析物包括卵泡抑素。
一些细胞因子还可以被归类为血管生成因子，并且反之亦然。例如，G-CSF、HGF、IL-8、PDGF-BB、VEGF，它们全部都在上面被列在细胞因子下，也可以被认为是血管生成因子。因此，存在重叠的程度，这是本发明人为什么认为细胞因子和血管生成因子两者用于在本发明的方法中使用都是合适的。这样，在一些实施方案中，一种或更多种细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α；并且一种或更多种血管生成因子选自血管生成素、卵泡抑素、G-CSF、HGF、IL-8、瘦蛋白、PDGF-BB、PECAM-1、VEGF。
所有上述提到的缩写在下文被概括。不管怎样，所有上述提到的细胞因子和血管生成因子是本领域中熟知的而无需进一步详细阐述，并且是商购可得的或在测定试剂盒中可得的。
在本发明的优选的方法和诊断试剂盒中，在一种和三种之间的细胞因子和/或血管生成因子被用作本方法中预先确定的分析物。
血液样品的分析-诊断/预测
如本文描述的诊断和/或预测受试者中的脑癌或增殖性紊乱的方法全部包括分析血液样品或其组分。
诊断和/或预测的方法可以合适地包括获得来自受试者的全血样品(即，具有血浆和细胞)的预备步骤。任选地，然后将全血进一步处理以分离血液的组分(例如血清或血浆)和/或从血液或其组分移除不想要的物质(例如沉淀物)。血液的任何进一步处理将取决于使用的分析方法。
诊断和/或预测的方法合适地包括将与血液样品(或其组分)的测定或分析有关的分析结果/数据与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
将分析结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联可以手动地(例如由临床医生或其他合适的分析人员)或自动地(例如由计算机方法)来执行。关联可以被定性地(例如经由图解轨迹或特征的比较)或定量地(例如通过参考预先确定的阈值或统计限)确立。关联分析结果可以使用预测模型来执行，任选地如本文定义的，该预测模型可以通过“训练”预先关联的测定和/或分析的数据库被开发。
在特定的实施方案中，将分析结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联包括分析结果与参考标准或与已经与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联的之前的分析结果(例如储存在数据库中的预先关联的分析结果)的初始比较。与之前的分析结果关联可以包括统计比较或“最佳匹配”比较(例如，如果将图解轨迹与数据库中储存的那些比较)。将分析结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联的方法可以是计算机实施的关联方法。合适地，这样的计算机实施的方法并入预测模型，任选地与合适的数据库联合。
合适地，在关联任何分析结果之前，分析结果自身被验证的。特别地，分析结果应该理想地首先被验证为是确定的并且不具有可以通过样品制备中的变化等而引起的伪差(artefact)。
在特定的实施方案中，方法涉及诊断方法并且不涉及预测方法。
在本发明的另一个方面中，根据本发明的对受试者的血液样品的分析或测定的多种方法被用于诊断和/或预测受试者中的增殖性紊乱。例如，诊断方法可包括如本文定义的测定血液样品并且如本文定义的光谱分析血液样品。一种方法可以被叠放于其他方法之上。在一些实施方案中，“测定(assaying)”方法可应用于任何增殖性紊乱(即，不仅是脑癌)，其中它们与“光谱”分析方法组合被使用。这样，在这些方法彼此联合被使用(不论是平行或连续)的情况下，本文关于单独的脑癌的“测定”方法的任何引述可以被视为涉及任何单独的增殖性紊乱或脑癌。
为了清楚起见，根据本发明的另外的方面，提供了诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的方法，所述方法包括：
在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定受试者的血液样品(或其组分)；以及
对受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生血液样品(或其组分)特有的光谱特征。
测定血液样品
测定血液样品合适地包括确定血液样品中一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的水平。在特定的实施方案中，测定的血液样品是血清样品。在另一个实施方案中，测定的血液样品是血浆样品。
任选地，一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的水平(或浓度)可以用相对于标准标志物来校准或归一化，从而消除对分析数据的稀释效应，所述标准标志物是血液固有的(即，通常在所有受试者的血液中以基本上恒定水平存在的分子)或是添加至血液以提供血液中所述物质的已知浓度的物质。
一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的水平(或校准的/归一化的水平)可以例如针对一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的每一种的预先确定的阈值(例如通过患有和未患有脑癌或增殖性紊乱的受试者的代表性的横截切片的血液样品中的细胞因子/血管生成因子水平的之前研究确定的)或相对于彼此(例如比较关注的细胞因子/血管生成因子的相对水平/序型)进行评价。然后，这样的评价可以与诊断和/或预测关联。特别地，一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的每一种的升高的或降低的水平的观察结果，无论是相对于预先确定的阈值还是相对于彼此，都可以与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。例如，在特定的实施方案中，与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联可以参照特定的细胞因子和/或血管生成因子的集之间的一个或更多个比来进行。在特定的实施方案中，PECAM-1对PDGF-BB的水平的比可以被用于确定有利的或不利的诊断结果和/或预测结果。
在特定的实施方案中，血液样品用免疫测定，例如基于抗原-抗体反应，来测定。
测定血液样品可包括本领域中任何合适的测定。一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的每一种可以单独地，任选地连续地测定。这样，血液样品可以被分成用于测试的多个等分试样。可选地，一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的每一种可以以平行方式(例如作为多个等分试样)进行测定。可选地，一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的每一种可以在同一测定中(即，用单一血液样品)以平行方式进行测定，例如通过多重测定进行测定。
在特定的实施方案中，血液样品使用被设计以测量多种细胞因子和/或血管生成因子的基于磁珠的多重测定来测定。多重化特征使得在仅3小时内，使用少至12.5μl的血清或血浆，在单一孔中定量多种蛋白的水平是可能的。合适的测定试剂盒包括Bio-PlexTM和Bio-PlexTM Pro***，其将磁珠并入其设计。磁珠允许在洗涤步骤期间使用磁性分离而非真空过滤的选择。磁性分离允许更高的自动化而不会明显改变标准Bio-Plex测定方案。标准Bio-Plex测定方案在www.bio-rad.com/bio-plex/在线可得，并且被描述在Bio-Plex ProTM测定手册中-http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/ 10014905.pdf。
测定合适地使用多种荧光染色的珠(例如xMAP技术)以在单个测定(例如单个孔)中同时检测多种细胞因子和/或血管生成因子。这样，两种或更多种细胞因子和/或血管生成因子可以是分析的对象。在特定的实施方案中，多达100个独特的荧光染色的珠被用于细胞因子/血管生成因子检测。
测定合适地使用具有两种激光和相关的光学器件的流式细胞仪以测量结合在珠的表面的不同细胞因子/血管生成因子。
测定合适地使用具有有效控制荧光数据的(高速)数字信号处理器的诊断试剂盒。
基于珠的测定合适地以与捕获夹心免疫测定(capture sandwich immunoassay)类似的方式操作。例如，针对期望的细胞因子和/或血管生成因子靶的抗体合适地共价结合至内部染色的珠。在测定期间，珠与相关血液样品合适地接触以有助于共价结合的抗体和靶细胞因子和/或血管生成因子之间的反应。在足够的接触时间之后，将珠合适地洗涤(任选地数次)以移除未结合的蛋白。其后，将对于与捕获抗体的表位的不同的表位特异性的生物素化的检测抗体合适地添加至珠反应混合物。这合适地产生围绕细胞因子/血管生成因子靶的抗体的夹心。然后，合适地添加报告物复合物(例如链霉亲和素-藻红蛋白(链霉亲和素-PE))以结合珠表面上的生物素化的检测抗体。
使用合适的读取器***从珠反应混合物合适地获取数据。在特定的实施方案中，使用Bio-Plex***(或Luminex***)、双波长激光器、基于流体的酶标仪***获得数据。将珠反应混合物合适地吸入读取器***。激光和相关的光学器件合适地检测单个染色的珠的内部荧光以及珠表面上的荧光报告物信号。这合适地鉴定出每一个测定并且报告了样品中细胞因子/血管生成因子的水平。珠上检测的荧光强度指示测试的样品中靶细胞因子和/或血管生成因子分子的相对量。数字处理器合适地控制数据输出，数据输出可能地使用Bio-Plex ManagerTM软件被合适地进一步分析并且呈现为荧光强度(FI)和靶浓度数据。
然后一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的水平可以如以上描述的被用于手动地或自动地(即，如本文定义的通过计算机直接处理数据)确定有利的或不利的诊断结果和/或预测结果。
在一些实施方案中，在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定受试者的血液样品(或其组分)是对受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生血液样品(或其组分)特有的光谱特征。预想血液中关于一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子的改变可以导致相关光谱特征的改变。
血液样品的光谱分析
最合适地，光谱分析中使用的血液样品是血清或血浆，最优选地血清。血液样品优选地是人类血清。
光谱分析可包括本领域中已知的任何这样的分析。例如，光谱分析可包括红外(IR)、紫外(UV)、核磁共振(NMR)、拉曼和光谱法的许多其他可行的形式。
然而，在优选的实施方案中，光谱分析是红外(IR)光谱分析。合适地，IR光谱分析是傅里叶转换IR(FTIR)光谱分析，合适地使用至少10次扫描、合适地至少15次、合适地至少30次扫描。合适地，FTIR光谱分析使用至多100次扫描、合适地至多50次扫描并且最合适地至多40次扫描。在优选的实施方案中，使用32次扫描。合适地，扫描是共加的。扫描的数目合适地被选择以优化数据容量和数据获取时间。
合适地在400-4000的波数(cm-1)区收集IR光谱。合适地IR光谱具有10cm-1或更小、合适地5cm-1或更小、尤其4cm-1的分辨率。血液样品特有的光谱特征(即，特征区)合适地是在500至2500cm-1之间的相关IR光谱的部分或全部、更合适地在800和2000cm-1之间的光谱的部分或全部、以及最合适地在900和1800cm-1之间的光谱(全部)。
合适地，光谱分析包括矢量归一化作为预处理步骤。
在优选的实施方案中，FTIR光谱分析是衰减全反射FIR(ATR-FTIR)。由于这样的光谱技术固有的消散波与血液样品相互作用的方式而引起的对应特征的高信息量，这是用于诊断和/或预测来自血液样品的增殖性紊乱的光谱法的特别有效的形式。ATR是使样品能够以固体或液体状态直接检测的特定的取样技术。“ATR晶体”被合适地使用以在IR分析期间支持血液样品。合适地，血液样品在IR分析期间覆盖“ATR晶体”的表面(或其部分)。合适的ATR晶体包括锗、KRS-5硒化锌、金刚石和硅。ATR晶体合适地呈板样(plate-like)形式。在特定的实施方案中，ATR晶体是单反射金刚石晶体。
在ATR-FTIR分析期间，将血液样品加载至ATR晶体上，并且IR光合适地穿过ATR晶体，并且从与样品接触的内部表面反射(合适地经过全内反射)至少一次。这样的反射形成“消散波”，其透入血液样品至取决于光的波长、入射角度和ATR晶体和血液样品自身的折射率的程度。反射的次数可以通过改变入射角度改变。合适地，光束由IR检测器最终接收，因为其存在晶体。
“消散波”仅在ATR晶体是具有比血液样品更高折射率的光学材料时才成功实现。这样，在本发明的上下文中，ATR-FTIR可以通过小心的样品制备来优化。
血液样品的(相对薄的)膜在FTIR分析之前被合适地施加至ATR晶体表面。样品被合适地制备以便包含最少或没有滞留空气。血液样品膜(或至少其暴露至IR分析的部分)是合适地(基本上)均一厚度，合适地在+/-40μm或更小的公差内、更合适地在+/-20μm或更小的公差内、最合适地在+/-10μm或更小的公差内。血液样品跨ATR晶体的表面(或至少其暴露至IR分析的部分)的平均膜厚合适地在0.1和200μm之间、合适地在1和100μm之间、合适地在2和50μm之间。血液样品跨ATR晶体的表面(或至少其暴露至IR分析的部分)的最大膜厚度(即，最大厚度的点)合适地在1和200μm之间、合适地在2和100μm之间、合适地在5和50μm之间、或合适地在2和8μm之间。血液样品跨ATR晶体的表面(或至少其暴露至IR分析的部分)的最小膜厚度(即，最小厚度的点)合适地在0和40μm之间、合适地在1和20μm之间、合适地在2和10μm之间。
合适厚度的血液样品膜通过将0.1-10μL、合适地0.2-5μL、最合适地0.5-1.5μL(或约1μL)的所述血液样品沉积在ATR晶体的表面上合适地获得。合适地，然后允许沉积的血液样品干燥以产生合适厚度的血液样品膜。合适地，干燥在标准环境温度和压强(SATP)(即，约25℃，在100kPa)下持续2和32分钟之间、更合适地4和16分钟之间、最合适地约8分钟实现，或在产生相同干燥水平的其他等效条件下实现。获得的膜通过白光干涉法的分析可指示跨ATR晶体的表面的膜的厚度，从而验证合适的膜厚度。本发明人已经发现产生合适厚度的膜可以降低与样品制备相关的特征差异，使得从血液样品至血液样品的特征中任何观察到的差异可以更可靠地被归因于不同的组成而不是样品制备中的变化性。
合适地，取自大量血液样品的单个等分试样被用于每一个光谱分析。以这种方式，另外的等分试样之后可以被用于对样品血液样品的另外的光谱分析，从而有助于验证结果。合适地，对每一个血液样品执行至少两种光谱分析。此外，合适地，用相同等分试样重复每一种单独的光谱分析至少两次、优选地至少三次以有助于验证结果。
然后，可以将血液样品的特征(在特征区中，在ATR-FTIR光谱法的情况下，通常在900-1800cm-1)与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联，或另外用以检测受试者中的癌细胞。通过比较特征与一个或更多个预先关联的特征(即，之前通过例如活组织检查获得的并确认的作为指示有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的特征)，这样的关联是可能的。这可以通过定性评价的方式实现-例如，某些特征将与具有增殖性紊乱的受试者的血液样品特有的特征相似(可能在程度上不同)，同时其他特征可能不同于这样的特征。这样，特征表现的定性评价可以用于诊断和/或预测增殖性紊乱。这样的定性评价可以手动地实施，但是优选地通过根据执行这样的评价的计算机软件运行的计算机数字化地实施。合适地，任何这样的计算机软件能够根据评价将特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
可选地或另外地，与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联可以通过定量评价来进行-例如，其中将血液样品特征与一种或更多种任选地储存在数据库中的参考特征(之前已经与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联)比较，并且合适地针对关联的可能性进行统计分析。
在特定的实施方案中，将光谱获得的特征与储存在数据库(例如“训练集”)中的多个预先关联的特征比较，以便得出与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联。优选地基于特征与预先关联的特征的相似性和差异性的比较合适地执行统计分析(例如，通过模式识别算法)，然后统计分析被用于将特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。合适地，模式识别算法包括支持向量机(SVM)和主成分判别函数分析(principalcomponent discriminant function analysis,PC-DFA)。
在特定的实施方案中，基于预测模型将光谱获得的特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联，所述预测模型是通过“训练”(例如通过模式识别算法)预先关联的分析的数据库开发的。
来自光谱分析的血液样品特征的检测和/或比较不必然地关注特定的峰或造成任何特定的峰的特定的物质。然而，在ATR-FTIR的情况下，通常作为在约1550cm-1和1650cm-1的双峰(尤其当TSPA被用作内标时)出现的两个酰胺峰显示是增殖性紊乱的重要指示物，因为这些峰中的某些改变指示表示增殖性紊乱的蛋白结构的改变。
在特定的实施方案中，血液样品是全血清。
在特定的实施方案中，血液样品是通过离心过滤移除了100kDa以上组分的全血清。
在特定的实施方案中，血液样品是通过离心过滤移除了10kDa以上组分的全血清。
在特定的实施方案中，血液样品是通过离心过滤移除了3kDa以上组分的全血清。
任何这样的离心过滤可使用与合适的蛋白过滤器组合的微型离心机以14,000rpm按照厂家的说明(Amicon膜过滤器,Merck Millipore)来执行。
在本发明的一些实施方案中，多种光谱分析使用源自同一全血样品的多种血清(即，具有不同过滤程度)来执行，并且结果被比较和/或用于交叉验证。
数据库、计算机软件和计算机实施的方法
本发明提供了包含多个数据集的数据库，每一个集与特定受试者的特定血液样品(或其组分)中一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量有关，每一个集与涉及所述特定受试者中的脑癌的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
本发明提供了包含多个光谱特征的数据库，每一个特征与特定受试者的特定血液样品(或其组分)有关，每一个特征与涉及所述特定受试者中的增殖性紊乱的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
本发明提供了包含如本文定义的数据库的计算机可读介质(例如，光盘)。
本发明的数据库通过测定或光谱分析来自不同受试者的多个血液样品来合适地建立，以产生用于每一个血液样品的分析数据，然后将分析数据与涉及对应的受试者中的增殖性紊乱的有利的或不利的诊断结果和/或预测结果***性地关联。分析数据与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联通过本领域中熟知的方法(包括活组织检查)合适地实现。分析数据可以进一步与诊断结果和/或预测结果的有利性或不利性的程度(即，检测的增殖性紊乱的严重性、侵袭性和/或程度)进行关联。
在包含多种光谱特征的数据库的情况下，数据库可以通过首先获得来自被确证患有增殖性紊乱(或患有某种严重性、侵袭性和/或程度的增殖性紊乱)的受试者的代表性样品的多种血液样品特征，以及来自被确证未患有增殖性紊乱的受试者的代表性样品的多种血液样品特征来建立。合适地，样品还可以与其他标准匹配，例如性别或年龄，以有助于归一化另外与同样的增殖性紊乱状态相关的受试者之间的差异。
预测模型可以进一步通过“训练”数据从数据库来建立。这样的模型然后可以被并入计算机软件以用于以后预测的目的。然后，可将特征全部组合并且(任选地、随机地或选择性地)分为特征的“训练集”(优选地超过50％、合适地约66％的特征被选择用于训练集)和特征的“盲集”。然后使用模式识别算法(例如使用支持向量机，例如通过LIBSVM或PC-DFA可获得的那些)合适地通过执行网格搜索以优化成本和伽马函数以保证它可以鉴定出训练集而合适地训练“训练集”，从而产生可行的预测模型。然后，可以将“盲集”提供至模型，该模型然后被请求预测盲集中的单个特征是否应该与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。然后可以将预测翻译为阐明进行哪些预测的“混淆矩阵(confusion matrix)”。然后可(例如通过确认例如来自活组织检查的实际结果)验证这些预测以计算模型的灵敏度和特异性。
预测模型合适地具有大于75％、更合适地大于80％、最合适地大于85％的灵敏度。预测模型合适地具有大于85％、更合适地大于90％、最合适地大于98％的特异性。
自然地，模型可随着获得和关联的进一步结果以及考虑的进一步的标准和变量而更新并且改善。
建立之后，模型可以被并入诊断计算机软件。然后依据诊断计算机软件(并且任选地还依据数据库)运行的计算机通过所述软件被合适地配置以对新输入的未关联的特征执行预测性诊断和/或预测(合适地以如以上确立的灵敏度和特异性)，从而将所述特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
这样，本发明提供了安装有诊断计算机软件的计算机，所述诊断计算机软件被配置以操作计算机以基于受试者的血液样品的光谱特征执行与增殖性紊乱有关的预测性诊断和/或预测。合适地，诊断计算机软件并入源自被应用于多个预先关联的特征的一种或更多种模式识别算法的预测模型。计算机还可以安装有如本文定义的数据库以有助于关联结果。
在本发明的另一方面中，提供了计算机可读介质，所述计算机可读介质含有如本文定义的诊断计算机软件。
在本发明的另一方面中，提供了将如本文定义的测定或光谱分析的结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联的计算机实施的方法，所述方法包括：
-收集来自所述测定或光谱分析的数据；
-使用预测模型，合适地基于对预先关联的测定或光谱分析(任选地与如本文定义的数据库联合)实施的模式识别算法以将所述数据与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
诊断试剂盒
本发明提供了用于诊断和/或预测受试者中脑癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包括被配置以接收来自所述受试者的血液样品(或其组分)并且在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述血液样品(或其组分)的装置；以及将所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)中所述一种或更多种细胞因子和/或血管生成因子的量与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地与前述提到的相同)。
本发明提供了用于诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的诊断试剂盒，所述试剂盒包括被配置以接收来自所述受试者的血液样品(或其组分)并且对所述受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生血液样品(或其组分)特有的光谱特征的装置；以及将所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地与前述提到的相同)。
在一些实施方案中，用于测定或分析血液样品的装置与用于关联结果或有助于结果的关联的装置相同。本发明的诊断试剂盒可以是用于接收和测定/分析样品并且还将所述测定/分析的结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联的单个整体装置。
在优选的实施方案中，用于关联结果或有助于结果的关联的装置是可操作的以执行如本文定义的计算机实施的关联方法。合适地，用于关联结果或有助于结果的关联的装置包括计算机或与计算机通讯(例如，无论是有线的还是无线的)，所述计算机配置有软件以将所述结果与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
在用于光谱分析血液样品的诊断试剂盒的情况下，关联装置合适地包括如本文定义的计算机或是与如本文定义的计算机通讯，所述计算机安装有诊断计算机软件，所述诊断计算机软件被配置以操作计算机基于受试者的血液样品的光谱特征，执行与增殖性紊乱有关的预测性诊断和/或预测。
在用于光谱分析血液样品的诊断试剂盒的情况下，被配置以接收血液样品的装置可以被配置以自动制备如本文定义的血液样品(或其组分)。例如，在ATR-FTIR的情况下，装置可以被配制以在IR分析开始之前在ATR晶体上自动地产生需要的厚度的血液样品的膜。装置可以包括膜厚度验证设备(例如白光干涉仪)以验证ATR晶体上血液样品的正确厚度。
诊断试剂盒可以被配置以自动执行本文定义的任何方法步骤，任选地通过计算机实施的方法。
实施例
实施例1-血液样品的测定
在本实施例中，使用由Bio-Plex ProTM测定试剂盒提供的基于磁珠的多重测定对血浆样品执行细胞因子和血管生成因子测定。本实施例中充分遵循的所有相关的方案被列在标题为“Bio-Plex ProTM测定细胞因子、趋化因子和生长因子说明手册(Bio-Plex ProTMAssays Cytokine,Chemokine,and Growth Factors Instruction Manual)”的说明手册中，其在网站www.bio-rad.com并且具体地在http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/ lsr/literature/10014905.pdf从Bio-Rad Laboratories,Inc可获得。该说明手册的方案遵循有关“Bio-Plex ProTM人、小鼠和大鼠细胞因子测定(Bio-Plex ProTM Human,Mouse,and Rat Cytokine Assays)”。Bio-PlexTM***按照说明手册中描述的制备，合适地校准并且如描述的验证。将存在于96孔Bio-Plex Pro平底板的磁珠使用Bio-Plex Pro洗涤站(wash station)的磁性装置通过磁性分离洗涤。将96孔Bio-Plex Pro平底板合适地布局，其中孔被合适地分配。Bio-plex***提供的合适的标准物根据列在说明手册中的方案制备。
如说明手册中描述的，将Bio-PlexTM悬浮阵列***围绕xMAP技术的三个核心元素来建立：
·荧光染色的微球(也称为珠)，每一个具有独特的颜色代码或光谱
地址以允许区别多重悬浮液中的单个测试。这允许在96孔微板的单
个孔中同时检测多于100种不同类型分子
·具有两种激光和相关的光学器件的专用流式细胞仪以测量结合在珠
的表面的不同分子
·有效控制荧光数据的高速数字信号处理器
Bio-Plex ProTM细胞因子、趋化因子和生长因子测定本质上是在磁珠上设计的免疫测定。测定原理与夹心ELISA的测定原理相似(图1)。针对期望的生物标志物的捕获抗体被共价偶联至珠。偶联的珠与含有感兴趣的生物标志物的样品反应。在一系列洗涤以移除未结合的蛋白之后，加入生物素化的检测抗体以产生夹心复合物。通过加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)缀合物形成最终检测复合物。藻红蛋白用作荧光指示物或报告物。
还如在说明手册中解释的，来自反应的数据使用Bio-Plex***或类似的基于Luminex的读取器获得。例如，当多重测定悬浮液被吸入Bio-Plex 200读取器时，红色(635nm)激光照亮每一个珠中的荧光染料以提供珠分类并因此提供测定鉴定。同时，绿色(532nm)激光激发PE产生通过光电倍增管(PMT)检测的报告物信号。高速数字处理器控制数据输出并且Bio-Plex ManagerTM软件将数据呈现为平均荧光强度(MFI)以及浓度(pg/mL)。结合至每一个珠的分析物的浓度与报告物信号的平均荧光强度(MFI)成比例。
说明手册将测定的初始制备概括如下：
1.规划板的布局
2.启动/加热Bio-Plex***(多达30min)
·同时，平衡测定试剂至室温(RT)
·开始解冻样品
3.准备好洗涤站或校准真空歧管
4.校准***(现在或之后在孵育期间)
5.在500μl的合适的稀释剂中重构单个小瓶的标准物，涡旋并且在冰上孵育(30min)
·对于血清和血浆样品(按照本实施例)，使用Bio-Plex标准物稀释剂
6.制备8点标准物稀释系列和空白。
·向管S1加入72μl稀释剂，并且向管S2-8和空白加入150μl稀释剂。
·将128μl重构的标准物转移进入S1
·然后通过在管之间转移50μl而从S1至S8连续稀释4倍。在转移之间涡旋
7.解冻之后，制备1×样品
·以Bio-Plex样品稀释剂稀释血清、血浆和裂解物
8.制备在测定缓冲液中的1×偶联的珠，避光
·从10×储液：将575μl珠加至5,175μl缓冲液
·从20×储液：将288μl珠加至5,472μl缓冲液
9.确保在分配之前样品和标准物处于室温
说明手册将测定的运行概括如下：
1.用100μl测定缓冲液预湿滤板(跳过平底)
2.将50μl的1×珠加至测定板
3.用100μl洗涤缓冲液洗涤2次
4.加入50μl样品、标准物、空白、对照
5.加盖并在室温在黑暗中孵育，同时在300RPM振荡
·30min-人类组I、II和小鼠组I、II
用剩余的10min，制备在检测抗体稀释剂中的1×检测Ab
·从10×储液：将300μl Ab加至2,700μl稀释剂
·从20×储液：将150μl Ab加至2,850μl稀释剂
6.用100μl洗涤缓冲液洗涤3次
7.加入25μl的检测抗体
8.加盖并在室温在黑暗中孵育，同时在300RPM振荡
·30min-人类组I、II；小鼠组I、II
同时，准备软件方案；输入归一化的标准S1值
用剩余的10min，制备测定缓冲液中的1×SA-PE，从100×储液：将60μl SA-PE加至5,940μl测定缓冲液。避光
9.用100μl洗涤缓冲液洗涤3次
10.加入50μl的链霉亲和素-PE
11.加盖并在室温在黑暗下孵育，同时在300RPM振荡
·10min-人类组I、II；小鼠组I、II
12.用100μl洗涤缓冲液洗涤3次
13.将珠重悬在125μl测定缓冲液中，在1100RPM振荡30sec
14.读取板
·低PMT(低RP1)-人类组I、II；小鼠组I、II
根据说明手册，用于人类、小鼠和大鼠细胞因子测定的Bio-Plex ProTM测定试剂盒提供的试剂包括(表1)：
表1-用于人类、小鼠和大鼠细胞因子测定的Bio-Plex ProTM测定试剂盒提供的试 剂：
*Bio-Piex ProTM高度稀释试剂盒包括70ml基于血清的稀释剂替代标准物稀释剂和样品稀释剂
根据说明手册，可测试的细胞因子包括(表2)：
表2-可检查的细胞因子
然而，另外的细胞因子和血管生成因子实际上被测试，并且相关的标准物和方案相应地被开发。这些另外的细胞因子和血管生成因子详细描述在结果部分。
全血取样
全血样品收集自50名胶质瘤患者和27名健康受试者。
从全血样品制备血浆样品
50名胶质瘤患者和27名健康受试者的每一名的血浆样品通过以下制备：将对应的新鲜全血样品添加至含有抗凝剂的管中，并且于4℃在13,200rpm下旋转10min直到血细胞落至管的底部以清除沉淀的样品。然后将血浆倾倒出或吸出。获得的血浆具有约1025kg/m3或1.025kg/l的密度。然后将血浆样品立即测定或另外等分并且在-70℃下以单独使用的等分试样储存用于之后使用，然而避免重复冷冻/解冻循环。
在实施测定之前，将1体积血浆样品用3体积样品稀释剂稀释(例如，50μL样品+150μL样品稀释剂)。
制备偶联的珠
现在使用Bio-PlexTM Pro说明手册中采取的方案描述偶联的珠的制备。
每一个试剂盒包括1管偶联的珠。提供了用于稀释偶联的珠至1×浓度的说明。
当使用10个包装试剂时，保证只有需要的体积的偶联的珠、检测抗体、链霉亲和素-PE和缓冲液从管或瓶移出。例如，转移足够执行测定程序的所有步骤(即，预湿过滤板、稀释偶联的珠，稀释链霉亲和素-PE和重悬珠)的一次体积的测定缓冲液进入50ml贮液器。
1.使用以下显示的计算工作表计算所需偶联的珠和测定缓冲液的体积。
2.将所需体积的测定缓冲液加至15ml聚丙烯管。
3.在中速下涡旋偶联的珠30sec。小心打开盖子并且用移液管将落入盖子中的任何液体用移液管吸回至管中。这对保证最大珠回收是重要的。不要离心小瓶；这么做会引起珠成团。
4.用移液管吸取所需体积的偶联的珠的储液进入含有测定缓冲液的15ml管以将偶联的珠稀释至1×浓度。每一个孔需要使用测定缓冲液调整至50μl最终体积的5μl偶联的珠(10×)或2.5μl偶联的珠(20×)。参考下表3-6中的示例珠计算，其包括20％过量以补偿转移损失。
表3-从10×储液制备1×偶联的珠。预先混合的板或一个单重测定
孔数目 10×珠(μl) 测定缓冲液(μl) 总体积(μl)
96 575 5,175 5,750
48 288 2,587 2,875
表4-从10×储液制备1×偶联的珠。混合单重测定
表5-从20×储液制备1×偶联的珠。预先混合的板或一个单重测定.
孔数目 20×珠(μl) 测定缓冲液(μl) 总体积(μl)
96 288 5,472 5,760
48 144 2,736 2,880
表6-从20×储液制备1×偶联的珠。混合单重测定
5.用铝箔避免珠受光照。在使用之前在室温平衡20min
基于磁珠的多重测定
然后如Bio-PlexTM Pro说明手册(也在以下列出)中描述的来运行测定。
在使用之前将所有缓冲液、稀释的标准物、稀释的偶联的珠和样品恢复至室温。为保证最佳的性能，用校准的移液管小心的吸取(避免起泡)，并且使用新的移液管吸头。
将偶联的珠、标准物和样品加入并且然后：
1.用密封带覆盖未使用的孔。
2.预湿滤板。
3.在中速下涡旋稀释的偶联的珠30sec。
将稀释的偶联的珠倾倒入试剂贮液器并且每一个孔添加50μl。
提示：由于易于使用和效率多通道移液管是高度推荐的。
4.用选择的洗涤方法洗涤孔两次。
5.轻轻涡旋稀释的标准物、空白、样品和对照(如果适用)1-3sec。将50μl稀释的标准物、对照或样品加至每一个孔，在每一体积转移之后更换移液管吸头。
6.在室温下在摇床上孵育，如下面表7中详细说明的。
表7-测定的孵育时间
测定 孵育时间
Bio-Plex Pro人细胞因子(组I和II) 30min
Bio-Plex Pro小鼠细胞因子(组I和II) 30min
Bio-Plex Pro小鼠细胞因子(组III) 1hr
Bio-Plex Pro大鼠细胞因子(组I) 1hr
Bio-Plex Pro TGF-β 2hr
注解：孵育时间已经被优化用于每一个测定并且应该不超过4hr。与此孵育时间一致，以用于优化再现性。
制备和添加检测抗体。
每个试剂盒包含1管检测抗体。提供了用于稀释检测抗体至1×浓度的说明。
1.在孵育样品时，使用以下显示的计算工作表计算检测抗体和所需检测抗体稀释剂的体积。检测抗体应该在使用之前10-15min制备。
2.将所需体积的检测抗体稀释剂添加至15ml管。
3.在中速下涡旋检测抗体15-20sec，然后执行30sec旋转以收集在小瓶底部的全部体积。
4.从每一个检测抗体管中用移液管吸取所需体积进入15ml聚丙烯管。测定的每一个孔需要被调整至最终体积25μl的2.5μl检测抗体(10×)或1.25μl检测抗体(20×)。
参考下面表8-11中的示例检测抗体计算。这些计算包括25％过量以补偿转移损失。
表8-11概括了从单独的10×或20×储液制备1×检测抗体所需的体积。还显示了当混合两种10×或两种20×储液时制备1×抗体的体积。对于从不同浓度的两种储液(例如，当混合人糖尿病(20×)与人类组I测定(10×))制备1×抗体的说明，参见Bio-Plex Pro糖尿病说明手册(公告号10010747)。
表8-从10×储液制备1×偶联的珠。预先混合的板或一个单重测定
孔数目 10×检测抗体(μl) 检测抗体稀释剂(μl) 总体积(μl)
96 300 2,700 3,000
48 150 1,350 1,500
表9-从10×储液制备1×偶联的珠。混合单重测定
表10-从20×储液制备1×偶联的珠。预先混合的板或一个单重测定.
孔数目 20×检测抗体(μl) 检测抗体稀释剂(μl) 总体积(μl)
96 150 2,850 3,000
48 75 1,425 1,500
表11-从20×储液制备1×偶联的珠。混合单重测定
5.在孵育样品之后，缓慢移除并且弃去密封带。
6.用选择的洗涤方法洗涤三次。
7.轻轻涡旋稀释的检测抗体1-3sec。将稀释的检测抗体倾倒入试剂贮液器并且使用多通道移液管向每一个孔添加25μl。
8.用一张新的密封带覆盖板并且密封孔。在室温下在摇床上孵育，如下面表12中详细说明的。
表12-测定孵育时间
测定 孵育时间
Bio-Plex Pro人细胞因子(组I和II) 30min
Bio-Plex Pro小鼠细胞因子(组I、II、III) 30min
Bio-Plex Pro大鼠细胞因子(组I) 30min
Bio-Plex Pro TGF-β 1hr
制备和添加链霉亲和素-PE
1.在孵育检测抗体时，使用以下显示的计算工作表计算链霉亲和素-PE(100×)和需要的测定缓冲液的体积。每一个孔需要用测定缓冲液调整至最终体积50μl的0.5μl链霉亲和素-PE(100×)。链霉亲和素-PE(100×)应该在使用之前10min制备。
2.将所需体积的测定缓冲液添加至15ml管。
3.在中速下涡旋链霉亲和素-PE管15-20sec。执行30sec旋转以收集在小瓶底部的全部体积。
4.用移液管吸取所需体积的链霉亲和素-PE进入含有测定缓冲液的15ml聚丙烯管以将链霉亲和素-PE稀释至1×浓度。
下面的表13显示了稀释链霉亲和素-PE的示例计算，其包括25％过量以补偿转移损失。使链霉亲和素-PE避光直到准备使用。
表13-从100×储液制备链霉亲和素-PE
孔数目 100×链霉亲和素-PE(μl) 测定缓冲液(μl) 总体积(μl)
96 60 5,940 6,000
48 30 2,970 3,000
5.在检测抗体孵育之后，缓慢移除并且弃去密封带。
6.用选择的洗涤方法洗涤三次。
7.在中速下涡旋稀释的链霉亲和素-PE 3-5sec。将稀释的链霉亲和素-PE倾倒入试剂贮液器并且使用多通道移液管向每一个孔添加50μl。
8.在室温下在摇床上孵育持续如下面表14中详细说明的时间。
表14-测定孵育时间
测定 孵育时间
Bio-Plex Pro人细胞因子(组I和II) 10min
Bio-Plex Pro小鼠细胞因子(组I、II、III) 10min
Bio-Plex Pro大鼠细胞因子(组I) 10min
Bio-Plex Pro TGF-β 30min
9.在链霉亲和素-PE孵育步骤之后，缓慢移除并且弃去密封带。
10.用选择的洗涤方法洗涤孔三次。
11.将125μl测定缓冲液添加至每一个孔。用一张新的密封带覆盖板。在1,100rpm于室温振荡板30sec并且缓慢移除密封带。保证在将板置于读取器上之前板盖已经被移除。
读取测定板
根据如以下描述的说明手册读取测定板。
推荐Bio-Plex ManagerTM软件用于所有Bio-Plex Pro测定数据获取和分析。还包括用于Luminex xPONENT软件的说明。对于使用其他xMAP***软件包的说明，联系Bio-Rad技术支持或你的区域的Bio-Rad领域应用专家。
应该提前准备方案，使得实验一完成即读取板。方案文件详细说明了读取过程中使用的分析物、被读取的板孔、样品信息、标准物和对照的值、以及仪器设置。
方案可以从6.0版Bio-Plex管理软件获得或从文件菜单中创建。6.0版Bio-Plex管理软件包含用于大部分Bio-Plex测定的方案。方案应该选择应创建的新方案。
方案通过下面的步骤来准备：
1.描述方案并且输入关于测定的信息。
2.选择分析物(来自以上表2)。
3.根据创建的用于测定的板布局模板设计板的格式。
4.输入标准物的细节-例如每一种分析物的最高浓度、稀释因子、批号等。
5.输入对照信息，包括对于每一个测定的每一个用户专用的对照的浓度和稀释信息。
6.输入样品信息，包括合适的稀释因子。
7.运行适于关注的分析物的软件方案。
数据通过下面的步骤来获取：
1.将测定板在1,100rpm振荡30sec并且目测检查板以保证测定孔填充有缓冲液。
2.运行方案以开始获取数据。
3.在每一个板运行之后使用“板之间的洗涤”功能以降低堵塞。
然后执行数据分析和离群值移除。
离群值被定义为不满足准确度和精密度要求的标准数据点并且当执行曲线拟合时被认为是无效的。这样，它们应该被移除以产生更真实的和准确的标准曲线。这可导致延伸的测定工作范围并且允许可能否则被认为是范围外(OOR)的样品的定量。
在6.0版Bio-Plex管理软件中，离群值可以通过选择标准曲线窗口中的优化按钮来自动移除。在6.0和更早版本的Bio-Plex管理软件中，离群值还可以在报告表中手动选择。
计算
Bio-PlexTM Pro说明手册详细描述了以下计算：
规划板布局
1.如在规划板布局部分(第13页)中说明的，填充96孔板模板(第43页)。
如果使用预混合的板或一个单重测定，遵循这些指导。
输入将在测定中使用的孔的数目：_______(1)
计算偶联的珠
1.确定需要的1×偶联的珠的体积。
a.每一个孔需要50μl的偶联的珠(1×)：_______(1)x 50μl＝_______μl(2)
b.包括20％过量以保证足够的体积：_______μl(2)x 0.20＝_______μl(3)
c.1×偶联的珠的总体积：_______μl(2)+_______μl(3)＝_______μl(4)
d.20×偶联的珠储液的体积：_______μl(4)/20＝_______μl(5)
e.需要的测定缓冲液的体积：_______μl(4)–_______μl(5)＝_______(6)
计算偶联的珠
1.确定需要的1×偶联的珠的体积。
a.每一个孔需要50μl的偶联的珠(1×)：______(1)x 50μl＝_______μl(2)
b.包括20％过量以保证足够的体积：_______μl(2)x 0.20＝_______μl(3)
c.1×偶联的珠的总体积：_______μl(2)+_______μl(3)＝_______μl(4)
d.20×偶联的珠储液的体积：_______μl(4)/20＝_______μl(5)
e.需要的测定缓冲液的体积：_______μl(4)–_______μl(5)＝_______(6)
计算偶联的珠
1.确定需要的1×偶联的珠的体积。
a.每一个孔需要50μl的偶联的珠(1×)：_______(1)x 50μl＝_______μl(2)
b.包括20％过量以保证足够的体积：_______μl(2)x 0.20＝_______μl(3)
c.1×偶联的珠的总体积：_______μl(2)+_______μl(3)＝_______μl(4)
d.20×偶联的珠储液的体积：_______μl(4)/20＝_______μl(5)
e.需要的测定缓冲液的体积：_______μl(4)–_______μl(5)＝_______(6)
如果混合单重测定，遵循这些指导。
计算偶联的珠
1.确定需要的1×偶联的珠的体积。
a.每一个孔需要50μl的偶联的珠(1×)：_______(1)x 50μl＝_______μl(2)
b.包括20％过量以保证足够的体积：_______μl(2)x 0.20＝_______μl(3)
c.1×偶联的珠的总体积：_______μl(2)+_______μl(3)＝_______μl(4)
d.输入将被多重化的糖尿病单集(或分析物)管的数目＝_______(5)
e.从每一个偶联的珠的管获得的20×偶联的珠的体积：___μl(4)/20＝___μl(6)
f.需要的糖尿病珠储液的总体积：_______(5)x_______μl(6)＝_______μl(7)
g.需要的测定缓冲液的体积：_______μl(4)–_______μl(7)＝_______μl(8)
计算检测抗体
2.确定需要的1×检测抗体的体积。
a.每一个孔需要25μl的检测抗体(1×)：_______(1)x 25μl＝_______μl(9)
b.包括25％过量以保证足够的体积：_______μl(9)x 0.25＝_______μl(10)
c.1×检测抗体的总体积：_______μl(9)+_______μl(10)＝_______μl(11)
d.输入将被多重化的糖尿病单集(或分析物)管的数目＝_______(5)
e.从每一个检测抗体管获得的20×检测抗体的体积：___μl(11)/20＝____μl(12)
f.糖尿病检测抗体储液的总体积：_______μl(12)x_____(5)＝_______μl(13)
g.需要的检测抗体稀释剂的体积：_____μl(11)–_____μl(13)＝______μl(14)
计算链霉亲和素-PE
3.确定需要的1×链霉亲和素-PE的体积。
a.每一个孔需要50μl的链霉亲和素-PE(1×)______(1)x 50μl＝_______μl(15)
b.包括25％过量以保证足够的体积：_______μl(15)x 0.25＝_______μl(16)
c.100×链霉亲和素-PE的总体积:______μl(15)+______μl(16)＝______μl(17)
d.需要的100×链霉亲和素-PE的体积:_______μl(17)/100＝_______μl(18)
e.需要的测定缓冲液的体积：_______μl(17)_______μl(18)＝_______μl(19)
数据处理
针对多种细胞因子和血管生成因子测定来自50名胶质瘤患者和27名健康受试者的所有血浆样品，并且在每一种情况下确定所述细胞因子和血管生成因子的水平。对于测定的每一种细胞因子和血管生成因子分别产生50名胶质瘤患者的细胞因子和血管生成因子的水平的平均值(“胶质瘤均值”)和27名健康受试者的细胞因子和血管生成因子的水平的平均值(“对照均值”)，并且比较结果。然后关于特定细胞因子和血管生成因子的显著性进行统计比较，所述特定细胞因子和血管生成因子的显著性与其表明胶质瘤存在的能力相关。
图1至7分别显示了关于IL-8、血管生成素、卵泡抑素、HGF、瘦蛋白、PDGF-BB和PECAM-1的“对照均值”(浅灰)、“胶质瘤均值”(深灰)以及误差线的图形表示。
图7A至7F分别显示了关于FGF、G-CSF、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、和sVEGFR1的“对照均值”(深灰-左)、“低级别胶质瘤均值”(浅灰-中)以及“高级别胶质瘤均值(中灰-右)”以及误差线的图形表示。这些图阐明了本发明对低级别和高级别癌症两者的适用性。
图8是PECAM-1和PDGF-BB的散布图形相关图，显示了50名胶质瘤患者中PECAM-1和PDGF-BB水平之间的关系，并且展示了线性程度和0.45的相关系数。这表明就PECAM-1和PDGF-BB两者的相对水平而论可以提供与胶质瘤有关的有利的或不利的诊断结果的良好的相关性。还合理的是，将细胞因子和/或血管生成因子的其他组之间的相对水平或比作为与胶质瘤有关的、或甚至与其他脑癌有关的有利的或不利的诊断结果的指示。
结果
下面的表15比较了每一种测定的细胞因子和血管生成因子的“对照均值”浓度和每一种测定的细胞因子和血管生成因子的“胶质瘤均值”浓度，并且报告了调查的特定细胞因子或血管生成因子的“显著性”(即，所述细胞因子或血管生成因子是否是胶质瘤的血浆中合适的生物标志物)。
表15-比较“对照均值”和“胶质瘤均值”以确定作为胶质瘤的生物标志物的显著性
如将明显的，至少IFN-γ、血管生成素、卵泡抑素、HGF、IL-8、瘦蛋白、PDGF-BB、PECAM-1、PDGF-AA、sHER2neu、sIL-6Rα、催乳素、sVEGFR1、G-CSF和FGF显示了高度“显著性”，尽管IFN-γ的显著性考虑到许多个体展示零的浓度的该特定细胞因子而要小心处理。此外，观察到胶质瘤患者中卵泡抑素的水平高于健康受试者，白细胞介素10较高，血管生成素较低，瘦蛋白较高并且PDGF-BB较高。因此清楚地，这些细胞因子和血管生成因子是作为胶质瘤的血浆生物标志物的极好的候选物，并且假设许多其他细胞因子和/或血管生成因子也可以在这方面具有极好的生物标志物特征是合理的。此外，推断脑癌的其他形式通过参考细胞因子和/或血管生成因子生物标志物也是可检测的是合理的。
鉴于以上公开内容，使用本领域中已知的常规车间技术可以容易地开发相关诊断试剂盒和方法。
通过胶质瘤组织和非癌性脑组织之间的免疫组织化学比较进一步证实以上数据。图8A-8G显示了胶质瘤和非癌性脑组织之间的摄像免疫组织化学比较，即：A)显示阳性染色和未染色的肿瘤细胞的放大40倍的胶质瘤切片；B)显示阴性染色的血管的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；C)显示阴性染色的血管的放大40倍的非癌性脑组织；D)显示间质性染色的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；E)显示间质性染色尤其是轴突束染色的放大40倍的胶质瘤肿瘤切片；F)显示阴性染色的血管的放大40倍的非癌性脑组织；G)显示阳性细胞质染色的脉络丛组织。
具体地，图8A-8G显示了卵泡抑素的免疫组织化学染色，从而显示胶质瘤患者的脑组织中这种蛋白的增加的累积。
图8A-8G显示了卵泡抑素在脑组织的免疫组织化学染色期间鉴定肿瘤边缘(tumour margins)的能力。一些胶质瘤展示了肿瘤细胞的明显的卵泡抑素免疫染色，许多显示表达饲肥星形细胞形态。然而，整个肿瘤样品的染色是不均一的并且一些细胞明显地是免疫阴性的(图A)。阳性免疫染色是全部细胞质的而没有细胞膜或细胞核组分并且切片中的其他组织成分，包括血管是完全阴性的(图B)。不存在明显地预示免疫阳性或说明个体肿瘤之间的显著变化性的肿瘤或结构细胞的特定特征。非癌性(也就是正常的)脑组织是全部一致阴性的并且不存在神经元或胶质细胞的染色(图C)。在切片的轴突束之后的阴性染色细胞的存在下存在明显的间质性染色(图D和E)。不存在特定的轴突染色并且一些轴突束不吸收任何染色剂。非癌性脑轴突束是一致阴性的(图F)。存在一些来自脉络丛的细胞的某种特定细胞质染色(图G)。这可表明卵泡抑素被分泌进入CSF。
实施例2-血液样品的光谱分析
在本实施例中，使用衰减全反射傅里叶转换红外光谱法(ATR-FTIR)对血清样品执行光谱分析。
JASCO FTIR-410-Specac Golden GateTM光谱仪被用以执行光谱实验，并且血清样品的红外光谱使用我们之后共加的32次扫描在4cm-1的分辨率下扫描400-4000cm-1。
全血取样
全血样品收集自共计74名受试者，包括49名IV级胶质母细胞瘤患者和25名健康受试者。其中可能的，将样品与年龄和性别匹配。
从全血样品制备血清样品
对于74名受试者的每一名的血清样品通过允许新鲜全血样品在室温(25℃)首先凝结30至45分钟，然后在冷冻离心机中以13,200rpm(或1000-2000x g)于4℃执行离心10min以清除沉淀的样品来制备。获得的上清液是血清。离心之后，通过巴斯德移液管或类似物立即将血清转移至清洁的聚丙烯管是至关重要的。处理时将样品保持在2-8℃，并且然后分成等分试样、储存并且在–20℃或更低运输。避免冷冻-解冻循环。
在本实施例中，与上述提到的患者和健康受试者有关的血清样品由Brain TumourNorth West Biobank来提供。制备四种血清级分并且分析。制备下面的级分(“血清类型1-4”)：
1)全血清-直接供应。
2)通过离心过滤移除100kDa以上的组分的血清。
3)通过离心过滤移除10kDa以上的组分的血清。
4)通过离心过滤移除3kDa以上的组分的血清。
离心使用微型离心机联合合适的蛋白过滤器(Amicon膜过滤器,MerckMillipore)以14,000rpm按照厂家说明来执行。
将样品加载至ATR上
对于血清样品1-4的每一个，将1μL微升的血清置于ATR-FTIR配件的元件(即，ATR晶体)上并且置于室温干燥8分钟。这已经被显示对于1微升的血清是可再生的干燥时间。
图9显示了根据以上方案沉积并干燥的血清样品1(即，全血清)的膜的白光干涉图谱。跨ATR晶体的厚度在0和40微米厚度之间波动。这被发现对于全血清的ATR-FTIR分析是理想的厚度。
图10显示了根据以上方案沉积并干燥的血清样品3(10kDa以上组分被移除的血清)的膜的白光干涉图谱。跨ATR晶体的厚度在0和8微米厚度之间波动。这被发现对于全血清的ATR-FTIR分析是理想的厚度。
以上描述的样品制备过程和随后描述的分析对于每一个血清样品执行两次以便验证结果。
多种另外的侧实验(side experiment)以不同干燥时间来执行以调查干燥时间对膜厚度的有效性以及对获得的所得IR光谱特征的间接影响(结果在以下更详细的讨论)。
对制备的血清样品的ATR-FTIR光谱法
然后将加载样品的ATR晶体用JASCO FTIR-410–Specac Golden GateTM光谱仪来分析以对每一个受试者血清样品提供在4cm-1分辨率使用32次共加的扫描在400-4000cm-1之间的一系列光谱特征。IR光谱运行重复三次以产生每名受试者3次、总共222个特征。
然后将光谱特征裁剪至在1800和900波数(cm-1)之间的指纹区并且进行矢量归一化。
图11显示了血清样品类型1-4的每一个的叠加的FTIR光谱特征的代表性样品。特征的指纹区(在900和1800cm-1之间)中的变化显示是最明显的，表明在此特定区域中高度相关的信息量。
多种另外的侧实验被执行，运行多种样品的ATR-FTIR光谱以阐明ATR-FTIR的可行性和多种参数对所得光谱特征的影响。
显示膜厚度对某些IR峰的影响的ATR-FTIR侧实验
对牛血清白蛋白(BSA)执行的ATR-FTIR光谱分析已经在文献中被报道。因为BSA含有血清中也含有的一些关键组分，文献IR特征被考虑并比较。此外，根据由本发明人执行的BSA和血清实验考虑文献特征。
图12(取自Filik J,Frogley MD,等人，Analyst,2012，137，853)显示了在ATR晶体上不同平均膜厚度下的牛血清白蛋白(BSA)的样品的叠加的FTIR光谱特征。900-1800cm-1指纹区中的光谱特征中的膜厚度存在清晰的变化。
图13(取自Goormaghtigh E,等人，Biochimica et Biophysica Acta,1999，1422，105)是显示a)存在于血清样品中的两种特征性酰胺，酰胺I(1650cm-1)和酰胺II(1550cm-1)的面积比如何随BSA膜厚度而变化和b)酰胺I(1650cm-1)和TSPA内标(835cm-1)的面积比如何随BSA膜厚度而变化的图形表示。认为这些酰胺在诊断来自血清的胶质瘤中是重要的，因为这些峰中的变化显示指示与受试者中胶质瘤的存在相关或与胶质瘤相关的蛋白结构变化。然而，图13展示了样品厚度也可以影响这样的峰。因此本发明人认为期望消除或解决样品厚度变化的影响以改进增殖性紊乱例如胶质瘤的诊断中光谱法的效用。
本发明人发现当样品在ATR板上以0.8微米的厚度制备时，酰胺I和II的比在BSA样品之间保持基本上恒定。本发明人已经进一步证明当样品在ATR板上以0-40微米的厚度制备时(如以上描述的)，酰胺I和II的比在取自相同范畴中的受试者(即，两者都是健康受试者或者两者都患有胶质瘤)的全血清样品之间保持基本上恒定。此外，本发明人已经证明当样品在ATR板上以2-8微米的厚度制备时(如以上描述的)，酰胺I和II的比在取自相同范畴中的受试者(即，两者都是健康受试者或者两者都患有胶质瘤)的血清样品类型3(即，超过10kDa的组分被移除的血清)之间保持基本上恒定。
因此，这些结果显示对血清样品的ATR-FTIR光谱法是辨别胶质瘤患者和健康受试者的可行的方法，尽管优化样品制备对优化结果是至关重要的。在ATR板上的样品厚度显示对特征的诊断质量特别相关。
展示样品干燥时间对IR特征的影响的ATR-FTIR侧实验
在分析之前，对ATR晶体上具有不同干燥水平的相同人全血清执行几次ATR-FTIR光谱分析。在应用于ATR晶体之后，如以上描述的，在执行光谱分析之前，在ATR晶体的表面上在室温(25℃)干燥血清样品0、2、4、6、8、16和32分钟。
图14显示了在室温干燥0、2、4、6、8、16和32分钟的人全血清的多种叠加的光谱特征。膜越干燥，在900-1800cm-1之间的指纹区显示存在的信息越多，并且因此所述特征对于与胶质瘤有关的诊断分析越合适。然而，对于长的干燥时间存在权衡，因为本发明人试图提供通过光谱法快速诊断增殖性紊乱的诊断工具。这样，干燥时间在6和12分钟之间、优选地约8分钟将显示是最佳的，因为8分钟以上的干燥时间在指纹区中获得很少的额外信息。
血清样品的光谱特征的后处理
将与胶质瘤患者和健康受试者有关的所有光谱特征和对应的实际信息(例如医学状况、性别、年龄等)上载至数据库，例如MATLABTM，以便它们可以被再调用、测试、统计分析或甚至用作用于测试尚未关联的特征的比较数据集。
将血清类型1样品获得的74个光谱特征(×3)(74名受试者的全血清样品，所有根据以上描述的优化的8分钟方案干燥)分成“训练集”(三分之二)和“盲集”(三分之一)：
-对于取自49名IV级胶质母细胞瘤患者的全血清样品的特征，33个训练的，16个盲的；并且
-对于取自25名健康受试者的全血清样品的特征，17个训练的，8个盲的。
然后使用两种不同模式识别算法，将训练集用于建立预测模型：
1)支持向量机(SVM)-例如RBF，参见Baker等人，Analyst 2010，135(5)，Sattlecker等人，Analyst 2010，135(5)；以及
2)主成分判别函数分析(PC-DFA)。
被分为特征的“训练集”和特征的“盲集”之后，特征可以被用于开发可以对未分配的特征分配有利的或不利的诊断结果的强有力的预测模型。使用模式识别算法通过执行网格搜索以优化成本和伽马函数以保证它可以鉴定出训练集来训练“训练集”，从而产生可行的预测模型。然后将“盲集”提供至模型，该模型然后被请求预测盲集中的单个特征是否应该与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。然后可以将预测翻译成阐明进行了那些预测的“混淆矩阵”。然后可(例如通过验证例如来自活组织检查的实际结果)验证这些预测以计算模型的灵敏度和特异性。
图15是阐明当使用预测模型评估“盲集”时，全血清预测模型的训练集准确度的图表。当使用由训练集产生的预测模型以对“盲集”特征分配诊断结果时，216个光谱(即，其中3次重复光谱均被使用)中的21个被错误分类，给出88.19％的灵敏度和94.44％的特异性。
对血清类型3(10kDa以上分子量组分被移除)样品获得的74个光谱特征(×3)执行相同的训练，该样品仍然根据以上描述的优化的8分钟方案被全部干燥。这些再次被分成“训练集”(三分之二)和“盲集”(三分之一)，正如以上关于血清类型1样品描述的。
图16是阐明当针对预测模型评估相关的“盲集”时，血清类型3预测模型的训练集准确度的图表。当使用由训练集产生的预测模型对“盲集”特征分配诊断结果时，216个光谱(即，其中3次重复光谱均被使用)中的38个被错误分类，给出78.9％的灵敏度和88.9％的特异性。
这样，在总体灵敏度和特异性方面，血清类型1(全血清)显示产生比血清类型3更好的预测模型。这甚至进一步简化了本发明的诊断方法，因为不需要进一步处理全血清以便获得可靠的诊断结果。
这些结果展示与增殖性紊乱例如胶质瘤相关的光谱特征的极好的诊断潜力。清楚地，描述的预测模型可以通过训练更大的特征数据库集来进一步改善。更为改善的数据库可以另外包含关于调查的受试者的另外的真实信息，这可使更具患者特异性的预测成为可能。特征数据库可容易地被单独使用或与预测模型联合使用以将未分配的特征与有利的或不利的诊断结果关联，例如通过“最佳匹配”比较。
诸如本文描述的那些的预测模型可以容易地被并入诊断试剂盒的机载计算机(on-board computer)上安装的计算机软件中，以便提供能够执行快速诊断的简易诊断试剂盒。这样的诊断试剂盒可以并入光谱装置或否则能够与光谱装置(或其相关的特征储存单元)通讯以便预测算法可以对获得的血清特征运行。由于由本发明对本领域做出的贡献，现在容易想到如何产生简易的、有成本效益的诊断试剂盒，该试剂盒允许仅从血液样品快速诊断增殖性紊乱。使用本领域中已知的技术，诊断试剂盒可以容易地被改造以包括自动化本文描述的任何或所有方法步骤的一系列功能。
同样容易想到本文描述的光谱诊断试剂盒如何可与测定试剂盒联合使用以提供高度准确、可靠和良好验证的诊断结果而不需要侵入性活组织检查或高成本成像。可选地，本文描述的诊断方法和试剂盒可以被用于在昂贵的和/或侵入性诊断方法被使用之前的预筛。
实施例2A-血液样品的光谱分析
方法和材料
血清样品
血液样品收集自诊断患有多形性胶质母细胞瘤(GBM)脑瘤(即，高级别)的49名患者、诊断患有低级别胶质瘤(星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤)的23名患者和25名正常(非癌)患者。样品从Walton Research Tissue Bank和Brain Tumour North West(BTNW)Tissue Bank获得，其中全部患者已给出研究同意书。血液样品的细节概述在下面表16中。
将全部血液样品在操作前取出。自血液解冻至离心，使血清管置于室温凝结持续最小30分钟并且最大2小时。通过在1,200g离心10min完成凝块的分离并且将500μl血清等分试样分装入预先标记的冷冻管中。使用液氮快速冷冻血清样品并且储存在-80℃。
整个样品集的平均年龄是54.62岁。可能的话，将GBM的年龄和性别以及对照血清样品匹配。
表16-血液样品细节
肿瘤级别 受试者数目 年龄范围/平均年龄 性别
正常(非癌) 25 26-87/59.1岁 29名男性，20名女性
低级别 23 19-60.3/36.9岁 11名男性，12名女性
高级别 49 24.7-78.8/60.1岁 15名男性，10名女性
干燥研究
将混合的汇集的正常人类血清(0.2μL无菌过滤的，CS100-100，购自TCSBiosciences,UK)以1μL的体积使用以确定质量光谱收集所必需的最佳干燥时间。
使用配备Specac ATR单反射金刚石Golden GateTM的JASCO FTIR-410光谱仪，在中央兰开夏大学，在4000-400cm-1的范围内，以4cm-1的分辨率并且超过32次共加的扫描收集光谱。在每一次光谱收集之前，收集背景吸收光谱用于大气校正。
将1μL的血清用移液管吸至ATR-FTIR晶体上并且以0、2、4、8、16和32分钟间隔收集光谱以观察干燥过程中的光谱变化。使用无水乙醇(购自Fisher Scientific,Loughborough,UK)，将干燥的紧密血清膜从晶体洗掉。对于每1μL的干燥的血清收集一个生物重复和两个技术重复。干燥实验被重复多次以获得在干燥期间特定时间的代表性光谱。
方差研究
将混合的汇集的正常人血清(0.2μL无菌过滤的，CS100-100，购自TCSBiosciences,UK)用于方差研究，其中将1μL用移液管吸至ATR-FTIR单反射金刚石晶体上并且干燥8分钟，这时收集3个光谱。每1μL收集三个光谱并且重复50次。在每一次方差重复之间用无水乙醇(购自Fisher Scientific,Loughborough,UK)将干燥的血清斑从晶体洗掉。总共，自方差研究收集150个ATR-FTIR光谱。
ATR-FTIR光谱诊断模型
在光谱收集之前，将所有全血清样品解冻并且使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器(购自Millipore Limited,UK)制备100kDa、10kDa和3kDa过滤等分试样[图1]。离心过滤器过滤掉滤膜的截止点(即，100kDa)以上的血清组分，允许滤膜截止点以下的组分通过。
图17显示了0.5ml的血清被移液管吸入离心过滤器(左)并且离心，使得过滤器保持大于千道尔顿范围(100、10或3kDa)的所有血清成分，仅允许含有最大范围以下的成分的血清滤液通过。
每一个全血清样品(高级别、低级别和对照)具有过滤等分试样，该过滤等分试样通过将0.5mL的全血清用移液管吸取进入过滤设备并且对于100kDa、10kDa和3kDa过滤装置分别在14,000rpm离心10分钟、15分钟和30分钟而制备。
光谱以随机顺序在血清样品集中被收集。对于每一个样品，将1μL血清斑在ATR-FTIR晶体上干燥8分钟，这时收集3个光谱。此程序每一个样品重复三次。结果，对于每一个样品，收集9个光谱。在光谱收集之前，在将1μL用移液管吸取至ATR-FTIR晶体上之前收集背景吸收光谱(用于大气校正)，因此收集每个血清重复样品的背景。在使用消毒剂(购自Antec Int.,Suffolk,UK)和无水乙醇(购自Fisher Scientific,Loughborough,UK)的每一个程序之间，将干燥的血清膜从晶体洗掉。
光谱在4000-400cm-1范围内，以4cm-1的分辨率和平均超过32次共加的扫描获得。总计，自所有全血清样品和过滤血清样品收集3375个ATR-FTIR光谱。表2显示了在每一个血清级别和过滤范畴内光谱和患者的总数目。
表17-对于用于被分析的癌症血清严重性的范围的每一个过滤组合物的收集的光 谱数目和患者数目(括号中)
数据分析
使用内部编写软件对MatlabTM(7.11.0(R2010b)(The MathWorks,Inc.USA)中的原始光谱数据实施预处理和多变量(MVA)分析。
结果
干燥研究
图18显示了在室温干燥0、2、4、6、8、16和32分钟的人全血清的多种叠加的ATR-FTIR光谱特征。光谱已经被偏调以便易于可视化。
图18展示了在干燥期间经过0-32分钟的范围，从1μL人全血清所通常观察到的ATR-FTIR晶体数据。光谱已经被偏调以便易于可视化。通过重复干燥实验发现，在室温(～18℃)1μL的血清在8分钟之后干燥。有效的光谱收集需要血清样品和ATR-FTIR晶体之间的紧密接触以允许与瞬逝场的相互作用；这可以通过允许液体血清样品干燥来实现。干燥允许条带的强度随着膨胀降低而呈指数地提高，因此降低反射干涉(水)和样品分子之间的距离。
方差研究
图19A-D显示了(A)全血清光谱(900-3900cm-1)和(B)相比于预处理的数据(噪音降低(30PC)和矢量归一化)的指纹区(900-1800cm-1)(C)预处理的全血清光谱和(D)预处理的指纹区的原始的且未加工的光谱数据。可变的CO2区(2300-2400cm-1)已经被移除。四个光谱展示了由标准偏差(STD)误差范围围绕的平均光谱。在两个分析的波数区中，原始(未处理的)光谱数据之间的最大方差是在1637.27cm-1(STD:0.4209)处。在3900-900cm-1之间，原始数据中的最小方差是在3735.44cm-1(STD:0.0038)处并且在指纹区中是在1792.51cm-1(STD:0.0138)处。将噪音降低(30种主成分)和矢量归一化预处理方法应用于数据以降低基线并使数据平滑。预处理方法显著降低光谱数据的STD和方差。在1637.27cm-1处的最大原始数据STD从0.4209降低至0.0043(预处理的)，195.9％的差异。在3735.44cm-1处的最小光谱方差STD从0.0038降低至0.00123，并且在1792.51cm-1处从0.0138降低至0.0004。跨3900-900cm-1的原始和预处理的数据的平均STD分别是0.0137和0.0015。原始光谱的STD值开始是低的，但是通过实施预处理方法被进一步降低。使用ATR-FTIR的光谱数据的再现性是高的并且展示最小方差，尤其在预处理之后。
预处理选择数据
对于每一个全血清样品集和过滤血清样品集，使用相同的方法预处理光谱数据，并且使用多变量分析法分析。首先，为了移除来自分析模型的任何偏差，将来自每一个样品的技术重复平均使得每一个血清样品集包含来自每一个患者的三个光谱；来自每一个患者斑的一个平均光谱。然后使用辨别异常光谱数据的质量检验，将离群值从光谱集移除。在这种情况下，质量控制的光谱通常对应于特定患者。
使用数据的前30种主成分，对光谱执行基于主成分的噪音降低以改进信噪比。这之后，将所有光谱矢量归一化并且均值中心化(mean centred)。还使用数据的二阶导数光谱分析光谱数据，但是对于PCA和SVM的最好总结果是使用噪音降低、矢量归一化和均值中心化程序来实现。
对预处理的光谱执行主成分分析(PCA)，给出负载可以由其解释的无监督分类。使用基于径向的函数(RBF)内核，还将支持向量机(SVM)应用于数据集。使用MATLAB中LIBSVM代码(Chih-Chung Chang和Chih-Jen Lin,LIBSVM:a library for support vectormachines.ACM Transactions on Intelligent Systems and Technology,2:27:1-27:27,2011。软件在http://www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm上可获得)，对数据执行自动n折交叉验证以找出成本和伽马函数的最佳值。然后使用由三分之二的患者相关的光谱数据组成的随机选择的训练集，将这些值用于训练一对多模式中的SVM。然后将组成盲测集的剩余数据投入模型，并且计算混淆矩阵，给出基于真实的和预测的数据类别标签的总SVM分类准确度。计算关于每一个SVM模型和每一个独立的疾病组的灵敏度和特异性。
展示在下面表18、19和20中的结果源自三个不同的测试和盲光谱集以提供全血清的灵敏度和特异性的范围。
表18-对全血清的测试1的统计分析
最佳SVM：C＝22.63，γ＝4，训练准确度＝85.86％，SVM总准确度＝96.875％
表19-对全血清的测试2的统计分析
2 正常 低 高 总平均值
患者灵敏度 75 87.50 92.86 85.12
患者特异性 95.45 95.45 87.5 92.80
光谱灵敏度 78.26 91.67 92.86 87.60
光谱特异性 95.45 96.88 89.13 93.82
表20-对全血清的测试3的统计分析
3 正常 低 高 总平均值
患者灵敏度 87.5 87.5 93.33 89.44
患者特异性 100 95.65 87.5 94.38
光谱灵敏度 87.5 85 93.18 88.56
光谱特异性 100 95.45 86.36 93.94
展示在下面表21中的结果源自对100kDa过滤的血清的对应测试。
表21-用于对100kDa过滤的血清的测试的统计分析
最佳SVM：C＝2048,γ＝0.85,训练准确度＝72.58％,SVM总准确度＝79.57％
正常 低 高 总平均值
患者灵敏度 50 57.14 100 69.05
患者特异性 95.45 95.45 66.7 85.87
光谱灵敏度 54.17 61.90 93.75 69.94
光谱特异性 94.12 94.12 67.44 85.39
缩写
ATR-衰减全反射
Basic FGF-碱性成纤维细胞生长因子
β-NGF-神经生长因子-β
CTACK-皮肤T-细胞虏获趋化因子
FTIR-傅里叶转换红外
G-CSF-粒细胞集落刺激因子
GM-CSF-粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
GRO-生长相关致癌基因
GRO-α-生长相关致癌基因α
HGF-造血生长因子
ICAM-1-细胞间粘附分子1
IFN-gamma-干扰素γ
IGFBP-1-***结合蛋白1
IL-1α-白细胞介素1α
IL-1β-白细胞介素1β
IL-1ra-白细胞介素1受体拮抗剂
IL-1R1-白细胞介素1受体相关蛋白1
IL-1R4/ST2-白细胞介素1受体4，ST2
IL-2-白细胞介素2
sIL-2Rα-白细胞介素2可溶性受体α
IL-3-白细胞介素3
IL-4-白细胞介素4
IL-5-白细胞介素5
IL-6-白细胞介素6
IL-6R-白细胞介素6受体
IL-7-白细胞介素7
IL-8-白细胞介素8
IL-10-白细胞介素10
IL-11-白细胞介素11
IL-12p40-白细胞介素12p40
IL-12p70-白细胞介素12p70
IL-13-白细胞介素13
IL-15-白细胞介素15
IL-16-白细胞介素16
IL-17-白细胞介素17
IL-18-白细胞介素18
IR–红外
MCP-1-单核细胞趋化蛋白1
MCP-3-单核细胞趋化蛋白3
M-CSF-巨噬细胞集落刺激因子
MIF-巨噬细胞迁移抑制因子
MIG-γ干扰素诱导的单核因子
MIP-1α-巨噬细胞炎性蛋白1α
MIP-1β-巨噬细胞炎性蛋白1β
MIP-1δ-巨噬细胞炎性蛋白1δ
MIP-3α-巨噬细胞炎性蛋白3α
MIP-3β-巨噬细胞炎性蛋白3β
MSP-α-巨噬细胞刺激蛋白α链
PAI-1–纤溶酶原激活物抑制剂1
PDGF AA-血小板源生长因子AA
PDGF-BB-血小板源生长因子BB
PlGF-胎盘生长因子
RANTES-活化调节的正常T细胞表达因子(Regulated upon activation,normalT-cell expressed)
SCF-干细胞因子
SDF-1-基质细胞衍生因子
sgp130-可溶性糖蛋白130
sHER2neu-人表皮生长因子受体2
sIL-6R alpha-可溶性白细胞介素6受体α
sTNF RI-可溶性TNF受体I
sTNF RII-可溶性TNF受体II
sVEGFR1-可溶性血管内皮生长因子受体1
TARC-胸腺活化调节趋化因子
TECK-胸腺表达趋化因子
TGF-beta 1-肿瘤坏死因子β1
TGF-beta 3-肿瘤坏死因子β3
TIMP-1-金属蛋白酶组织抑制剂1
TIMP-2-金属蛋白酶组织抑制剂2
TNF-α-肿瘤坏死因子-α
TNF-β-肿瘤坏死因子-β
TPO-血小板生成素
TRAIL R3-TNF相关的凋亡诱导配体受体3
TRAIL R4-TNF相关的凋亡诱导配体受体4
VEGF-血管内皮生长因子
VEGF C-血管内皮生长因子C
VEGF-D-血管内皮生长因子D
多种可选的实施方案
以下编号的段落引用了本发明的某些可选择的方面和实施方案：
1.诊断和/或预测受试者中的增殖性紊乱的方法，所述方法包括对所述受试者的血液样品(或其组分)进行光谱分析，以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征；其中所述光谱分析为衰减全反射FTIR(ATR-FTIR)，其中在IR分析期间“ATR晶体”支持所述血液样品。
2.如段落1所述的方法，其中被诊断和/或预测的所述增殖性紊乱为脑癌(和/或相关肿瘤)。
3.如段落2所述的方法，其中所述脑癌为胶质瘤。
4.如段落1至3中任一段落所述的方法，其中在FTIR分析前所述血液样品的膜被施加至所述ATR晶体的表面。
5.如段落4所述的方法，所述方法包括将0.5-1.5μL所述血液样品沉积在所述ATR晶体的表面并允许所述血液样品干燥，以得到适当厚度的血液样品膜。
6.如段落4所述的方法，其中干燥在标准的环境温度和压强(SATP)下持续4和16分钟之间，或在得到相同干燥水平的其他等效条件下实现。
7.如段落4至6中任一段落所述的方法，其中所述血液样品膜具有在+/-40μm或更小的公差内的基本上均一的厚度。
8.如段落4至7中任一段落所述的方法，其中所述血液样品膜跨所述ATR晶体的所述表面(或至少其暴露至IR分析的部分)具有1μm和200μm之间的最大膜厚度(即最大厚度的点)。
9.任一前述段落所述的方法，其中所述血液样品特有的所述光谱特征(即，特征区)为在900cm-1和1800cm-1之间的光谱。
10.如任一前述段落中的任一段落所述的方法，其中将光谱获得的特征与数据库(例如“训练集”)中储存的多个预先关联的特征比较，以便得出与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联。
11.如任一前述段落中任一段落所述的方法，其中基于通过“训练”(例如经由模式识别算法)预先关联的分析的数据库开发的预测模型将光谱获得的特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联。
12.如任一前述段落所述的方法，其中所述血液样品为血清或血浆。
13.如段落12所述的方法，其中所述血液样品为血清。
14.如段落13所述的方法，其中所述血清为人全血清。
15.如任一前述段落所述的方法，其中所述方法另外包括在一种或更多种(合适地预先指定的)细胞因子和/或血管生成因子方面测定所述受试者的血液样品(或其组分)。
16.一种诊断肿瘤是恶性还是良性的方法，所述方法包括根据段落1至15中任一段落所述的诊断和/或预测脑癌或增殖性紊乱的方法的步骤。
17.一种用于诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的诊断试剂盒，所述试剂盒包括被配置以接收来自所述受试者的血液样品(或其组分)并且对所述受试者的所述血液样品(或其组分)进行光谱分析，以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征的装置；以及将所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果关联或有助于所述血液样品(或其组分)的所述光谱特征与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联的装置(任选地，与被配置以接收血液样品的所述装置相同)；其中所述光谱分析为衰减全反射FTIR(ATR-FTIR)，其中在IR分析期间“ATR晶体”支持所述血液样品。
18.如段落17所述的诊断试剂盒，其中用于分析所述血液样品的所述的装置与用于关联所述结果或有助于所述结果的关联的所述装置相同。
19.如段落17至18中任一段落所述的诊断试剂盒，其中所述关联装置包括计算机或与计算机通讯，该计算机安装有诊断计算机软件，所述诊断计算机软件被配置以操作所述计算机基于受试者的血液样品的光谱特征执行与增殖性紊乱有关的预测性诊断和/或预测。
20.如段落17至19中任一段落所述的诊断试剂盒，其中被配置以接收血液样品的所述装置被配置以自动地制备需要的厚度和干燥的血液样品(或其组分)。

Claims (10)

1.被配置为接收受试者的血液样品(或其组分)并对所述受试者的血液样品(或其组分)执行光谱分析以产生所述血液样品(或其组分)特有的光谱特征的装置在制备用于诊断和/或预测受试者中增殖性紊乱的试剂盒中的用途；其中所述光谱分析是衰减全反射FTIR(ATR-FTIR)，其中在IR分析期间，“ATR晶体”支持所述血液样品。
2.如权利要求1所述的用途，其中被诊断和/或预测的所述增殖性紊乱是脑癌(和/或相关的肿瘤)。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述脑癌是胶质瘤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述血液样品的膜在FTIR分析之前被施加至所述ATR晶体的表面。
5.如权利要求4所述的用途，其中0.5-1.5μL所述血液样品被沉积在ATR晶体的表面上并且允许所述血液样品干燥以产生合适厚度的血液样品膜。
6.如权利要求4所述的用途，其中干燥在标准的环境温度和压强(SATP)下持续4和16分钟之间或在产生相同干燥水平的其他等效条件下实现。
7.如权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述血液样品膜具有在+/-40μm或更小的公差内的基本上均一的厚度。
8.如权利要求4至7中任一项所述的用途，其中所述血液样品膜跨所述ATR晶体的所述表面(或至少其暴露至IR分析的部分)具有在1和200μm之间的最大膜厚度(即，最大厚度的点)。
9.如任一前述权利要求所述的用途，其中所述血液样品特有的所述光谱特征(即，特征区)是在900和1800cm-1之间的光谱。
10.如任一前述权利要求中任一项所述的用途，其中将光谱获得的特征与数据库(例如“训练集”)中储存的多个预先关联的特征比较，以便得出与有利的或不利的诊断结果和/或预测结果的关联。
CN201810903771.XA 2012-11-15 2013-11-14 用于诊断增殖性紊乱的试剂盒的制备 Active CN108956968B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

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