CN108948168B

CN108948168B - 玉米籽粒大小基因ZmSWEET1b及应用

Info

Publication number: CN108948168B
Application number: CN201810910198.5A
Authority: CN
Inventors: 郎志宏; 汪海; 李圣彦; 滕守振; 张昊; 辛红佳
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2038-08-10
Also published as: CN108948168A

Abstract

本发明涉及玉米籽粒大小基因ZmSWEET1b及应用，属于玉米遗传育种。糖转运蛋白ZmSWEET1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。实验结果表明，玉米ZmSWEET1b基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEET1b基因可以提高玉米产量，进行高产稳产育种。

Description

玉米籽粒大小基因ZmSWEET1b及应用

技术领域

本发明属于玉米遗传育种领域，具体涉及一个影响玉米叶片衰老和籽粒大小的基因 ZmSWEET1b及应用

背景技术

植物在生长发育过程中，如果一个器官产生的光合作用产物大于它消耗的光合作用产物，这样的器官被称为“源”；反之，如果一个器官消耗或储存的光合作用产物大于其产生的光合作用产物，这样的器官称为“库”；光合作用产物从“源”向“库”的运输称为“流”(Herbers K and Sonnewald U.Curr Opin Plant Biol,1998,1(3):207-216；Borchers-Zampini C,et al.Plant Physiol,1980,65(6):1116-1120)。玉米灌浆期的源和库分别为叶片和雌穗，在这一时期，雌穗 (“库”)的生长依赖于叶片(“源”)源源不断地向它提供光合作用产物。因此，灌浆期“源库关系”是影响玉米产量的关键因素(Borrás L,et al.FieldCrop Res,2004,86(2–3):131-146)。玉米灌浆期的“源库关系”，不仅涉及碳水化合物从“源”到“库”的转运，还涉及到“源”器官(叶片)的衰老。灌浆期光合作用器官(主要是叶片)如果衰老速率过快，会导致光合作用效率迅速降低、光合作用产物积累不足、产量降低(Yang L,et al.PLoS One,2016,11 (9):e0162201)。如果玉米在灌浆结束后仍然保持滞绿的表型，会导致营养元素大量滞留在叶片，而没有通过营养物质的再动员(remobilization)转运到籽粒中(Donnison IS,et al.New Phytol, 2007,173(3):481-494)。因此，合理调节灌浆和衰老二者的速率，对于实现玉米产量最大化具有重要意义。

细胞的大小和数量决定了籽粒的大小和重量，在发育的种子中，高效的糖运输机制对籽粒的大小和重量起着决定性的作用(Wang E,et al.Nature Genet,2008,40(11):1370-1374)。种子碳水化合物的多少直接决定种子的大小，并且这种籽粒产量的增加可以通过驯化来达到。玉米中已发现的糖转运蛋白是ZmSWEET4c，ZmSWEET4c在玉米授粉后10-17天的表达量升高，同时伴随着大量的糖运输进发育的种子中。ZmSWEET4c运输糖至基底胚乳转移层 (Basal Endosperm Transfer Layer,BETL)后可引起BETL的膜面积增加，进而增强ZmSWEET4c 的转运，其最终的结果就是糖运输进胚乳的能力增强，籽粒糖积累增加(SossoD,et al.Nature Genet,2015,47(12):1489-1493)。ZmSWEET4c的突变体籽粒明显小于正常植株的籽粒，该基因的缺失导致了BETL中己糖转运功能的丧失，进一步的影响了糖从韧皮部的转运。另一类糖转运蛋白是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter，SUT)，在SUT的作用下，韧皮部外质体的蔗糖进入筛管/伴胞复合体并被富集。然后，蔗糖在韧皮部中经过长途运输，最终到达“库”器官(Eom JS,et al.Curr Opin Plant Biol,2015,25:53-62；ChenLQ,et al.Annu rev biochem, 2015,84:865-894)。但是，除了SUT家族的蔗糖转运蛋白SUT1和SUT2(Slewinski TL,et al. J Exp Bot,2009,60(3):881-892；Leach KA,et al.JIntegr Plant Biol,2017,59(6):390-408)，以及 SWEET家族的ZmSWEET4c，目前还没有玉米的其他糖转运蛋白参与玉米光合产物的源库转运和籽粒大小形成的报道。

发明内容

本发明提供一种糖转运蛋白ZmSWEET1b，其参与玉米光合产物的源库转运和籽粒大小，影响玉米叶片衰老和籽粒大小，对玉米的高产育种有重要的指导意义。

糖转运蛋白ZmSWEET1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。

编码糖转运蛋白ZmSWEET1b的基因。

所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。

上述基因在玉米育种中的应用。

本发明采用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变玉米郑58自交系，获得了一个突变体earlysenescence1(简称es1)(保藏编号：CGMCC 15471)，es1突变体的籽粒小于野生型的籽粒。通过基因分析，表明GRMZM2G153358的第四个外显子发生了一个G到A的变异，导致其蛋白质序列发生了谷氨酰胺突变为赖氨酸。

GRMZM2G153358是玉米糖转运蛋白ZmSWEET1b基因，位于玉米第6号染色体长臂。其基因组序列(Genomic DNA)如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，翻译的蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。通过蛋白结构分析，ZmSWEET1b蛋白有7个跨膜区，在es1突变体中是ZmSWEET1b基因的第3个跨膜区的谷氨酰胺E⁸¹突变为赖氨酸K⁸¹(图4)。通过ZmSWEET1b基因验证，结果说明ZmSWEET1b基因上G到A的突变确实造成了es1表型，用CRISPR/Cas9***在玉米C01自交系背景下敲除了ZmSWEET1b基因，在T1代转基因玉米中获得了4个纯合变异类型(es1-c1,es1-c2,es1-c3，es1-c4)，所有的纯合突变体都表现出早衰和百粒重降低的表型，因此说玉米ZmSWEET1b基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEET1b基因可以提高玉米产量，进行高产稳产育种。

ZmSWEET1b基因位于玉米叶片的副卫细胞膜上，可以调节气孔的开度，提高光合效率，在育种上可以利用基因工程手段提高ZmSWEET1b基因的表达量或者在玉米自交系中寻找 ZmSWEET1b基因表达量较高的单倍型材料，与玉米骨干自交系杂交转育，提高玉米产量。所以通过选育ZmSWEET1b基因表达水平高的玉米来培育高产玉米进行育种应用。

玉米(Zea mays)es1突变体，其保藏编号：CGMCC 15471。

保藏日期：2018年7月19日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

附图说明

图1玉米es1突变体表型图：灌浆期叶片早衰、光合作用效率下降和百粒重降低

其中a为野生型和es1突变体玉米在吐丝前5天和吐丝后15天叶片比较图、b为不同叶片标记说明、c为野生型和es1突变体玉米在吐丝前6天到吐丝后30天叶绿素含量变化图、d为野生型和es1突变体玉米在吐丝后0天、10天、20天和30天光合速率比较图、e为野生型和es1突变体玉米在授粉后0天至60天百粒重比较、f为野生型和es1突变体玉米在授粉后0天至60天百粒重干重比较、g为野生型和es1突变体玉米在授粉后0天至60天含水量比较图，WT为野生型，es1为本发明筛选的突变体

图2玉米郑58和es1突变体的果穗和籽粒图对比图

图3玉米ES1基因的图位克隆结果和es1突变体突变位点

图4玉米ZmSWEET1b蛋白跨膜结构图和突变位置

图5玉米ZmSWEET1b基因敲除突变体表型分析

图6玉米ZmSWEET1b蛋白亚细胞定位图

a转化玉米原生质体；b转化烟草叶片

图7玉米ZmSWEET1b蛋白定位在玉米叶片副卫细胞膜

图8 BiFC实验证明玉米ZmSWEET1b蛋白形成寡聚体

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1玉米早衰和产量降低突变体的发现

采用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变玉米郑58自交系构建了库容8000株的突变体库，在突变体库中获得了一个突变体early senescence1(简称es1)(CGMCC 15471)。在灌浆期之前， es1突变体不表现出任何可见的表型。但是，从吐丝前5天(5DBS，days beforesilking)开始， es1叶片开始出现衰老的表型，表现为下部叶片开始失绿。到吐丝后第15天(15DAS,days after silking)，es1的大部分叶片都表现出失绿的表型(图1a)。进一步在灌浆期使用SPAD502 叶绿素含量测定仪(柯尼卡美能达公司)对叶片的叶绿素含量进行连续观测，发现es1的叶绿素含量降低不仅比野生型发生得早，其发展的速度也比野生型快(图1c)。不仅如此，es1叶片的光合效率也比野生型叶片低(图1d)。

灌浆期源器官的光合作用效率是产量的重要决定因素，因此我们进一步研究es1突变是否影响产量。从授粉前5天到授粉后60天，每隔5天对es1突变体和野生型的百粒重(包括湿重和干重)进行测量。发现从授粉后25天开始，es1的百粒重显著低于野生型，在授粉后 60天时，es1的百粒重(包括湿重和干重)比野生型低7％(图1e和图1f)。比较野生型和es1 突变体籽粒的脱水速率没有差别(图1g)。收获的野生型和es1突变体的果穗和籽粒见图2，可见果穗的生长受到影响，es1突变体的果穗小于野生型果穗，es1突变体的籽粒长度和宽度都小于野生型的籽粒。

实施例2玉米ES1基因的确定

为了克隆ES1基因，我们构建了es1X B73F₂遗传作图群体，对F2代作图群体中野生型和早衰突变体的个数进行统计，在727个F₂个体中，169个个体表现出es1表型，558个个体表现出野生型表型，卡方检验结果说明该F2代遗传作图群体并未偏离3：1的孟德尔遗传分离比(χ²＝1.19<χ² _0.05＝3.84)(表1)。因此，控制该早衰性状的为单隐性突变。

表1卡方检验结果

对es1基因进行图位克隆，第一步采用BSA(Bulked Segregant Analysis)寻找与es1连锁的分子标记，以期确定es1在玉米基因组中的大概位置。按照表型不同，将早衰玉米突变体的基因组DNA混成一个“池”，将正常表型玉米的基因组DNA混成一个“池”，采用分布在玉米10条染色体的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯凝胶电泳检测，部分引物序列在表2中列出，PCR扩增体系为2×Taq MasterMix 10μL，Primer F/R(10μmol L^-1)各1μL，基因组DNA1μL，ddH₂O补足至20μL；反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s， 54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。通过BSA分析，获得与es1紧密连锁的8个分子标记，分别为SSR114，SSR012，SSR112，SSR162，SSR113，SSR105，SSR132，SSR115。用上述8对SSR引物，在F2代遗传作图群体中对每一棵植株进行PCR 扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，拍照，读带，统计。其中，F2代遗传作图群体中带型与亲本郑 58一致的记为Z，与亲本B73一致的记为B，杂合基因型记为H。将统计出的条带输入到 Excel软件并计算交换律，通过最大似然函数将重组率转化为遗传图距，结果表明，候选基因位于SSR分子标记bnlg1702和umc1462之间(图3a)。

表2 SSR引物序列

第二步根据SSR标记定位的结果，比对郑58玉米与B73玉米特定区域的基因组序列，挖掘SNP(Single Nucleotide Polymorphism)，设计HRM引物(见表3)，对SSR标记确定的特定区域的重组株，进行HRM-PCR扩增。HRM-PCR反应体系如下：10×Taq Buffer 2μL，Primer F/R(10μmol.L^-1)各1μL，2mM dNTP Mixture 2.5μL，基因组DNA(100ng.μL^-1) 1μL，rTaq酶1μL，高分辨的饱和LC Green荧光染料试剂2μL，ddH2O补足至20μ L，进行PCR之前，采用石蜡油进行液封。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s， 54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。HRM-PCR反应完成后，将扩增产物放进LightScanner96高分辨溶解曲线分析***，根据熔解曲线，进一步缩小与目标基因连锁的区域。该区域包含了5个有功能的基因，分别为GRMZM2G153333， GRMZM2G153358，GRMZM2G456568，GRMZM2G701177和GRMZM2G058472(图3a)。将5个基因利用Sanger测序，结果表明这5个基因中只有GRMZM2G153358的第四个外显子发生了一个G到A的变异，导致其蛋白质序列发生了谷氨酰胺突变为赖氨酸(E81K)(图 3b)。

表3 HRM-PCR引物

实施例3玉米ZmSWEET1b基因分析

在玉米MaizeGDB网站B73 RefGen_V3(https://www.maizegdb.org)检索GRMZM2G153358基因信息。GRMZM2G153358是玉米糖转运蛋白ZmSWEET1b基因，位于玉米第6号染色体长臂。其基因组序列(Genomic DNA)如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，翻译的蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。ZmSWEET1b基因有6个外显子、5个内含子，编码250个氨基酸。利用蛋白结构分析软件PROTTER (http://wlab.ethz.ch/protter/start/)对ZmSWEET1b蛋白进行了结构预测，分析结果显示 ZmSWEET1b蛋白有7个跨膜区，N端位于细胞膜的外部，C端位于细胞膜内部，在es1突变体中是ZmSWEET1b基因的第3个跨膜区的谷氨酰胺E⁸¹突变为赖氨酸K⁸¹(图4)。

实施例4玉米ZmSWEET1b基因验证

为了验证是否由于ZmSWEET1b基因单位点突变导致了es1突变体的表型，构建了两个 CRISPR/Cas9敲除ZmSWEET1b基因的植物表达载体，靶位点分别位于ZmSWEET1b的第三外显子和第四个外显子(载体保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，将两个植物表达载体通过农杆菌转化方法转化玉米自交系C01，获得T0代转基因玉米种子，将T0代玉米种子种植后，先用PCR方法确定转基因阳性植株，检测引物是barF(5'-GCACCATCGTCAACCACTAC-3')和barR(5'-AGAAACCCACGTCATGCCAG-3')， PCR扩增体系为2×Taq MasterMix 10μL，Primer barF/barR(10μmol L^-1)各1μL，基因组DNA 1μL，ddH2O补足至20μL；反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。确定阳性植株后用靶位点两侧序列设计引物E3F(5'-AAACTGATCATCTGTCGGG-3')和E3R(5'- TTAGCTTGCTACTAGCTAGC-3')，扩增靶位点序列，发现在ZmSWEET1b基因的第三个外显子靶位点处有13个碱基的缺失，导致ZmSWEET1b蛋白无法正常表达，同样方法发现在第四个外显子处有三个位点的纯合突变，分别缺失1bp、1bp和5bp，导致ZmSWEET1b基因移码突变，无法正常表达ZmSWEET1b蛋白，这4个纯合变异类型称为es1-c1,es1-c2,es1-c3， es1-c4(图5)，四个纯合突变体都表现出叶片早衰、失绿的表型(图5)，同时百粒重降低(图 5)，与es1突变体的表型是一致的，这些结果说明ZmSWEET1b基因上G到A的突变确实造成了es1表型。

实施例5 ZmSWEET1b基因亚细胞定位和组织定位

通过ZmSWEET1b蛋白结构预测，其有7个跨膜区，但是ZmSWEET1b基因在玉米中的亚细胞定位和组织定位如何？首先利用两个瞬时表达体系(玉米原生质体转化和烟草叶片注射转化)分析ZmSWEET1b蛋白的亚细胞定位，构建了三个转化载体，载体骨架来源于pCAMBIA3300(商业载体，可以从生物公司购买)，对照载体为CaMV35S：eYFP，是花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子与增强型黄色荧光蛋白相连再连接到pCAMBIA3300骨架中获得，CaMV35S：ZmSWEET1b-eYFP从郑58玉米中克隆ZmSWEET1b基因的CDS序列与eYFP 融合表达再连接到pCAMBIA3300载体骨架中获得，CaMV35S：ZmSWEET1B^E81K-eYFP载体是从es1突变体中克隆的ZmSWEET1b突变基因的CDS序列与eYFP融合表达再连接到 pCAMBIA3300载体骨架中获得(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，首先将三个载体分别转化玉米原生质体，转化方法见李圣彦博士论文中所述(李圣彦.玉米萜类合成酶基因TPS10表达调控的研究[博士学位论文].北京:中国农业大学,2015)，转化完成后，避光过夜培养，培养后将原生质体转移到2mL灭菌处理的EP 管中。制片时，加入FM4-64作为膜Marker，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察原生质体中荧光。在转化的玉米原生质体中可见ZmSWEET1b蛋白位于细胞质膜上，与FM4-64染色的细胞质膜正好重合，单位点突变的ZmSWEET1b^E81K蛋白也可以定位在细胞质膜上，与 ZmSWEET1b蛋白定位一致，说明E81K的突变没有影响基因定位，该结果与预测相同是一个结合在细胞质膜上的蛋白(图6a)。为了验证上述结论，我们又进行了烟草瞬时表达实验，先将CaMV35S：eYFP、CaMV35S：ZmSWEET1b-eYFP和CaMV35S：ZmSWEET1b^E81K-eYFP 三个载体分别转化农杆菌，挑取阳性克隆，继续扩大培养，离心后用重悬浮缓冲液悬浮菌体，室温下培养2-3h后，使用10mL的注射器注射烟草幼嫩叶片，注射完成后，于原培养环境中培养2-3天，一般在第二天进行观察，观察当天，使用10mL的注射器以同样的方法注射 FM4-64染料，注射孔选择在原注射孔旁边，这样可以增加eYFP荧光和FM4-64染料的重合区域，易于观察。注射后反应5-10min，剪取注射孔附近没有机械损伤的部位，使用LSM700 激光共聚焦显微镜观察实验结果。由图6b可以看出，CaMV35S：eYFP、CaMV35S： ZmSWEET1b-eYFP和CaMV35S：ZmSWEET1b^E81K-eYFP均成功的在烟草叶肉细胞表达，并且信号比较强。CaMV35S：eYFP为对照载体，其荧光信号在烟草叶片细胞核、细胞膜等部位均能看到eYFP的荧光信号，CaMV35S：ZmSWEET1b-eYFP和CaMV35S：ZmSWEET1b^E81K-eYFP)的荧光信号在细胞质膜上，eYFP的信号与FM4-64的信号吻合，即ZmSWEET1b蛋白定位在细胞质膜，且突变不影响其定位。

通过上述实验证明ZmSWEET1b蛋白在亚细胞水平定位于细胞质膜。为了确定ZmSWEET1b蛋白在玉米中的组织器官定位，构建了两个植物表达载体Promoter^ZmSWEET1b:ZmSWEET1b-eYFP:terminator^ZmSWEET1b和Promoter^ZmSWEET1b:ZmSWEET1b-GUS:terminator^ZmSWEET1b，载体骨架为pCAMBIA3300(是一个商业载体，可以从生物公司购买)，先克隆ZmSWEET1b的启动子及基因区域，在终止子前一小段序列***eYFP报告基因或者GUS报告基因，融合表达后，后连接ZmSWEET1b基因的3'端终止子序列(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，载体构建完成后，以HiII玉米胚为材料进行遗传转化，获得转基因玉米种子，种子播种后，待幼苗的第二片叶子长到10-15cm 时，对转基因幼苗进行eYFP荧光观察和GUS染色分析。在观察eYFP荧光时，剪取1cm左右的叶片，浸泡于含有1/1000 Triton X-100FM4-64溶液中，抽真空15min，便可制片使用 LSM700激光共聚焦显微镜观察实验结果并拍取照片。结果如图7a所示，FM4-64将玉米叶片细胞的细胞质膜染成红色，eYFP荧光定位于气孔的副卫细胞膜上，FM4-64信号与eYFP 信号重合，所以，ZmSWEET1b蛋白定位在玉米气孔的副卫细胞膜。GUS染色结果与eYFP 相同，也定位在气孔的副卫细胞膜上，由于GUS连接在ZmSWEET1b基因的C端，C端位于细胞膜内，所以GUS的蓝色在细胞内可见(图7b)。

实施例6 ZmSWEET1b蛋白以二聚体或寡聚体的形式转运葡萄糖

以上研究发现ZmSWEET1b蛋白与突变蛋白ZmSWEET1b^E81K蛋白都可以定位在细胞膜上，但es1突变体的表型与野生型差别很大。拟南芥和水稻中的SWEET蛋白都可以形成寡聚体结构，这种结构可在疏水性的膜上形成亲水的孔道，利于糖分子的通过。为了验证ZmSWEET1b蛋白是否也具有相似的性质，我们设计了双分子荧光互补(BimolecularFluorescence Complementation，BiFC)实验。eYFP荧光蛋白按照一定规则切分为氨基端和羧基端后，两者空间上彼此接近时会组合成具有活性的荧光基团，如果ZmSWEET1b蛋白以二聚体或者寡聚体的形式存在，就会使eYFP荧光蛋白的氨基端和羧基端接近，可以观察到黄色荧光。将ZmSWEET1b基因的CDS序列和ZmSWEET1b^E81K基因的CDS序列分别与eYFP 的氨基端NE和羧基端CE融合，构建融合表达载体(质粒均保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)。将各载体转化农杆菌，稀释菌液至OD₆₀₀值0.4，注射烟草幼嫩叶片，注射后在原培养环境中继续培养烟草2-3天，观察当天，使用10mL的注射器注射FM4-64染料，注射孔选择在原注射孔旁边，注射后反应5-10min，剪取注射孔附近没有机械损伤的部位，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察实验结果。实验结果表明 ZmSWEET1b蛋白(即ES1蛋白)可以形成二聚体或寡聚体，产生黄色荧光，但是 ZmSWEET1b^E81K蛋白没有观察到黄色荧光，不能形成寡聚体，无法形成跨膜孔道(图8)，所以影响了玉米叶片光合作用产生糖的运输，最终导致玉米的籽粒变小，产量降低。玉米 ZmSWEET1b基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEET1b基因可以提高玉米产量，进行高产稳产育种。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 玉米籽粒大小基因ZmSWEET1b及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2954

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

catccatgta tccatccatc cacacacaca aacagacaag catacaacac cgttgccatt 60

tagctgttct tgctaggcag ttgcgcgctt acattgagcc gcagctagct gtctactacg 120

gcacaactat ctcctgcgcg cgtgctcgat cgatctgaag gccagacctg tgcctgtcca 180

attttgcctt gttctaccca ccacaccagt agtcgagaag gttccatata agcgcaagca 240

gacagcagca aaagagctaa ggagagtctg agacaaggtt cgaacagatg gaggatgtgg 300

tgaagttcgt ctttggagtt tccggtgaga gtgttgcagc agttcctagc tcatatatat 360

gtcctcactt tgatgatgat cttgtggttc ttttaatcta acttgctgcg cgcgtgcgtg 420

tgtgtgtgtt ttttttctgg gtttcaggaa atgtcatcgc tctcttcctc ttcctttccc 480

cagtgtaagt gctcgatgta gcgcccctcc tcgatttcgg taaattgtgt caacagggtc 540

ggagtgtgcg caaaatccta gcaaatataa acattgttcc agtacaagac tgatcacgca 600

caacttttac ttttgcttac acaaatataa aaataagacg tattccttca tttatttatt 660

tcattaagct ggatgtacac tggaaacatc cagcatccgg tacacctagc aaattattaa 720

tcgcgtgcca cacccacacc ttttgcgacg tgctacggtg ctagacgctt ttttatatta 780

ttattatagc ttttgtccat ttctgatact ccattcatgc gcgcgaaaca cgtagttgag 840

ctgttgtttt ctccagctga gtcatatata tacggcttga agctttaaac tgatcatctg 900

tcggggaaaa aatatatata cgtatgtttt tggctcgcag gcctacgttc tggaggatca 960

tcaggaggaa gtcgacggag gatttctcgg gggtgccgta cagcatgaca ctcctcaact 1020

gcctcttgtc agcttggtaa gaactgctgc atgctgctag atcgcactta agtttccaga 1080

gtgaaaacta gctagctagt agcaagctaa aaactactat agtagttagc tatcctccag 1140

acatattctc tatctcactc tctattttta aattcactct gaacttttta cacatccgtt 1200

tacacgttct gctggagttg gcctaccacc aaactgtagt tttcgaagcc ttgattccac 1260

gatgaaataa actcgccttc gcctagctcg tccaaacaga agcgcaccca ccacccaagc 1320

taatagatgt cagtccagga cctactagac tgcagcagac accagcacgc gcacaggaat 1380

ggtggtgctg tatgtgttat ttgttgcctg tctggaaggc acagcgcaaa gtggcgaaga 1440

aagaaacgag gagagagaac atctccatcg gccggcacgc caagagagta tgttgattat 1500

tactcagtcg atcgcgtgtt ccgtgccctg caggtacggg ctgccgttcg tgtccccgaa 1560

caacatgctg gtgtcgacga tcaacggcgc gggcgcggcg atcgaggccg tgtacgtggt 1620

gatcttcctg gcgttcgcgt ccagccagcg gacgcggctg cggatgctgg gcctggcgtc 1680

ggcggtctcg gcggcgttcg ccgccgtggc gctggcgtcg atgctggcgc tgcacggaca 1740

gggccggaag ctcatgtgcg gcctcgccgc caccgtctgc tccatctgca tgtacgcctc 1800

gccgctctcc atcatggtat acgtttcgtt ccacggcata tcggataatt atatcgtcag 1860

gcactgtacg tacggcagct tgactgtttc gttcgttcgt gcgtgcagag gctggtggtg 1920

aagaccaaga gcgtggagta catgccgttc ctgctgtcgc tggccgtgtt cctgtgcggc 1980

acgtcctggt tcgtctacgg cctgctcggc cgggacccct tcgtcgcggt acgtaagcac 2040

gtcatatata tgcagctagc agctaggcat atgcaaagct tgcagctact agtagctgtt 2100

cctttctagg cgtgtctgat gcgtcgtcgt cggttagccg gtagcgttcc gttgtcgtcg 2160

tctccgcctc tctggctctg ctggatgaat gctcttgacc tgccggcata ttcgagcaag 2220

gccgagtggc atagtgatat atggcgacca tgcacgcgca gtgacgcgcg cagtctgcag 2280

ccacatgcgt gcacgccgcg cgcgcgggtg ccactgccaa cgtggtcgag taaattaaat 2340

gggccgtgcc caagcggcga ggcaacgccc acgcgcgcgc ggacacaccg ccttcaattg 2400

cgcacgcctc gttaaaccaa agtgacattg atgcgtgtgg gtgggtgcag attcccaacg 2460

ggtgcgggag ctttctgggc gcagtgcagc tggtcttgta cgccatctac cgcgacagca 2520

acagcggcgg caagcagcag gccggcgacg acgtggagat ggcctccgac gccaagagca 2580

gcaagaaggt cgccgacgac gtcggcggca aggaggaccg cctggtctag catggagcta 2640

gccactttct ctttcggtgc gcgagcgtat gtttcctccc cccgtgattg tgtgtgtgtg 2700

catgtatacg agagtgcgtg ctgtactgta ctacctctgc gtgtgtgcaa taatgtaact 2760

gggtgtttca tctcgcaatg gggtgtctct ctccaagcgc gatttgctgg ccgtcggagg 2820

ccaaggtgga cgatagggat gccgtagttt tccggcgccg ctatgctagc tgttcacatg 2880

gtgccgatcg gcgatcgtga gccacggacg gagtgccttc caggccgcat ggctgcttcg 2940

cgggcccagc cata 2954

<210> 2

<211> 1364

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

catccatgta tccatccatc cacacacaca aacagacaag catacaacac cgttgccatt 60

tagctgttct tgctaggcag ttgcgcgctt acattgagcc gcagctagct gtctactacg 120

gcacaactat ctcctgcgcg cgtgctcgat cgatctgaag gccagacctg tgcctgtcca 180

attttgcctt gttctaccca ccacaccagt agtcgagaag gttccatata agcgcaagca 240

gacagcagca aaagagctaa ggagagtctg agacaaggtt cgaacagatg gaggatgtgg 300

tgaagttcgt ctttggagtt tccggaaatg tcatcgctct cttcctcttc ctttccccag 360

tgcctacgtt ctggaggatc atcaggagga agtcgacgga ggatttctcg ggggtgccgt 420

acagcatgac actcctcaac tgcctcttgt cagcttggta cgggctgccg ttcgtgtccc 480

cgaacaacat gctggtgtcg acgatcaacg gcgcgggcgc ggcgatcgag gccgtgtacg 540

tggtgatctt cctggcgttc gcgtccagcc agcggacgcg gctgcggatg ctgggcctgg 600

cgtcggcggt ctcggcggcg ttcgccgccg tggcgctggc gtcgatgctg gcgctgcacg 660

gacagggccg gaagctcatg tgcggcctcg ccgccaccgt ctgctccatc tgcatgtacg 720

cctcgccgct ctccatcatg aggctggtgg tgaagaccaa gagcgtggag tacatgccgt 780

tcctgctgtc gctggccgtg ttcctgtgcg gcacgtcctg gttcgtctac ggcctgctcg 840

gccgggaccc cttcgtcgcg attcccaacg ggtgcgggag ctttctgggc gcagtgcagc 900

tggtcttgta cgccatctac cgcgacagca acagcggcgg caagcagcag gccggcgacg 960

acgtggagat ggcctccgac gccaagagca gcaagaaggt cgccgacgac gtcggcggca 1020

aggaggaccg cctggtctag catggagcta gccactttct ctttcggtgc gcgagcgtat 1080

gtttcctccc cccgtgattg tgtgtgtgtg catgtatacg agagtgcgtg ctgtactgta 1140

ctacctctgc gtgtgtgcaa taatgtaact gggtgtttca tctcgcaatg gggtgtctct 1200

ctccaagcgc gatttgctgg ccgtcggagg ccaaggtgga cgatagggat gccgtagttt 1260

tccggcgccg ctatgctagc tgttcacatg gtgccgatcg gcgatcgtga gccacggacg 1320

gagtgccttc caggccgcat ggctgcttcg cgggcccagc cata 1364

<210> 3

<211> 250

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 3

Met Glu Asp Val Val Lys Phe Val Phe Gly Val Ser Gly Asn Val Ile

1 5 10 15

Ala Leu Phe Leu Phe Leu Ser Pro Val Pro Thr Phe Trp Arg Ile Ile

20 25 30

Arg Arg Lys Ser Thr Glu Asp Phe Ser Gly Val Pro Tyr Ser Met Thr

35 40 45

Leu Leu Asn Cys Leu Leu Ser Ala Trp Tyr Gly Leu Pro Phe Val Ser

50 55 60

Pro Asn Asn Met Leu Val Ser Thr Ile Asn Gly Ala Gly Ala Ala Ile

65 70 75 80

Glu Ala Val Tyr Val Val Ile Phe Leu Ala Phe Ala Ser Ser Gln Arg

85 90 95

Thr Arg Leu Arg Met Leu Gly Leu Ala Ser Ala Val Ser Ala Ala Phe

100 105 110

Ala Ala Val Ala Leu Ala Ser Met Leu Ala Leu His Gly Gln Gly Arg

115 120 125

Lys Leu Met Cys Gly Leu Ala Ala Thr Val Cys Ser Ile Cys Met Tyr

130 135 140

Ala Ser Pro Leu Ser Ile Met Arg Leu Val Val Lys Thr Lys Ser Val

145 150 155 160

Glu Tyr Met Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Val Phe Leu Cys Gly Thr

165 170 175

Ser Trp Phe Val Tyr Gly Leu Leu Gly Arg Asp Pro Phe Val Ala Ile

180 185 190

Pro Asn Gly Cys Gly Ser Phe Leu Gly Ala Val Gln Leu Val Leu Tyr

195 200 205

Ala Ile Tyr Arg Asp Ser Asn Ser Gly Gly Lys Gln Gln Ala Gly Asp

210 215 220

Asp Val Glu Met Ala Ser Asp Ala Lys Ser Ser Lys Lys Val Ala Asp

225 230 235 240

Asp Val Gly Gly Lys Glu Asp Arg Leu Val

245 250

Claims

1.编码糖转运蛋白ZmSWEET1b的基因在减小玉米籽粒或促进叶片早衰中的应用，所述糖转运蛋白ZmSWEET1b的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述编码糖转运蛋白ZmSWEET1b的基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。