CN108950014A - 与中国家马高海拔适应性相关的snp标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记及应用。所述SNP标记位于中国家马7号染色体73967052bp～73965421bp之间，其中SNP位点为73966633bp处碱基，该处碱基为A或G。所述SNP标记的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明对于通过基因型区分和筛选出具高海拔适应性的中国家马具有较大的指导意义，当中国家马的基因型为GG、AG时可判定马匹能够适应高海拔，当其基因型为AA时可判定马匹不能适应高海拔，此法可以提高家马高海拔适应性筛选的准确率和效率。

Description

与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记及应用。
背景技术
经过长期的自然选择和人工选择，世代生长在高海拔环境地区的动物在生理、生化及形态学上都已经形成了稳定的适应高原环境的表型恃征，使得它们能够很好的适应当地环境。对世代生存于高海拔地区的物种的全基因组测序，能够全面地了解其适应高海拔环境的分子基础。
高通量测序技术的快速发展，促使大多数家养动物的基因组测序完成，促进高密度SNP芯片及全基因组测序技术的普及，在基因组的大时代背景下，为利用大规模的基因组数据以及各种生物信息学和进化基因组学的方法来研究物种适应性进化提供了基础。
与传统的单基因分析比较，通过扫描基因组大量的SNP位点信息，再依据所有考察位点的特征，采用相应的检验方法，鉴定基因组上受选择信号的区域，这种基因组水平的群体遗传分析能更精确地发现自然选择。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。
血红蛋白亚基ε-1(hemoglobin subunit epsilon-1，HBE1)是血红蛋白的组成亚基之一，通常在胚胎卵黄囊中表达，随着胎儿的发育被逐渐替换。在高海拔缺氧环境下，高原居民和动物为满足机体对氧气的需求，主要通过红细胞数量、红细胞压积、血红蛋白浓度、血液总量和血红蛋白对氧的亲和力等血液生理指标的变化来适应低氧环境。作为血红蛋白构成之一的血红蛋白亚基ε-1自然参与机体适应低氧环境的调控，
发明内容
本发明的目的是提供一种与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供的与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记，所述SNP标记位于中国家马7号染色体73967052bp～73965421bp之间(马HBE1基因上)，其中SNP位点为73966633bp处碱基，该处碱基为A或G。所述SNP标记的序列如SEQ IDNO:1所示(SNP位点为546bp处碱基n，n为a或g)。
本发明中，马HBE1基因的核酸序列参见GenBank，Gene ID:100068926：73967052-73965421。
所述SNP标记的AA基因型对应的马匹不具有高海拔适应性，所述SNP标记的GG或AG基因型对应的马匹具有高海拔适应性。
本发明还提供用于扩增所述SNP标记的引物，包括(SEQ ID NO:2-3)：
正向引物F：5’-CAGTGATGCCCACTTGAGGT-3’
反向引物R：5’-CACCCCTGAGGGACACATCT-3’
第二方面，本发明提供含有所述引物F和R的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供所述SNP标记、所述引物F和R或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定及早期筛选具有高海拔适应性的中国家马品种中的应用。
所述应用包括以下步骤：
1)提取待测马匹的基因组DNA；
2)以待测马匹的基因组DNA为模板，利用引物F和R进行PCR扩增反应；
3)分析PCR扩增产物。
步骤2)中进行PCR扩增所使用的反应体系为：
PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸30秒，40个循环；68℃终延伸5分钟。
步骤3)对PCR扩增产物进行分析：AA基因型对应的马匹不具有高海拔适应性，GG或AG基因型对应的马匹具有高海拔适应性。
第四方面，本发明提供所述SNP标记、所述引物F和R或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在中国家马分子标记辅助育种中的应用。
第五方面，本发明提供所述SNP标记、所述引物F和R或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在马基因HBE1基因分型中的应用。
发明人对来自高低海拔的中国家马进行了大量的基因型与海拔相关性研究，发现本发明提供的SNP位点与家马高海拔适应性极显著关联(P<1.187e-043)。等位基因G在高海拔中的频率达到56.99％，而在低海拔马中频率只有6.41％。基因型GG在高海拔马匹中大量出现，而基因型为GG的马匹的平均血红蛋白浓度显著高于基因型为AA的马匹(P<0.002618，卡方检验)，对于通过基因型区分和筛选出具高海拔适应性的中国家马具有较大的指导意义，当中国家马的基因型为GG、AG时可判定马匹能够适应高海拔，当其基因型为AA时可判定马匹不能适应高海拔，此法可以提高家马高海拔适应性筛选的准确率和效率。
所述SNP位点及其两端的侧翼序列组成的核苷酸序列(SNP标记)如SEQ ID NO:1所示，该序列第385bp处存在A/G突变。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的分子标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势海拔适应性品种的育种进程。
(二)检出中国家马HBE1基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。
(三)中国家马HBE1基因SNP位点的检出，为中国家马的高海拔适应性的标记辅助选择提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述SNP标记的三种基因型测序峰图；其中，(a)为AA型；(b)为GG型；(c)为AG型。
图2为本发明实施例1中所述SNP标记的三种基因型的分型结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1中国家马HBE1基因多态性位点的鉴定
1、提取待测中国家马血液中的基因组DNA
采集来自中国和国外的11个马品种，308匹家马(包括110匹来自青藏高原的藏马和198匹来自平原地区的马)的血样(表1)，采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。
表1样品采集表
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
根据NCBI数据库收录的HBE1基因座位(chr7:73967052-73965421)的序列设计引物，包括正向引物F：5'-CAGTGATGCCCACTTGAGGT-3'和反向引物R：5'-CACCCCTGAGGGACACATCT-3'，以步骤1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO:1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的385bp处，此处碱基为A或G。
其中，PCR反应使用的扩增体系以25μL计为：
PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸30秒，40个循环；68℃终延伸5分钟。
3、检测PCR扩增片段，获得SNP标记
对步骤3中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中第546bp处碱基为G，则待测中国家马属于能够适应高海拔的品种。三种基因型的测序峰图如图1所示。
4、基因型判定
通过飞行时间质谱的分析方法对待测中国家马的基因型进行检测；根据飞行时间质谱的结果判定SNP位点在待测群体中的基因型。根据样品的信号分布位置，基因型可分为AA型，GG型和AG型。三种基因型的分型结果如图2所示。
实施例2中国家马不同基因型与高海拔适应性的关联分析与检测应用
对实施例1中的分型结果进行高低海拔适应性关联分析，运用PLINK软件中FDR矫正和“adaptive”模型进行全基因组关联分析，发现上述SNP位点与高海拔适应性显著关联(P<1.187e-043)。等位基因G在高海拔中的频率达43.01％，而在低海拔马中频率只有6.41％。基因型GG大部分出现在高海拔的马匹中，基因型AA大量出现在低海拔马匹中，基因型为GG的马匹的平均血红蛋白浓度显著高于基因型为AA的马匹。
实施例3本发明方法的具体应用
利用本发明提供的SNP标记对中国家马的HBE1基因座位进行扩大群体分析。运用R软件的卡方检验进行分析，所述SNP标记在高海拔马中的等位基因G的频率显著高于在其他低海拔的马匹中的等位基因G的频率(P<2.2e-16)。进一步验证了该处SNP位点的等位基因G与中国家马的高海拔适应性相关(表2)。
表2SNP位点在中国矮马与非矮马品种中的基因型频率以及等位基因频率
表型 AA AG GG
高海拔马 38 84 64
非高海拔马 140 4 12
HBE1是调控高海拔适应性的关键基因之一，这在人、山羊、绵羊等物种中已得到证明。在对中国高海拔地区的河曲马和低海拔地区的关中马进行全基因组重测序和全基因组选择信号筛选，发现HBE1基因座位的多态性变异与我国家马的高海拔适应性有关，并且在我国11个品种308个体中得到了验证。不同的基因型与河曲马和关中马的平均血红蛋白浓度相关。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记及应用
<130> KHP181113739.4
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 742
<212> DNA
<213> 马(Equus caballus)
<400> 1
agaactccta gattcaggac tagtgatagt aaagggatac tagcagcctg agtttactta 60
aaacttttca agaattgttg tcagaactgg acttgtttat cctatagaat atcagagcat 120
agctgacttg ttcaaagagg aatggaattt gacttttgat agatgaaggc ctatctcaaa 180
gaaggagaaa tgccttattt tatgtggttc ttatgactga agtttaggaa gagatttggg 240
gaaaaaaaat tctggacaga ttatctcaga gaaaaataaa aaaaaatttc tctaaaggat 300
actaaattac ctgtcaataa attacctgtc aagtaggagg aagcttgtta ttgcattggt 360
tagagacgtt aaactcactc tgagaaccca tgcagccctg aaatcctatg attacaggaa 420
ttagataatt ggtaaatgag aaaggaaggg agagaggcaa gtcaaaatga tgaaatgaga 480
gggagggtgg agccataagt aggcagaatg ttgaatggaa aggtcatgca tattaaatgg 540
aattgnggga ctagagtatg tgagttattt ggataggcat aacccttgga gcaggttaag 600
gtgcagagtt ggcagggagt ggaggtctta gccatttttc ctgcaatttc tgggggaaat 660
ttctactcaa cacacctatt tgtcattttg tctttcacct aacagctcct gggcaatgtg 720
ctggtgatta tcctggcttc tc 742
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtgatgcc cacttgaggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacccctgag ggacacatct 20

Claims (10)

1.与中国家马高海拔适应性相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于中国家马7号染色体73967052bp～73965421bp之间，其中SNP位点为73966633bp处碱基，该处碱基为A或G；
所述SNP标记的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的AA基因型对应的马匹不具有高海拔适应性，所述SNP标记的GG或AG基因型对应的马匹具有高海拔适应性。
3.用于扩增权利要求1或2所述SNP标记的引物，其特征在于，包括：
正向引物F：5’-CAGTGATGCCCACTTGAGGT-3’
反向引物R：5’-CACCCCTGAGGGACACATCT-3’。
4.含有权利要求3所述引物的检测试剂或试剂盒。
5.权利要求1或2所述SNP标记、权利要求3所述引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在鉴定及早期筛选具有高海拔适应性的中国家马品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测马匹的基因组DNA；
2)以待测马匹的基因组DNA为模板，利用引物F和R进行PCR扩增反应；
3)分析PCR扩增产物；
其中，所述引物F和R的定义同权利要求3所述。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增所使用的反应体系为：
PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸30秒，40个循环；68℃终延伸5分钟。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤3)对PCR扩增产物进行分析：AA基因型对应的马匹不具有高海拔适应性，GG或AG基因型对应的马匹具有高海拔适应性。
9.权利要求1或2所述SNP标记、权利要求3所述引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在中国家马分子标记辅助育种中的应用。
10.权利要求1或2所述SNP标记、权利要求3所述引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在马基因HBE1基因分型中的应用。
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