CN108948142A - 一种靶向肿瘤细胞及新生血管的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于靶向性成像癌细胞及新生血管的荧光探针，该荧光探针解决了对高表达整合素αvβ3的癌细胞的选择性成像问题。本发明的荧光探针在分子结构的设计上，利用RGD作为识别基团对三芳基类荧光团进行多位点修饰从而构建能与整合素αvβ3结合的多价探针。该类探针能在细胞水平能选择性成像高表达整合素αvβ3的癌细胞，在活体内能靶向性成像肿瘤部位。同时，本发明的荧光探针合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

Description

一种靶向肿瘤细胞及新生血管的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于靶向性成像癌细胞及新生血管的新型荧光探针及其制备方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
目前，癌症是世界范围内的一种重大疾病，造成每年超过700万人死亡，预测在未来的20年，癌症会成为一个更大的问题。发展癌细胞或组织的选择性可视化成像技术有助于探究癌症的发生、发展机制，实现早期诊断和预后评估，提高手术切除率，提高生存率。
分子影像和探针是可以更早发现疾病、确定疾病性质、客观并非介入性地监测治疗效果并预测疾病发展的两种方法，其主要是针对分子和细胞水平病变。其中，利用荧光探针进行的荧光成像法由于具有高的选择性，高的分辨率，高的灵敏度，非侵入性，易于裸眼观测，可在细胞、组织或生物体进行原位、实时检测等众多无可比拟的优点且能避免一些传统成像技术产生的放射危害；从而为恶性肿瘤的选择性可视化提供了一种很有前途的策略。因此，发展肿瘤靶向性的荧光探针不仅可以为癌症早期诊断提供有力的工具，还能够在分子水平上直观精确界定肿瘤浸润和转移范围，实现手术中实时动态导航，获得安全切缘，降低切缘阳性率。
以肿瘤间质为靶点的分子成像研究主要集中在肿瘤新生血管方面，因为恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及复发均与肿瘤新生血管密切相关。整合素αvβ3是目前靶向血管显像研究中最常用的特征性标记物之一。正常情况下，整合素αvβ3仅在小肠、血管、子宫等组织中呈低水平表达；而在肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞、创伤、炎症组织中呈高表达，它参与了血管内皮细胞激活、增殖、凋亡和迁移多个过程，在肿瘤细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等过程中起到了重要作用。整合素αvβ3可特异性识别RGD肽，即一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)短肽。利用整合素αvβ3作为成像靶点，可制备靶向肿瘤及新生血管的分子探针。
“多价效应”指的是多个配体作为一个整体与多个受体的结合产生的协同作用要比同等数量单价作用的加和效应强得多，同时可以提高配体的灵敏性和特异性。因此，利用多个靶向基团对荧光分子进行修饰可以实现“多价效应”，并可同时提高探针的灵敏度和选择性。
三芳基硼是典型的分子内电荷转移化合物(ICT)，具有强的发光、发光性质对微环境变化敏感、双光子性质等。这些性质都是非常适合用于生物成像的。但是，在三芳基硼应用于靶向整合素αvβ3肿瘤细胞的生物荧光探针设计上，未见文献报道。
因此，开发一种新的、高灵敏、高选择性的对肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素αvβ3进行特异靶向结合的荧光探针，将对肿瘤的探查、诊断、评估肿瘤病变情况和制定个体化治疗方案具有重大意义。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，一方面，本发明所要解决的技术问题是提供一种三芳基硼-RGD荧光探针，即提供一种能够对高表达整合素αvβ3的癌细胞的选择性成像的荧光探针。
为实现该目的，本发明提供一种用于靶向肿瘤细胞及新生血管的荧光探针，其化学结构通式如下(I)所示：
其中，R1、R2、R3可以相同或不同，分别为卤素原子或被含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)(RGD)序列的基团取代的-N-杂环基，且R1、R2、R3不能全部同时为卤素原子。
本发明的荧光探针以发光性质优良的三芳基硼化合物作为荧光基团，-N-杂环基上的氮原子与三芳基苯硼的苯环相连，形成与硼原子共轭体系，氮原子可以作为电子给体与硼原子作为受体，从而形成分子内电荷转移(ICT)化合物，确保三芳基硼类探针的优良发光性质。该荧光探针利用能靶向肿瘤标志物整合素αvβ3受体的RGD基团作为识别基团对三芳基硼-N-杂环化合物进行结构修饰，从而实现对高表达整合素αvβ3的癌细胞的选择性成像的目的。
另外，当本发明的荧光探针在水环境中，荧光分子结构中荧光基团部分被RGD包围，为荧光基团提供了一种疏水环境，使荧光基团周围微环境极性降低，所以探针在PBS(磷酸盐缓冲溶液)中的发光呈现在较低极性下的青色荧光。从而达到使荧光探针在高极性的水环境下仍然具有强荧光性质的目的。
优选的，所述的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)(RGD)序列的基团为环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)基团。其独特的环状结构，对高表达整合素αvβ3的癌细胞具有更高的结合力，从而提高了探针的选择性。
优选的，所述的-N-杂环基可以为多氮杂环烷衍生物基团。多氮杂环一方面可以通过其中一个N原子作为给电子基团，与硼形成分子内电荷转移(ICT)，另一方面其他多个N原子可用于引入多个识别基团，有利于实现多价效应。由于有多价效应的存在，探针会具有更高的选择性和灵敏性。更优选的，所述的多氮杂环烷为哌嗪、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷中的任意一种。
在本发明中，三芳基硼化合物具有可被多位点修饰的结构，其中R1、R2、R3不能全部为卤素原子，所述的卤素原子可以是Cl、Br，优选Br。当探针结构中仅有一个RGD基团取代时，单RGD基团取代的荧光探针对高表达整合素αvβ3的癌细胞具有一定选择性；当含有多个RGD基团取代时，多个RGD与整合素结合，结合力更强，产生多价效应。在本发明中的较佳实施方式中，优选R1、R2、R3均为被RGD序列的基团取代的-N-杂环基。多个RGD基团产生的“多价效应”，可以提高探针与受体的结合能力。
在本发明的实施方式中，所述的被环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)基团取代的-N-杂环基，可以选自如下结构中的任意一种：
本发明中的荧光探针能进一步用于细胞成像，由于探针分子能敏感的与整合素αvβ3受体特异性结合，当探针与相应细胞一起培养时，将会与相应细胞表面的αvβ3受体结合。过度表达αvβ3的肿瘤细胞及新生血管细胞会比其他细胞呈现更强的荧光。因此能选择性成像肿瘤细胞及新生血管细胞。
优选地，所述荧光探针在细胞成像条件为：激发波长为405nm，收集范围为：500-550nm。
在本发明中的荧光探针能进一步用于活体成像，将探针注入裸鼠体内，能进入血液循环***，当血液中的探针分子流经肿瘤部位时，能与肿瘤细胞表面的αvβ3受体结合。从而使探针分子富集在肿瘤部位，使肿瘤部位呈现更强的荧光。实现在活体内对肿瘤部位进行选择性成像的目的。
同时，本发明还提供所述荧光探针的应用，主要是应用于细胞成像和活体成像检测，检测评价时的优选测定方法为：
将本发明所述荧光探针的PBS溶液注入细胞的培养基中进行培养，然后用PBS(磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞，再进行荧光成像；观察不同细胞的成像差异。
将本发明所述荧光探针的PBS溶液通过腹腔注射注入小鼠体内，观察注入后肿瘤部位与非肿瘤部位的荧光信号差异。从而实现在体内对肿瘤实现靶向性成像。
另一方面，本发明还提供一种制备所述荧光探针的方法，包括以下步骤：
步骤一，惰性气体保护下，以5-卤代-2-碘间二甲苯为原料，加入烷基锂试剂、三氟化硼***络合物，得到卤代三芳基苯硼烷；
步骤二，偶联反应：惰性气体保护，在偶联试剂作用下，卤代三芳基苯硼烷与部分氨基被保护的多氮杂环烷反应得到碳氮偶联产物；
步骤三，脱保护反应：脱去上述碳氮偶联产物中氨基的保护基团，得到去保护的氮杂环产物；
步骤四，酰化反应：碱性条件下，将去保护的氮杂环产物与卤代酰氯反应，得到酰胺产物；
步骤五，取代反应：在碱的作用下，酰胺产物与cRGD反应，制备得到所述荧光探针。
在本发明的具体实施例中，所述的步骤一中，反应温度为低温，优选为-78℃；所述的惰性气体可以选自氮气或氩气；所述的烷基锂试剂可以选自正丁基锂或叔丁基锂；所述的5-卤代-2-碘间二甲苯可以选自5-溴-2-碘间二甲苯或5-氯-2-碘间二甲苯；反应结束后优选用水洗，用石油醚作展开剂过硅胶柱提纯。
所述的步骤二中，反应温度优选90℃；所述的惰性气体可以选自氮气或氩气；所述的偶联试剂为叔丁醇钠(NaOtBu)、三叔丁基磷(BINAP)和醋酸钯(Pd(AcO)2)的甲苯溶液；所述的部分氨基被保护的多氮杂环烷的氨基保护基团可以选自苄氧羰基(Cbz)或叔丁氧羰基(Boc)保护基；所述多氮杂环烷可以选自哌嗪、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷中的任意一种；反应结束后优选用水洗，硫酸镁干燥，再用硅胶柱提纯。
所述的步骤三为通过加入酸，脱去氨基的保护基团，反应优选在冰浴条件下进行；其中所述的酸可以选自HCl、TFA或HBr；反应结束后用碱性离子交换树脂进行提纯。
所述的步骤四中，反应优选在冰浴条件下进行；所述碱可以是三乙胺，所述的卤代酰氯可以选自氯代乙酰氯或溴代乙酰氯；反应后优选用水洗，硫酸镁干燥，再用硅胶柱提纯。
所述的步骤五中，反应优选在常温条件下进行；所述的碱为碳酸钾；反应后优选透析的方法进行提纯。
技术效果
(1)本发明所述的用于靶向性成像肿瘤细胞及新生血管的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
(2)本发明所述的靶向性成像肿瘤细胞及新生血管的荧光探针能够对高表达整合素αvβ3的癌细胞的选择性成像。
(3)本发明中优选的荧光探针，含多个RGD基团，具有“多价效应”，提高了探针与受体的结合能力，使探针会具有更高的选择性和灵敏性。
(4)本发明所述的靶向性成像肿瘤细胞及新生血管的荧光探针能实现在活体中靶向性成像肿瘤部位的目的，使肿瘤部位表现出更强的荧光。
以下将结合具体实施例和附图对本发明的构思、过程、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一较佳实施例的TAB-3-cRGD荧光探针在PBS溶液中的吸收光谱和荧光光谱。
图2是本发明的一较佳实施例的TAB-3-cRGD荧光探针在NIH/3T3细胞成像中的应用。
图3是本发明的一较佳实施例的TAB-3-cRGD荧光探针在HUVEC-1细胞成像中的应用。
图4是本发明的一较佳实施例的TAB-3-cRGD荧光探针在U87MG细胞成像中的应用。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的指导思想，给出下列系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。
实施例1 TAB-3-cRGD的合成
(1)化合物2的制备：
在氮气的保护下，将10g(32mmol)化合物2溶解于60mL干燥的***中，冷却至-78℃，向其滴加入20mL浓度为1.6M的正丁基锂正己烷溶液。将反应升温至室温并搅拌20min。然后，再次冷却至-78℃，加入1.25mL(10mmol)三氟化硼***。反应继续在室温反应，搅拌过夜。旋干溶剂，进一步用硅胶柱色谱纯化得白色固体4.0g，产率71％。
(2)化合物3的制备：
将595mg(3.2mmol)N-甲酸叔丁酯哌嗪，560mg(1mmol)化合物2，864mg(9mmol)叔丁基醇钠，27mg(0.12mmol)醋酸钯放入三口瓶中，在双排管上抽排三次，在氮气的保护下，加入50mL甲苯，再加入25mg三叔丁基磷，常温搅拌15min。然后升温至90℃并反应24h。然后将反应冷却至20℃，水洗，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并浓缩。初产物通过硅胶柱进一步纯化得化合物3为334mg，产率为38％。
(3)化合物4的制备：
将88mg(0.1mmol)化合物3溶于5mL二氯甲烷；甲醇＝5∶2的混合溶剂中，并加入2mL浓盐酸。该反应在室温搅拌48h(直到没有起始原料)，反应结束后将溶剂旋干，产生粘稠的固体，将固体用10mL甲醇溶解并倒入强碱性的阴离子交换柱上(Ion exchanger III；Merck)。用100ml甲醇冲洗。将溶液旋干得到57mg(99％)化合物4为黄色固体。
(4)化合物5的制备：
在氮气的保护下，在装有57g(0.99mmol)化合物4的圆底烧瓶中加入干燥的二氯甲烷，并加入0.5ml三乙胺，在冰盐浴的条件下逐滴滴入氯代乙酰氯67.2mg(0.6mmol)，搅拌过夜。反应结束后初产物通过硅胶柱进一步纯化得化合物5为71.2mg，产率为89％。
(5)化合物6的制备：
将8mg(0.01mmol)化合物5、17.3mg(0.03mmol)cRGD、4.1mg(0.03mmol)碳酸钾溶解于5mL乙腈∶水＝4∶1的混合溶剂中，搅拌过夜。将溶液旋干，溶解于1ml水中，用分子量为1000的透析袋进行透析三天。浓缩得TAB-3-cRGD为22.15mg，产率为91％。
实施例2：TAB-3-cRGD荧光探针的吸收光谱和荧光光谱的检测
配制浓度为10μM的TAB-3-cRGD探针PBS溶液，加入3mL到10mm*10mm的两通比色皿中，放入调好基线的分光光度计中，测试500-300范围内的数据；随后将溶液倒入10mm*10mm的四通比色皿中，以405nm为激发波长，测试430-700nm范围内的荧光光谱(见图1)。由图1可知，TAB-3-cRGD的最大吸收峰在380nm处，最大发射峰在490nm处。
实施例3：TAB-3-cRGD荧光探针在活细胞中的成像应用
将小鼠成纤维细胞NIH/3T3、静脉内皮细胞HUVEC-1、神经胶质瘤U87细胞利用培养基(培养基中DMEM培养液和胎牛血清的体积比为9∶1)培养在共聚焦培养皿上。放置于条件为37℃、5％(体积分数)CO2和20％(体积分数)O2的培养箱中培养24-48h。移除培养基，用PBS洗三次，然后加入不含血清的DMEM培养液，分别于各培养皿中加入本发明TAB-3-cRGD荧光探针的溶液，继续在培养箱中培养15min，PBS(磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞6次。利用共聚焦显微镜进行荧光成像。成像条件为：激发波长405nm，收集范围为：500-550nm。如图2是TAB-3-cRGD在NIH/3T3中的成像图，由该图可知TAB-3-cRGD不能成像NIH/3T3细胞。图3是TAB-3-cRGD在HUVEC-1细胞中的成像图，其表明TAB-3-cRGD可以与静脉内皮HUVEC-1细胞结合，且能通过双通道模式进行信号输出。图4是TAB-3-cRGD在裸鼠肿瘤模型内的成像图，其表明TAB-3-cRGD可以与大脑胶质瘤细胞U87MG结合，且通过与细胞膜染料的共定位实验证实其主要结合到细胞膜表面。
实施例4：TAB-3-cRGD荧光探针在活体中的成像应用
神经胶质瘤裸鼠荷瘤模型的建立：调整神经胶质瘤U87细胞为对数生长期后用0.25％胰蛋白酶消化，含10％的胎牛血清的DMEM培养液重悬，PBS溶液洗涤两次后，用PBS溶液制备成单细胞悬液，稀释成细胞密度为1×107/mL，用1mL注射器抽取肿瘤细胞悬液(2×106)接种于裸鼠后肢背部外侧皮下，待肿瘤长至能明显观察到时，通过腹腔注射0.2ml浓度为4mM的TAB-3-cRGD溶液，再利用小动物成像仪进行光学成像检测。TAB-3-cRGD荧光探针在裸鼠肿瘤模型内的成像图表明TAB-3-cRGD能靶向成像小鼠的肿瘤部位。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于靶向肿瘤细胞及新生血管的荧光探针，其化学结构通式如下(I)所示：
其中，R1、R2、R3相同或不同，为卤素原子或被含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)系列(RGD系列)基团取代的-N-杂环基，且R1、R2、R3不能同时全部为卤素原子。
2.如权利要求1所述的荧光探针，其中所述的-N-杂环基为多氮杂环烷衍生物基团。
3.如权利要求2所述的荧光探针，其中所述的多氮杂环烷为哌嗪、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷中的任意一种。
4.如权利要求1所述的荧光探针，其中所述的卤素为溴或氯；所述的被含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)系列(RGD系列)基团取代的-N-杂环基，为被环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)基团取代的-N-杂环基。
5.如权利要求4所述的荧光探针，其中所述的被环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)基团取代的-N-杂环基，选自如下结构中的任意一种：
6.一种如权利要求1-5中任一所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，惰性气体保护下，以5-卤代-2-碘间二甲苯为原料，加入烷基锂试剂、三氟化硼***络合物，得到卤代三芳基苯硼烷；
步骤二，惰性气体保护，在偶联试剂作用下，卤代三芳基苯硼烷与部分氨基被保护的多氮杂环烷反应得到碳氮偶联产物；
步骤三，脱去上述碳氮偶联产物中氨基的保护基团，得到去保护的氮杂环产物；
步骤四，碱性条件下，将去保护的氮杂环产物与卤代酰氯反应，得到酰胺产物；
步骤五，在碱的作用下，酰胺产物与环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)反应，制备得到所述荧光探针。
7.如权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其中，步骤一的反应温度为-78℃；所述的惰性气体选自氮气或氩气；所述的烷基锂试剂选自正丁基锂或叔丁基锂；所述的5-卤代-2-碘间二甲苯可以选自5-溴-2-碘间二甲苯或5-氯-2-碘间二甲苯。
8.如权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其中，步骤二的反应温度为90℃；所述的惰性气体选自氮气或氩气；所述的偶联试剂为叔丁醇钠(NaOtBu)、三叔丁基磷(BINAP)和醋酸钯(Pd(AcO)2)的甲苯溶液；所述的部分氨基被保护的多氮杂环烷的氨基保护基团可以选自苄氧羰基(Cbz)或叔丁氧羰基(Boc)保护基；所述多氮杂环烷选自哌嗪、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷中的任意一种。
9.如权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其中，步骤三为通过加入酸，脱去氨基的保护基团，其中所述的酸选自HCl、TFA或HBr；步骤四中所述碱是三乙胺，所述的卤代酰氯选自氯代乙酰氯；步骤五中所述的碱为碳酸钾。
10.一种如权利要求1-5中任一所述的荧光探针在细胞成像中的应用，条件为：激发波长为405nm；收集范围为：500-550nm。
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