CN108950008B

CN108950008B - 一种提高湖羊产羔数的多位点聚合效应分析的育种方法

Info

Publication number: CN108950008B
Application number: CN201810680809.1A
Authority: CN
Inventors: 柳广斌; 杨新月; 刘德武; 李耀坤; 孙宝丽
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: CN108950008A

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别是涉及到一种提高湖羊产羔数性状的多位点聚合效应分析的育种方法。以BMPR‑IB基因为影响湖羊产羔数性状的候选基因，在该基因中存在3个SNPs分子标记，分别为T‑87C位点，A746G位点和G765A位点，对所述的SNPs分子标记进行T‑87C/A746G/G765A三位点聚合效应分析，发现CCGGGA为最佳组合基因型，本发明通过优选该组合基因型，能够加快湖羊产羔数性状的遗传进展，提高湖羊早期选种的效率，从而有效提高肉羊养殖业的经济效益。

Description

一种提高湖羊产羔数的多位点聚合效应分析的育种方法

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及到一种提高湖羊产羔数的多位点聚合效应分析的育种方法。本发明通过将所述的分子标记组合使用到湖羊产羔数性状的研究中及湖羊早期选种的工作中。

背景技术

繁殖性状是重要的经济性状，对于种畜而言，繁殖力就是生产力，繁殖性能直接关系到肉羊产业的经济效应。在传统的育种方法中，对家畜性状选择的方法多依赖于家畜的表型选择，对于大型家畜的选育往往需要长达几十年的时间，很难迅速地改善家畜群体的繁殖性能，而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。随着分子生物技术的发展，尤其是分子标记辅助选择(marker assistedselection，MAS)技术的发展和完善，直接在分子水平上对产羔数性状的基因型进行选择，利用与目标性状紧密连锁的分子遗传标记，对目标性状进行跟踪性选择，减少育种进程中选择的盲目性，从而大大提高育种效率。

此外，绵羊的繁殖性状属于低遗传力的阈性状。目前，国内外学者已对影响绵羊产羔数众多基因的单个位点的效应进行了大量的分析，但对多个位点之间的聚合效应分析尚未进行深入研究。在绵羊的选育中，若只考虑单一位点对产羔数的影响，可能会导致统计结果较大程度的偏离实际，因此，同时研究多个位点对绵羊产羔数的影响，将有助于实现对目的性状的可靠选择。而本发明所采用的以分子辅助标记基因为基础的多位点聚合效应分析方法，就是同时将多个目的基因座上表现优良的基因型同时集中到同一个体中，以选育出符合育种目标的优良种母羊。这对实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合，从而提高绵羊的繁殖效率有着重要意义。

骨形态发生蛋白受体IB(Bone morphogenetic protein IB receptor,BMPR-IB)基因，也称ALK-6，存在于许多细胞类型中，主要是调节生长和分化的多功能蛋白，对维持雌性动物的正常繁殖功能也发挥着重要的作用(Chu M X,Liu Z H,Jiao C L,etal.Mutations in BMPR-IB and BMP-15genes are associated with litter size inSmall Tailed Han sheep(Ovis aries).[J].Journal of Animal Science.2007,85(3):598.)。绵羊的BMPR-IB基因位于6号染色体上，包含10个外显子，共编码502个氨基酸(LiuF,Ventura F,Doody J,et al.Human type II receptor for bone morphogenicproteins(BMPs):extension of the two-kinase receptor model to the BMPs.[J].Molecular&Cellular Biology.1995,15(7):3479-3486；Montgomery G W,Lord E A,Penty J M,et al.The Booroola Fecundity(FecB)Gene Maps to Sheep Chromosome 6[J].Genomics.1994,22(1):148-153)。FecB基因是在Booroola Merino绵羊中识别出的与高繁殖力显著相关的第一个主效基因(Davis G H,Montgomery G W,Allison A J,etal.Segregation of a major gene influencing fecundity in progeny of Booroolasheep[J].New Zealand Journal of Agricultural Research.1982,25(4):525-529.)，后该基因被证实为BMPR-IB基因(Souza C J,Macdougall C,Macdougall C,et al.TheBooroola(FecB)phenotype is associated with a mutation in the bonemorphogenetic receptor type 1B(BMPR1B)gene[J].Journal of Endocrinology.2001,169(2):1-6.)。FecB突变对于卵巢的影响主要是通过抑制卵巢分泌孕酮或控制卵巢颗粒细胞的分化成熟，从而间接地影响动物的繁殖力(Yi S E,La Polt P S,Yoon B S,et al.Thetype of I BMP receptor BmprIB is essential for female reproductive function.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences.2001(14):7994.)。在BMPR-IB基因与羊的繁殖性能的相关研究中，绵羊的研究较多，且多集中于研究FecB(A746G)突变对繁殖性能的影响，FecB突变对绵羊的产羔数和***数均有显著影响，但从基因表达水平方面进行的研究相对较少。孙红霞(孙红霞.3个绵羊品种BMPR-IB、BMP15、GDF9和INHA基因多态性及与产羔数的相关性[D].西北农林科技大学,2009.)在滩羊和小尾寒羊中均检测到了FecB突变，经分析发现该突变在滩羊中表现为中度多态，在小尾寒羊中表现为高度多态。

通过以上材料我们可知BMPR-IB基因可能与动物的繁殖调控息息相关，为此我们开展了湖羊BMPR-IB基因部分基因组序列的SNP筛查、检测及与产羔数性状的单位点关联分析和多位点聚合效应分析，以期对湖羊的产羔数性状进行改良，从而有效缩短湖羊的育种时间，快速高繁力湖羊新品系的培育进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术对产羔数性状遗传选育的缺陷和不足，提供一种影响湖羊产羔数性状的多位点聚合分子标记，以及一种提高湖羊产羔数性状的多基因聚合育种方法，该方法的核心技术在于一种与湖羊产羔数性状相关的分子标记，以克服常规育种技术耗时长、育种效率低和单个位点分子标记对于复杂经济性状的选择效果差的不足。本发明的结果可作为分子辅助标记应用于高繁殖力湖羊的育种工作中，这对优质高繁湖羊新品种(系)的培育具有重要意义。

本发明的目的通过下述技术方案得以实现：

一方面，一种影响湖羊产羔数性状的多位点聚合SNPs分子标记，BMPR-IB基因作为湖羊产羔数性状的候选基因，其存在3个SNPs位点，所标记的其中两个SNP位点分别对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR-IB基因(登录号：NC_019463.2)序列的第-87bp和第765bp处，分别命名为T-87C处的T>C突变和G765A处的G>A突变(均以编码区序列的第一位碱基为+1位计算)；另一个A746G突变(也称FecB突变)为前人研究所得，实际对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR-IB基因(登录号：NC_019463.2)编码序列的第914bp处的A>G突变，而在本发明中继续沿用前人的命名方式，即为A746G突变。所述分子标记的SNPs位点如SEQ ID NO.1(T-87C)、SEQ ID NO.2(A746G)和SEQ ID NO.3(G765A)所示，其中序列中的M是T或C；N是A或G；L是G或A，它们的差异导致了湖羊产羔数性状的不同。

另一方面，本发明还提供了用于鉴定上述湖羊的多位点聚合SNPs分子标记的引物对：

其中，检测T-87C的引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

SEQ ID NO.4：

T-87C位点的上游引物PCR-F：5'-TTTTAGGGCTCCATGTACTCC-3'；

SEQ ID NO.5：

T-87C位点的下游引物PCR-R：5'-TTTCCTCTGGGTGCTGTG-3'。

其中，检测A746G的引物对如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

SEQ ID NO.6：

A746G位点的上游引物PCR-F：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

SEQ ID NO.7：

A746G位点的下游引物

PCR-R：5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'。

其中，检测G765A的引物对如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

SEQ ID NO.8：

G765A位点的上游引物PCR-F：5'-GTCTGCTGTATTGGCACACACAT-3'；

SEQ ID NO.9：

G765A位点的下游引物PCR-R：5'-ACCATCTGAATTTGCTTTGCAAT-3'。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQID NO.6和SEQ ID NO.7，以及SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对。

另一方面，本发明还提供上述的多位点聚合SNPs分子标记或引物对或试剂盒在湖羊产羔性状检测或湖羊育种中的应用。

另一方面，本发明提供一种湖羊的遗传育种改良的方法，包含以下步骤：

确定湖羊核心群中种羊的上述SNPs分子标记，并根据湖羊SNPs分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照GeneBank中绵羊的6号染色体上BMPR-IB基因的T-87C/A746G/G765A三位点聚合效应分析模型，优选CCGGGA型个体，以逐代提高湖羊的产羔性能。

体地，所述的方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)提取湖羊的基因组DNA；

(2)采用上述的三对引物对分别对T-87C、A746G和G765A位点进行PCR扩增和基因分型；

(3)根据步骤(2)的基因分型结果，选育T-87C位点为CC型，A746位点为GG，以及G765A位点为GA型的个体(即CCGGGA组合基因型的个体)作为种羊。

作为优选的实施方式，步骤(2)中，基因分型采用限制性内切酶酶切反应(RFLP)技术或测序技术，或者其他现有技术中基因分型的技术。

本发明中，作为优选的实施方式，所述的羊为湖羊。发明人经大量的研究发现，通过进一步研究发现，这3个SNPs的聚合育种分析方法均不适用于雷州黑山羊、努比亚黑山羊、川中黑山羊和重庆黑山羊。在本发明的实施例中，以湖羊为代表。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响湖羊产羔数相关的分子标记，使用这些分子标记对湖羊的产羔数性状进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊的产羔数，加快育种进程。

(2)本发明提供了一种用于鉴定影响湖羊产羔数性状分子标记的引物对，通过这些分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，将其应用于湖羊繁殖性状的遗传改良中，从而提高湖羊的产羔数，挖掘湖羊的繁殖潜力，进而提高企业肉羊养殖的经济效益，增加其核心竞争力。

(3)本发明通过三位点聚合效应分析，优选最佳组合基因型作为分子标记，能够增加湖羊产羔数性状的遗传进展，减少湖羊繁殖性状的育种时间，从而有效提高种羊育种的经济效益，其中，通过该聚合育种方法，本发明将优选CCGGGA组合基因型的个体，则每只羊的平均产羔数较TCAGGA组合基因型可增加0.63只，由此可见，优良的繁殖性能在养羊产业中发挥着巨大的收益潜力。

附图说明

图1是所述SNP分子标记T-87C位点的PCR扩增产物凝胶电泳图。

图2是所述SNP分子标记A746G位点的PCR扩增产物凝胶电泳图。

图3是所述SNP分子标记G765A位点的PCR扩增产物凝胶电泳图。

图4是所述SNP分子标记T-87C位点的Hin6I-RFLP凝胶电泳图。

图5是所述SNP分子标记A746G位点的AvaⅡ-RFLP凝胶电泳图。

图6是所述SNP分子标记G765A位点的MunI-RFLP凝胶电泳图。

图7是湖羊T-87C位点的TC基因型的测序峰图。

图8是湖羊T-87C位点的CC基因型的测序峰图。

图9是湖羊A746G位点的AA基因型的测序峰图。

图10是湖羊A746G位点的AG基因型的测序峰图。

图11是湖羊A746G位点的GG基因型的测序峰图。

图12是湖羊G765A位点的GG基因型的测序峰图。

图13是湖羊G765A位点的GA基因型的测序峰图。

图14是湖羊G765A位点的AA基因型的测序峰图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1生物学技术的应用

实施例中，选取有完整产羔记录的湖羊母羊934只，颈静脉抽血5mL并做抗凝处理，于-20℃保存备用。本研究所使用的湖羊均来自广东省云浮市温氏新旺羊业有限公司的簕竹种羊场，该场全年实行高床舍饲饲养，按统一饲养标准饲喂日粮，自由采食饮水。

(1)湖羊血液基因组DNA的抽提是参照血液基因组DNA提取试剂盒(购自广州锐扬生物科技有限公司)，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用紫外分光光度计对抽提的DNA进行质量检测和浓度测定。将A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9的DNA样判为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50ng/μL，并于-20℃冰箱内进行低温保存。

(2)DNA pool测序：随机抽取100份湖羊个体DNA样品，按等量混合的原则做成两个DNA池，并以此为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。利用DNAstar软件对测序结果进行序列整理并与NCBI上基因组序列进行比对，发现3个SNPs分别在其扩增序列的第179bp处存在T→C突变，第109bp处存在A→G突变和193bp处存在G→A突变，如序列SEQ ID NO.1、IDNO.2和ID NO.3所示。

(3)湖羊PCR-RFLP基因型检测：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术是在PCR技术的基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常PCR产物进行比较来确定是否变异。

(4)引物诱导酶切分析技术(CRS-PCR-RFLP)：CRS-PCR-RFLP方法是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中1条引物根据突变位点临近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的1种突变型在PCR扩增后形成1个酶切位点，然后应用相应的内切酶进行酶切鉴定。该方法可用于内切酶价格昂贵或者无内切酶识别的情况。本研究通过在下游引物中引入错配碱基(如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列中标记下划线的碱基)，分别形成AvaⅡ(C↓CTAGG)和MunI(C↓AATTG)酶切识别位点。

本研究以湖羊血液基因组DNA为模板，PCR扩增BMPR-IB基因3对引物的特异性片段产物，通过在线软件NEBcutter V2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)和PrimerPremier 5.0软件对酶切位点进行分析，确定T-87C位点的特异性片段产物含有Hin6I(G↓CGC)限制性内切酶识别位点，经Hin6I酶切后，以2％的琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(791bp+342bp+449bp或342bp+449bp，如图4)；运用引物诱导酶切分析技术使A746G位点和G765A位点的特异性片段产物分别含有AvaⅡ和MunI酶切识别位点，且经AvaⅡ和MunI分别酶切后，以3％的琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(140bp、140bp+110bp或110bp，如图5)和(216bp、216bp+192bp或216bp+192bp+24bp，如图6)，并以这3个SNPs为遗传标记与产羔数进行相关联分析，从而判断这3个SNPs是否影响湖羊的产羔数性状。

实施例2单点效应分析模型的建立

(1)含有与湖羊产羔数性状显著相关SNPs位点的目的片段的扩增：目的片段均为6号染色体上的部分核苷酸序列，序列扩增的上下游引物是根据GenBank上报道的绵羊BMPR-IB基因序列(登录号为：NC-019463.2)，利用Primer Premier 5.0软件对BMPR-IB基因的3个SNPs位点进行引物设计，扩增湖羊BMPR-IB基因的部分序列。引物由华大生物科技有限公司合成，具体序列如下：

SEQ ID NO.4：

T-87C位点的上游引物PCR-F：5'-TTTTAGGGCTCCATGTACTCC-3'；

SEQ ID NO.5：

T-87C位点的下游引物PCR-R：5'-TTTCCTCTGGGTGCTGTG-3'。

SEQ ID NO.6：

A746G位点的上游引物PCR-F：5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

SEQ ID NO.7：

A746G位点的下游引物

PCR-R：5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'。

SEQ ID NO.8：

G765A位点的上游引物PCR-F：5'-GTCTGCTGTATTGGCACACACAT-3'；

SEQ ID NO.9：

G765A位点的下游引物PCR-R：5'-ACCATCTGAATTTGCTTTGCAAT-3'。

(2)PCR扩增体系和程序设置

PCR反应体系：10μL体系中含基因组DNA模板1μL，上、下游引物各0.2μL，5μLTaqDNA聚合酶，以去离子双蒸水补充至终体积。

PCR反应程序：94℃预变性2min，35个循环[94℃变性30s，X℃(因不同引物而异，T-87C位点和A746G位点处引物的退火温度均为62℃，而G765A位点处引物的退火温度为57℃。)退火30s，72℃延伸30s]，72℃后延伸5min，4℃保存。

(3)PCR-RFLP基因分型

PCR反应结束后即进行不同SNPs位点扩增产物的酶切。酶切体系：15μL体系中含10×buffer 1μL，双蒸水8.5μL，限制性内切酶(10U/μL)0.5μL，PCR反应产物5μL，震荡混匀，37℃水浴30min。酶切产物使用3％的琼脂糖凝胶电泳分型。

(4)不同基因型测序结果判定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段进行正反两个方向的测序。将3个SNPs位点的不同基因型的PCR产物送测，测序峰图的结果如图7～14所示。

测序结果如下所示：

SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2：

SEQ ID NO.3：

注：序列表中标注的M、N和L处为突变位点(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在3个序列的首尾加粗显示的为引物序列，在下游引物序列中用下划线标记的碱基是通过引物诱导酶切分析技术引入的错配碱基。

(5)统计分析：数据采用SPSS 20.0统计分析软件中的GLM(General LinearModel)程序配合构建的单位点效应模型对所述分子标记位点进行统计分析，采用LSD和Dunnett’sT3法进行均数间的多重比较，研究胎次和基因型对多胎性状(产羔数)的影响，统计分析所用的线性模型如下：

Y_ijk＝μ+G_i+B_j+P_k+ε_ijk

其中：Y_ijk是性状的观察值；μ为总体平均值；G_i为i标记的基因型效应；B_j为品种效应(在合并群体中需考虑此效应影响)；P_k为第k个胎次的固定效应；ε_ijk为随机残差效应。所有数据结果均以平均值±标准差(Mean±SD)的形式呈现。

(6)SNPs不同基因型与产羔数表型的关联性分析：根据表1可知，对BMPR-IB基因的3个SNPs位点与湖羊产羔数性状进行关联分析，发现T-87C位点在胎次1、胎次2、胎次3和平均产羔数方面，突变纯合型CC的产羔数均高于突变杂合型TC，其中在胎次1和平均产羔数方面达到了显著水平(P<0.05)；A746G位点在胎次1、胎次2、胎次3和平均产羔数方面，突变纯合型GG的产羔数均显著高于突变杂合型AG(P<0.05)；G765A位点在胎次1和平均产羔数方面，突变纯合型AA的产羔数均显著高于野生纯合型GG。说明这3个SNPs位点显著影响湖羊的产羔数性状，因而可通过对湖羊的此3个SNPs位点进行辅助选择，从而提高该群体的产羔数，进而加快育种进程。另外根据表1可知，对于T-87C位点，CC型的平均产羔数比TC型多0.17只，且差异均显著(P<0.05)，说明CC型是优势等位基因型；对于A746G位点，GG型的平均产羔数比AG型多0.19只，且差异显著(P<0.05)，说明GG型是优势等位基因型；对于G765A位点，AA型的平均产羔数比GG型多0.11只，且差异显著(P<0.05)，说明AA型是优势等位基因型；而这些优势等位基因型对提高湖羊的产羔数均是有利的。在肉羊产业中，产羔数是繁殖性状的重要指标，产羔数越高说明种羊的繁殖成本越低，经济效益越显著。因此，我们在进行育种的过程中可以优选这些优势等位基因型的种母羊，以逐代提高这些位点的优势等位基因的频率。

表1 BMPR-IB基因的SNPs的不同基因型与湖羊产羔数的关联分析

注：同列中标有不同字母的数据间差异显著(P<0.05)，无肩标或肩标字母相同的数据间差异不显著(P>0.05)。

实施例3三位点聚合效应分析模型的建立

首先运用实施例1和2中所述方法分别检测出BMPR-IB基因的T-87C、A746G和G765A多态位点，并与湖羊的产羔数进行单位点效应分析，上述结果显示BMPR-IB基因的这3个多态位点均对湖羊的产羔数具有显著影响。为研究上述3个位点之间的互作以及在育种工作中进一步提高对湖羊产羔数性状的选育效率，本发明建立了湖羊产羔数性状的多位点聚合效应分析模型。

(1)三位点聚合效应分析模型

试验共检测了934只湖羊，通过PCR-RFLP方法确定了T-87C/A746G/G765A组合基因型，并进行了组合基因型与产羔数的关联分析。建立如下模型：

Y_ijk＝μ+C_i+B_j+P_k+ε_ijk

其中，Y_ijk是性状的观察值；μ为总体平均值；C_i为第i个个体的组合基因型效应；B_j为品种效应(在合并群体中需考虑此效应影响)；P_k为第k个胎次的固定效应；ε_ijk为随机残差效应。

(2)三位点聚合效应分析在湖羊产羔数性状关联分析中的应用

由表2可知，T-87C/A746G/G765A组合模型对湖羊的产羔数有显著影响(P<0.05)，其中CCGGGA组合基因型的平均产羔数最高，为2.12±0.06只，且高于任一SNP位点的单位点效应，因而该组合基因型可视为最佳组合基因型。在育种工作中采用T-87C/A746G/G765A三位点聚合效应分析模型，对CCGGGA组合基因型的个体进行优选，则选择效果均高于其他组合基因型和单位点效应，这一研究结果将有助于进一步提高湖羊的产羔数性状和加快湖羊的育种进程。

需要强调的是，聚合效应分析后的结果确实是CCGGGA为最佳组合基因型，然而，单个位点平均产羔数最高的基因型却分别是CC、GG和AA(见实施例2)，在3个位点聚合后CCGGAA组合基因型并不是最优的组合，说明这3个位点间存在互作效应。而在实际生产中，当3个位点间存在互作效应时，若仅用单个位点的分子标记进行选育，可能会导致顾此失彼的后果，而不能收到良好的育种效果。所以本研究采用聚合效应分析模型对湖羊的产羔数进行遗传研究，不仅能够丰富动物数量性状的研究方法，而且可以为分子标记的挖掘和分子标记辅助选择奠定理论基础。

表2 三位点聚合效应对湖羊产羔数的影响

注：同列中标有不同字母的数据间差异显著(P<0.05)，无肩标或肩标字母相同的数据间差异不显著(P>0.05)；个体数小于10的组合基因型未在表中列出。

实施例4分子标记的效应分析

本发明提供一个能显著增加湖羊产羔数的分子辅助育种方法，使用多位点聚合效应分析的育种方法对湖羊进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊产羔数性状的育种进程。

本发明中影响湖羊产羔数的分子标记全部选育成CCGGGA组合基因型个体，则每只种母羊的平均产羔数较TCAGGA组合基因型最多可以增加0.63只，由此可见对繁殖性能高的种母羊进行选育，对降低繁殖成本，提高养羊业经济效益及促进我国肉羊产业的快速发展均具有重要的意义。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种提高湖羊产羔数的多位点聚合效应分析的育种方法

<141> 2018-06-27

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> DNA

<213> Ovisaries L.

<400> 1

tgtgccctca ccctctgtct cctctctctt ccagagactc ggacctgttt ctgctgggca 60

cgcgtgctgt gtgggcctca gaggcgggct ggctggagtt tgacatcacg gccaccagca 120

acctgtgggt cctgactccg cagcacaaca tggggctgca gctgagcgtg gttacgcgmg 180

acggtgagtt cagggactcg ggcctttgcc tccttggcgg caggtgtggg cagccgtggt 240

ccccaggcgg gccccccgtt tcccgacctc ctggagcctt ggtggacaag cagagtcctg 300

ccccagggcc tcctggcaag gactcaggga cggttagatg gtccgggagc ctcagagagg 360

ggtaggagct gggtgctgag ttaaagagga aggccggg 398

<210> 2

<211> 140

<212> DNA

<213> Ovisaries L.

<400> 2

gtcgctatgg ggaagtttgg atgggaaagt ggcgtggcga aaaggtagct gtgaaagtgt 60

tcttcactac agaggaggcc agctggttcc gagagacaga aatatatcng acggtgttga 120

tgaggcatga aaacatcttg 140

<210> 3

<211> 215

<212> DNA/RNA

<213> Ovisaries L.

<400> 3

gtctgctgta ttggcacaca cattctttac cactagcgcc acctcggaaa cccatataaa 60

gaaaaactac tggctaaata tattttacat gcagttgttt tcttctctga aggaaaaaag 120

aaaacattaa acaatctgta gtgccgtgaa cgcactaaca gtgtgttggg ggatttaaca 180

ggtccagagg acatagcaaa gcaaattcag atggt 215

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttttagggct ccatgtactc c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttcctctgg gtgctgtg 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtcgctatgg ggaagtttgg atg 23

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

caagatgttt tcatgcctca tcaacacggt c 31

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtctgctgta ttggcacaca cat 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

accatctgaa tttgctttgc aat 23

Claims

1.一种多位点聚合SNPs分子标记在湖羊产羔性状检测或湖羊产羔性状育种中的应用，其特征在于，所述SNPs分子标记为位于BMPR-IB基因上三个多态性位点，所述的SNPs分子标记的核苷酸序列分别如下所示：

T-87C为SEQ ID NO：1所示序列的第179位的M为T或C的突变；

A746G为SEQ ID NO：2所示序列的第109位的N为A或G的突变；

G765A为SEQ ID NO：3所示序列的第193位的L为G或A的突变。

2.一种湖羊的遗传改良方法，其特征在于，确定湖羊种羊的如权利要求1中所述的多位点聚合SNPs分子标记，并对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的3个分子标记同时进行组合使用，采用T-87C/A746G/G765A三位点聚合效应分析模型，选育CCGGGA型个体，以逐代提高湖羊的产羔性能；

所述选育CCGGGA型个体中的CC由BMPR-IB基因的T-87C位点突变得到；GG由BMPR-IB基因的A746G位点突变得到；GA由BMPR-IB基因的G765A位点突变得到。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)提取湖羊的基因组DNA；

(2)采用引物对分别对T-87C、A746G和G765A位点进行PCR扩增和基因分型；

(3)根据步骤(2)的基因分型结果，选育T-87C位点为CC型，A746G位点为GG，以及G765A位点为GA型的个体，即CCGGGA组合基因型的个体作为种羊；

检测T-87C的引物对核酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

检测A746G的引物对核酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

检测G765A的引物对核酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用包含权利要求3所述的引物对的试剂盒进行检测。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基因分型采用限制性内切酶酶切反应技术，确定T-87C位点的特异性片段产物含有Hin6I酶切识别位点；使得A746G位点的特异性片段产物含有AvaⅡ酶切识别位点，G765A位点的特异性片段产物含有MunI酶切识别位点。