CN108949890A

CN108949890A - 一种微生物增产科罗索酸的方法

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Publication number: CN108949890A
Application number: CN201810892793.0A
Authority: CN
Inventors: 张江南
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2018-12-07

Abstract

本发明提供了一种微生物增产微生物增产科罗索酸的方法，提取过程中采用微生物发酵增产科罗索酸，采用破壁浸提，细胞破碎充分，保证了提取效率，制得的科罗索酸纯度高，最高为98％。

Description

一种微生物增产科罗索酸的方法

技术领域

本发明涉及药物提取领域，特别涉及一种微生物增产科罗索酸的方法

背景技术

金莲花，多年生草本，高30-70cm。全株无毛。茎直立，不分枝，疏生2-4叶。基生叶1-1，长16-36cm，有长柄，柄长12-30cm，基部具狭鞘；叶片五角形，长3.8-6.8cm，宽6.8-12.5cm，3全裂，中央全裂片菱形，先端急尖，3裂达中部或稍超过中部，边缘具不等人的三角形税锯齿；例全裂片斜扇形，2深裂近基部，上方深裂片与中央全裂片相似，下方深裂片较小，斜菱形；茎生叶互生，叶形与基生叶相似，生于茎下部的叶具长柄，上部叶较小，具短柄或无柄。花两性，单朵顶生或2-3朵排列成稀疏的聚伞花序，直径3.8-5.5cm；花梗长5-9cm；苞片3裂；萼片通常10-15，金黄色，干时不变绿色，椭圆状卵形或倒卵形，长1.5-2.8cm，宽7-16mm，先端疏生三角形牙齿，间或为3个小裂片，或为不明显的小牙齿；花瓣(蜜叶)18-21，狭线形，稍长于萼片或萼乌片等长，长1.8-2.2cm，宽1.2-1.5mm，无端渐狭，近基部有蜜槽；雄蕊多数，长5-11mm，螺旋状排列，花丝线形，花药在侧面开裂，长3-4mm；心皮20-30。蓇葖果，长1-1.2cm，宽约3mm，具脉网，喙长约1mm。花期6-7月，果期8-9月。金莲花中含科罗索酸，藜芦酸(veratricacid)，荭草甙(orientin)，牡荆甙(vitexin)，黎芦酰胺(veratramide)，棕榈酸(palmiticacid)。科罗索酸(corosolicacid)，2α-羟基熊果酸(2-alpha-hydroxyursolicacid)，

科罗索酸降血糖作用的研究源于对菲律宾、马来西亚等东南亚国家传统降血糖保健饮料原料大叶紫薇叶的研究。1940年，Garcia采用以1～2g大叶紫薇干叶/kg体重的剂量喂养普通家兔，发现每24h家兔的血糖水平平均下降16～49mg/L。1956年，Garcia又采用大叶紫薇叶提取物进行临床实验，发现其具有降低糖尿病病人血糖的效果。1993年，Murakami等从大叶紫薇的叶中分离出2种三萜酸科罗索酸和山楂酸，发现科罗索酸具有降血糖的效果。目前，对科罗索酸降血糖的作用，已从体外细胞实验、体内动物实验和临床实验等方面进行了***的研究。在体外实验中，1993年，Murakami等以肿瘤细胞进行体外培养，发现大叶紫薇提取物可刺激细胞膜的葡萄糖运输通道，增强细胞对葡萄糖的利用，进而降低血糖含量，此作用与胰岛素降糖作用机理相似。体内动物实验中，1999年，Hamamoto等制备了一种含1％(w/w)科罗索酸的大叶紫薇提取物胶囊，将其喂养小鼠，喂养后90min，小鼠的血糖水平比对照组明显下降。此外，在兔子体内也进行了科罗索酸降糖作用实验。对禁食24h正常的兔子喂食科罗索酸，考察喂食一段时间后血糖含量，结果表明，大剂量服用科罗索酸引起的血糖降低与服用两个单位的胰岛素相似。大剂量服用科罗索酸可以带来57mg/ml的血糖降低。正常兔子口服科罗索酸会带来16～49mg/ml的血糖降低。2个多小时后再次给药会使血糖保持在低水平上，甚至略微有所下降，此过程会保持5个多小时。大剂量服用克罗索酸会带来40～58mg/ml的血糖降低。血糖降低的峰值期出现在服药后2～4h，6～10h后血糖恢复到正常水平。血糖下降明显和科罗索酸摄入量有关。临床实验中，1999年Ikeda等采用含大叶紫薇提取物的胶囊对糖尿病病人进行临床实验，发现其具有治疗糖尿病的作用。William等将含1％(w/w)科罗索酸的大叶紫薇甲醇提取物制备为软胶囊和硬胶囊，对56名II型糖尿病人进行了临床观察，结果表明，每人每天供给剂量32mg和48mg的两组，两周后，他们的血糖水平有明显下降，服用软胶囊组的病人，其血糖水平平均下降30％，服用硬胶囊组的病人，其血糖水平平均下降20％，表明两种胶囊都具有降血糖的效果，且软胶囊的降糖效果优于硬胶囊。将大鼠随机分成正常对照组、模型对照组、大叶紫薇总三萜高剂量组和低剂量组,正常对照组与模型对照组喂服生理盐水,高、低剂量组分别按大鼠体重的0.025％和0.01％喂服大叶紫薇总三萜喂服28d后,测葡萄糖耐量、血糖、尿糖、血脂、体重和糖化血红蛋白以考察大叶紫薇总三萜对糖尿病大鼠的降血糖作用.结果表明:大叶紫薇总三萜能非常显著地改善糖尿病大鼠的葡萄糖耐量,降低糖尿病大鼠的血糖,尿糖,血清TC,TG,LDL-C和糖化血红蛋白,升高HDL-C.因此,大叶紫薇总三萜对糖尿病大鼠有降糖效果。

中国专利CN102731606A公开了一种利用微波萃取-大孔树脂联用技术纯化金莲花中科罗索酸的方法，但提取效率较低，产品纯度仅能达到95％，无法满足工业要求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供提取本发明的目的在于克服常规技术提取率相对较低、提取纯度低等缺点，一种微生物增产微生物增产科罗索酸的方法，工艺简单，成本低，提取效率高，制得的科罗索酸纯度高，便于工业化生产。

为实现上述发明目的，技术方案为：

一种微生物增产科罗索酸的方法，包括如下步骤：

S1、将金莲花粉碎后用在75％酒精中浸泡灭菌，加入培养基，接种微生物，发酵培养0.3～0.5天，调节pH值至3.5～4.5，以保持科罗索酸的稳定性，然后破壁浸提，之后离心取上清液；

S2、分离后的滤渣经浓度为30％的乙醇水溶液进行充分溶解，得到混合液，过滤，得到过滤液，合并上清液和过滤液获得提取液；

S3、将提取液经大孔树脂吸附至饱和，用水冲至PH值在7.0以上，然后用浓度为10％～50％的乙醇进行解析，乙醇用量为树脂体积的3倍，收集解析液，解析液压力-0.070～0.095Mpa，50～60℃条件下，经减压回收乙醇，得到科罗索酸浓缩液，其比重在1.1～121之间；

S4、科罗索酸浓缩液在70～85℃之间进行真空干燥，得含量为40％的科罗索酸粗品，将科罗索酸在醇溶液中进行重结晶，得到科罗索酸成品，其纯度在96％以上。

步骤S1中所述的微生物为产科罗索酸菌株，其筛选方法如下：

采用组织块法，取金莲花样品在75％酒精中灭菌60～90s数次，用无菌水冲洗多次，再在5％次氯酸钠溶液中表面消毒30s，消毒后将其接种到改良的牛肉膏蛋白胨固体培养基培养基的平板上，再分别将其置于37℃恒温培养箱中培养12h和28℃恒温培养箱中培养5d，检测培养基中科罗索酸的浓度，选择浓缩最大的菌株作为产生科罗索酸的菌株；其中所述的改良牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH值调为7.4。

进一步地，步骤S1中所述破壁浸提是在输出功率为600W的微波条件下处理1～3分钟，用乙醇在温度为70～90℃条件下提取两次，第一次90分钟，第二次30分钟，合并两次提取液。

进一步地，所述步骤S3是将上清液加入树脂吸附柱中，用5～10倍柱体积的水冲洗至PH值在7.0以上，再用5～10倍柱体积的体积分数为10％～50％的乙醇溶液洗柱，收集洗脱液，洗脱液用无水乙醇溶解，将上清液过活性炭柱，收集液体。

进一步地，步骤S4中，采用的大孔树脂为AB-8大孔吸附树脂，用水冲至PH值在6.0～7.0之间，然后用浓度为80％～90％的乙醇进行解析，乙醇用量为树脂体积的3倍，收集解析液。

本发明的有益效果：本发明提供了一种微生物增产微生物增产科罗索酸的方法，提取过程中采用微生物发酵增产科罗索酸，采用破壁浸提，细胞破碎充分，保证了提取效率，制得的科罗索酸纯度高，最高为98％。

具体实施方式

本发明采用微波萃取，微波具有提取温度低、效率高、提取时间短等优点，可以大大提高科罗索酸的提取率和缩短提取时间，利用大孔树脂吸附科罗索酸，对科罗索酸的吸附效果好，采用乙醇水溶液提取科罗索酸，溶解效果好，减少科罗索酸的消耗，提高产率。

【实施例1】

产科罗索酸菌株筛选方法：

采用组织块法，取金莲花样品在75％酒精中灭菌90s数次，用无菌水冲洗多次，再在5％次氯酸钠溶液中表面消毒30s，消毒后将其接种到改良的牛肉膏蛋白胨固体培养基培养基的平板上，再分别将其置于37℃恒温培养箱中培养12h和28℃恒温培养箱中培养5d，检测培养基中科罗索酸的浓度，选择浓缩最大的菌株作为产生科罗索酸的菌株；其中所述的改良牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH值调为7.4。

【实施例2】

S1、将3kg金莲花粉碎后用在75％酒精中浸泡灭菌，加入马铃薯琼脂培养基，接种实施例1所获得的菌株，发酵培养5天，调节pH值至4.5，以保持科罗索酸的稳定性，然后破壁浸提，之后离心取上清液；所述破壁浸提是在输出功率为600W的微波条件下处理3分钟，用乙醇在温度为90℃条件下提取两次，第一次90分钟，第二次30分钟，合并两次提取液；

S3、将提取液经大孔树脂吸附至饱和，采用的大孔树脂为AB-8大孔吸附树脂，用10倍柱体积的水冲洗至PH值在7.0以上，再用10倍柱体积的体积分数为50％的乙醇溶液洗柱，收集洗脱液，洗脱液用无水乙醇溶解，将上清液过活性炭柱，收集液体，解析液压力0.095Mpa，60℃条件下，经减压回收乙醇，得到科罗索酸浓缩液，其比重在1.1～1.21之间；

S4、科罗索酸浓缩液在85℃之间进行真空干燥，得含量为60％的科罗索酸粗品，将科罗索酸在醇溶液中进行重结晶，得到科罗索酸成品142g，其纯度在96％以上。

【实施例3】

S4、科罗索酸浓缩液在70～85℃之间进行真空干燥，得含量为40％的科罗索酸粗品，将科罗索酸在醇溶液中进行重结晶，得到科罗索酸成品138g，其纯度在98％以上。

【对比例1】

S1、将3kg金莲花粉碎后破壁浸提，之后离心取上清液；所述破壁浸提是在输出功率为600W的微波条件下处理1分钟，用乙醇在温度为90℃条件下提取两次，第一次90分钟，第二次30分钟，合并两次提取液；

S2、将提取液经大孔树脂吸附至饱和，采用的大孔树脂为AB-8大孔吸附树脂，用10倍柱体积的水冲洗至PH值在7.0以上，再用10倍柱体积的体积分数为50％的乙醇溶液洗柱，收集洗脱液，洗脱液用无水乙醇溶解，将上清液过活性炭柱，收集液体，解析液压力0.095Mpa，60℃条件下，经减压回收乙醇，得到科罗索酸浓缩液，其比重在1.1～1.21之间；

S3、科罗索酸浓缩液在70～85℃之间进行真空干燥，得含量为40％的科罗索酸粗品，将科罗索酸在醇溶液中进行重结晶，得到科罗索酸成品66g，经检测纯度为92％。

上述说明已经充分揭露了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。

Claims

1.一种微生物增产科罗索酸的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的微生物增产科罗索酸的方法，其特征在于：步骤S1中所述的微生物为产科罗索酸菌株，其筛选方法如下：

3.根据权利要求1所述的微生物增产科罗索酸的方法，其特征在于：步骤S1中所述破壁浸提是在输出功率为600W的微波条件下处理1～3分钟，用乙醇在温度为70～90℃条件下提取两次，第一次90分钟，第二次30分钟，合并两次提取液。

4.根据权利要求1所述的微生物增产科罗索酸的方法，其特征在于：步骤S3是将上清液加入树脂吸附柱中，用5～10倍柱体积的水冲洗至PH值在7.0以上，再用5～10倍柱体积的体积分数为10％～50％的乙醇溶液洗柱，收集洗脱液，洗脱液用无水乙醇溶解，将上清液过活性炭柱，收集液体。

5.根据权利要求4所述的微生物增产科罗索酸的方法，其特征在于：步骤S4中，采用的大孔树脂为AB-8大孔吸附树脂，用水冲至PH值在6.0～7.0之间，然后用浓度为80％～90％的乙醇进行解析，乙醇用量为树脂体积的3倍，收集解析液。