CN108931548A - 一种通过纯化学位移nmr谱鉴别茶叶产地差异的方法 - Google Patents

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薄雨
许晶晶
董继扬
陈忠
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Abstract

本发明涉及一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，将PSYCHE纯化学位移谱方法与多变量统计分析方法相结合，并应用于低浓度天然食品茶叶的组成分析中。通过对获得的纯化学位移谱进行主成分分析法和正交偏最小二乘法分析，实现了对茶叶产地的鉴别，同时找到了不同产地茶叶的差异物质。本发明所采用的PSYCHE纯化学位移谱方法法能够去除宽带同核1H‑1H偶合，仅保留了化学位移信息，应用于低浓度样品获得了质量较高的纯化学位移氢谱，提高了谱图分辨率。PSYCHE脉冲序列简单，易于操作，常规谱仪条件即可满足实验要求。与现有茶叶产地鉴别方法相比较，本发明提出的NMR方法具有可重复性、非侵入性及谱图分辨率高等优点。

Description

一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法
技术领域
本发明涉及核磁共振波谱学检测技术，更具体地说，涉及一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法。
背景技术
茶叶是备受人们喜爱的饮品，具有深厚的文化底蕴。在我国，茶叶产地幅员辽阔，茶叶本身又分为绿茶、红茶、白茶等种类，不同产地和种类的茶叶又有着不同的口感和价值，具有明显的地域特色和品质特征，是典型的地理标志保护产品。而随着茶叶地理标志保护产品越来越多，假冒产品标识、以次充好的现象愈来愈多，对市场公平性、品牌保护、消费者权益造成严重侵害。于是茶叶制品的产地、真伪等鉴别对于茶叶市场和消费者都有着重要意义。
传统茶叶鉴别方法是通过茶叶的色、香、味进行判别，然而这种方法需要丰富的经验同时受到严重的主观因素影响，近些年人们将现代技术应用于茶叶鉴别中获得了很好的效果。例如使用稳定同位素和多矿物元素检测技术通过对不同产地同位素和矿物的含量和相对比例进行检测来进行产地验证和鉴别，利用近红外光谱扫描分析技术结合数据处理与统计分析等手段实现产地和类别的鉴定，以及利用色谱分析方法和化学指纹图谱构建技术来筛选具有明显特征的化学组分用于种类鉴别和产地溯源都取得了很好地效果。
核磁共振技术是解析分子结构的常用手段之一，也已经在食品领域得到了非常广泛的应用。在核磁共振技术的发展历程中，分辨率和灵敏度是衡量谱图质量的两大因素，在硬件设备、磁场强度以及脉冲技术高速发展带来灵敏度的不断提高的同时，如何提高核磁共振谱图的分辨率一直都是研究的热点问题。核磁共振技术可以借助核自旋引起的成键电子对之间的相互作用所产生的标量偶合信息(J偶合)来获取分子内部的结构信息。然而，标量偶合作用同样造成了谱峰的重叠，这大大降低了1H NMR谱分辨率。
近年来，通过消除标量偶合——将偶合裂分的谱峰变成单峰来减少谱峰重叠、显著提高谱分辨率的纯化学位移谱技术得到快速发展。1976年，Ernst等人首次通过将二维(two dimensional，2D)J谱投影获得一维纯化学位移谱。之后不久，由Bax等人提出的恒时演化(constant time evolution)方法、通过分离与不同C(12C/13C)化学键相连的1H完成去偶的BIRD(bilinear rotational decoupling)方法，由Zangger和Sterk提出的基于层选去偶的ZS(Zangger-Sterk)方法以及由Morris提出的利用两个频率扫描方向相反的小角度chirp脉冲激发的PSYCHE(pure shift yielded by chirp excitation)方法等被相继提出，使得人们对于不同研究对象有了更加灵活的手段可以进行选择。其中由Morris小组提出的PSYCHE方法通过用两个频率扫描方向相反的小角度chirp脉冲将不想要的信号滤掉只留下想要的化学位移信号，同时可以调节翻转角度找到谱图纯净度和灵敏度之间的平衡，其在强偶合体系中表现最好，灵敏度最高，是目前最有前景的同核宽带去偶方法。
核磁共振与多变量统计分析中的模式识别联用的方法有着可重复性、非侵入性等优点，同时灵敏度高、重复性好，在食品质量控制中已有广泛使用。模式识别方法主要分为两大类，非监督性模式识别和监督性模式识别，非监督模式识别主要应用的是主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)方法，可以在保持数据信息损失最少的原则下，对高维变量进行降维处理。而监督性模式识别方法使用的较多的是偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，以样本类别为响应变量Y建立一个PLS模型，可以实现两组变量之间的相关性分析。与正交信号校正(orthogonalsignal correction，OSC)联用，即正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，OSC滤掉了与类别判断不相关的变量信息，只保留与类别判断有关的变量，从而使类别判别分析能集中在与类别相关的变量上，提高了模式识别方法的判断能力。
在核磁共振氢谱中，质子信号峰的积分面积和产生该信号的氢原子数成正比，因此利用多变量统计分析方法对谱图积分数据进行分析即可得到不同检测样品之间不同化合物的相对含量差异，在食品鉴别上获得应用。
目前，PSYCHE纯化学位移谱方法仅用于简单化学样品验证其去偶效果，并未在实际的组成复杂的天然产物样品中得到应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种将PSYCHE纯化学位移谱方法与多变量统计分析方法相结合，并将其应用于茶叶产地的检测，实现鉴别不同产地茶叶的目的的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法。
本发明的技术方案如下：
一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，步骤如下：
1)制备不同产地的茶叶样品；
2)在核磁共振波谱仪上导入预先编译好的纯化学位移NMR谱脉冲序列以及常规NMR谱脉冲序列；设置脉冲序列参数和采样参数，进行数据采集；对采集的数据进行相关的数据处理，得到所有样品的纯化学位移谱图；
3)通过相应的实验数据预处理获得纯化学位移谱图的分段积分数据；
4)将分段积分数据导入到统计分析软件中，通过主成分分析和正交偏最小二乘法分析判断两组组间和/或组内差异大小；
5)分析导致组间差异的化合物，判断不同产地的茶叶之间的化合物差异。
作为优选，步骤2)中，纯化学位移NMR谱脉冲序列为PSYCHE序列，常规NMR谱脉冲序列为tnnoesy序列；调用常规一维氢谱序列采集待测样品的一维氢谱，获得其信号峰分布区域及谱线线宽，为谱宽参数设置提供参考；再经过数据采集，得到待测样品的纯化学位移谱和常规tnnoesy谱。
作为优选，常规一维氢谱序列由一个非选择性射频脉冲和采样期构成，非选择性射频脉冲作用后进行信号采样。
作为优选，步骤3)中，对PSYCHE序列所采集到的FID信号进行数据处理，包括傅里叶变换、谱图相位和基线的调整、定标，去除干扰峰、分段积分和归一化后得到磁共振谱图的积分数据；对tnnoesy序列所采集到的FID信号进行傅里叶变换。
作为优选，步骤3)中，进行所述的数据处理时，对PSYCHE原始FID数据进行数据重组，将FID拼接组合，再通过傅里叶变换得到PSYCHE纯化学位移谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化；
tnnoesy的FID通过傅里叶变换得到常规tnnoesy谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化。
作为优选，步骤3)中，所得到的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱分别用MestReNova软件进行数据预处理操作，包括手动相位矫正、多点基线矫正、定标、谱峰对齐和分段积分。
作为优选，去除PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱中的水峰部分，对剩余部分区域进行等间隔积分。
作为优选，步骤4)中，利用统计分析软件SIMCA-P+来完成主成分分析和正交偏最小二乘法分析，获取不同产地的茶叶之间的聚类特征以及引起差异代谢物。
作为优选，步骤1)中，茶叶的溶液样品制备步骤为：将茶叶研磨成粉末，进行水浴加热；取上层清液放入离心机进行离心，再取上层清夜加入缓冲液，混合后移入核磁管密封。
本发明的有益效果如下：
本发明将PSYCHE纯化学位移谱方法与多变量统计分析方法相结合，并应用于低浓度天然食品茶叶的组成分析中。通过对获得的纯化学位移谱进行主成分分析法和正交偏最小二乘法分析，实现了对茶叶产地的鉴别，同时找到了不同产地茶叶的差异物质。
本发明所采用的PSYCHE纯化学位移谱方法法能够去除宽带同核1H-1H偶合，仅保留了化学位移信息，应用于低浓度样品获得了质量较高的纯化学位移氢谱，提高了谱图分辨率。PSYCHE脉冲序列简单，易于操作，常规谱仪条件即可满足实验要求。
与现有茶叶产地鉴别方法相比较，本发明提出的NMR方法具有可重复性、非侵入性及谱图分辨率高等优点。采用本发明可以对茶叶的来源进行检测，为食品检测及分析提供一种简便有效的方法。
附图说明
图1是PSYCHE去偶脉冲序列的示意图；
图2是分别使用PSYCHE纯化学位移脉冲序列和tnnoesy序列所采集到的仙都茶叶样品和祥华茶叶样品的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy氢谱的示意图；
图3是仙都茶叶样品(图中显示为方形)和祥华茶叶样品(图中显示为圆形)进行主成分分析(PCA)所得到的得分图；
图4是仙都茶叶样品(图中显示为方形)和祥华茶叶样品(图中显示为圆形)进行正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)所得到的得分图；
图5是由OPLS分析结果通过MATLAB处理得到的负载图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，将PSYCHE纯化学位移谱方法与多变量统计分析方法相结合，通过对获得的纯化学位移谱进行主成分分析法和正交偏最小二乘法分析，实现了茶叶产地的鉴别，并找到不同产地茶叶的差异物质。
一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，具体实施过程中的各个步骤如下：
1)茶叶样品制备，将所需要检测的茶叶配制成为用核磁共振谱仪检测的溶液样品。
茶叶来源以及溶液样品的配制：本实施例中，所选用的铁观音茶叶采集自福建省泉州市安溪县仙都乡(25°11′N，117°44′E)和祥华乡(25°03′N，117°38′E)，经过严格统一的处理发酵工艺标准进行生产(轻发酵乌龙茶初制加工技术规程DB25/T 1083-2010)。
配样方法为：称取将干茶叶磨成粉通过150目筛后的粉末400mg，加入1.5mL重水，进行80摄氏度的水浴加热30min，取上层清液1mL放入离心机进行离心(20min，转速10000rpm)，取上层清夜600μL加入100μL配置好的缓冲液(100mM K2HPO4/NaH2PO4，pH5.29，99.9％D2O)，混合后移入5mm核磁管密封。
2)茶叶样品的NMR检测，导入事先编译好的序列进行实验数据采集，得到1H NMRPSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱。
核磁共振谱采集：将已经制备好的茶叶溶液样品核磁管置于500MHzAgilentNMRSystem核磁共振谱仪中，用常规单脉冲序列采集一张1H NMR谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据，同时线宽值反映了磁场均匀性情况。所述常规一维脉冲序列是核磁共振谱仪自带的一维脉冲序列，由一个非选择性射频脉冲和采样期构成，即非选择性射频脉冲作用后紧跟着进行信号采样，目的是为了检查磁场均匀性，保证实验能够获得较高质量的谱图，同时为谱宽参数设置提供依据。
向核磁共振谱仪操作软件中导入事先编译好的纯化学位移方法PSYCHE序列和常规tnnoesy序列；设置合理参数，进行数据采集，其中，PSYCHE序列所得到的自由感应衰减信号需要通过事先编译好的数据处理程序进行自由感应衰减信号(FID)拼接重组获得新的FID，将这个拼接后的FID和tnnoesy序列所得到的FID分别进行傅里叶变换，得到所检测茶叶样品的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱。
本发明采用的是PSYCHE(pure shift yielded by chirp excitation，以下简称PSYCHE)序列(delay-90°-t1/2-180°-chirp-t1/2-acq)，PSYCHE方法是近些年由Morris小组提出的一种同核宽带去偶技术。这种方法的关键点在于采用两个频率扫描方向相反的小翻转角度的Chirp脉冲。Chirp脉冲和梯度磁场相结合使不同位置样品的零量子信号经历不同的演化时间，从而压制了零量子信号。这对Chirp脉冲选择的是两边相干阶相反并且在中间相干阶为零的信号，即交叉峰路径被压制。同时，通过对Chirp脉冲的翻转角度β的调节可以在谱图的灵敏度和抑制噪声方面找到平衡，所需要的纯化学位移信号强度正比于sin2β而不需要的信号强度正比于sin4β。在本实验中所选用的β角度为10°。
PSYCHE方法使用了数据组块技术，即对一系列短的FID组块进行测量，其中每个都重聚掉标量偶合演化，并将这些短的FID拼接成为新的FID，经过傅里叶变化即可获得纯化学位移谱。这种技术的重点在于化学位移演化效应在组块间连续而标量偶合在组块间重聚，具体是通过采用伪2D数据采样来实现，在伪2D实验的第一次增量中，可以在激发之后立即采样获得前10～20ms的FID，对于随后的数据块，重点是保持在采样开始前的化学位移演化时间与直到采样那一刻先前数据块累积的持续时间相同，也就是说数据采样的开始必须恰好是在之前组块结束的时刻。获取整个伪2D数据集之后连接各个数据块即可获得纯化学位移FID，再经过傅里叶变换获得纯化学位移谱。
本实施例使用的为500MHz AgilentNMR System核磁共振谱仪，为了展示PSYCHE纯化学位移谱的效果，采集了常规tnnoesy谱进行对照，所用序列为tnnoesy(delay-90°-t1-90°-tm-90°-acq)。具体的参数设置分别为：
如图1所示，PSYCHE纯化学位移脉冲序列：弛豫延迟2s，直接维谱宽SW为8000Hz，间接维谱宽SW1为80Hz，间接维采样点数ni为20，累加次数nt为8，采样点数np为32000，空扫次数ss为16，采样时间at为2.5s。
tnnoesy序列：弛豫延迟2s，谱宽sw为10000Hz，累加次数nt为128，采样点数为64000，空扫次数ss为8，采样时间at为2.2s，在t1(4μs)和tm(100ms)期间进行水峰压制。
3)实验数据预处理，将实验所得到的谱图进行相位基线调整、去除溶剂峰、分段积分和归一化处理得到积分数据供后续建模分析，包括对PSYCHE序列所采集到的FID信号进行数据处理，包括傅里叶变换、谱图相位和基线的调整、定标，去除干扰峰、分段积分和归一化后得到磁共振谱图的积分数据；对tnnoesy序列所采集到的FID信号进行傅里叶变换。
进行所述的数据处理时，对PSYCHE原始FID数据进行数据重组，将FID拼接组合，再通过傅里叶变换得到纯化学位移谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化；tnnoesy的FID通过傅里叶变换得到常规tnnoesy谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化。
将从步骤2)中所得到的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱分别用MestReNova(Version 9.0)软件进行手动相位矫正、多点基线矫正、定标、谱峰对齐和分段积分等数据预处理操作。即，将获得的PSYCHE纯化学位移谱用MestReNova软件(Version 9.0)对谱图进行手动相位矫正、多点基线矫正等数据预处理操作，以tnnoesy谱中的TSP峰定标(δ0)。
在实验中，由于所采用的脉冲序列含有压水模块，仪器状态、采样参数设置、磁场不稳定等因素均可能导致压水时水峰部分发生畸变，即谱图中的水峰部分(δ4.75-4.90)会变得不规则，因此要将这部分去除以免影响后续分析。对剩余部分区域(δ0.50-9.0)进行等间隔积分，其中积分间隔为0.01ppm。之后对每一张谱图所得到的积分数据进行归一化处理，整理得到所有经过归一化处理的积分数据，归一化后的积分数据转存为ASCⅡ格式，并将其转存入excel表格供后续统计建模分析。
4)实验结果处理分析，将积分数据导入SIMCA-P+软件中进行主成分分析和正交偏最小二乘法分析，找出仙都乡茶叶和祥华乡茶叶之间差异化合物。
4.1)一维氢谱比较
如图2所示，从常规谱中可以看出，谱峰在δ3.0-4.5之间较为拥挤和重叠。相比较纯化学位移谱和常规谱，可以明显看出PSYCHE纯化学位移谱对于谱图的简化，例如蔗糖在δ3.40，δ3.64等处的多重峰都去偶成为了单峰，茶氨酸在δ1.12和δ3.22处的多重峰也去偶成为了单峰。去偶后的纯化学位移谱得以简化，显著地提高了分辨率。受限于纯化学位移谱方法较低的信噪比，一些强度较弱的谱峰无法获得，而较高的谱峰都可以在PSYCHE纯化学位移谱中得到归属。经过谱峰归属得到所含有的组分及其对应于常规谱和纯化学位移谱中的谱峰化学位移值如表1所示。但由于代谢物成分及其谱峰较多，在图2中，不管是去偶前还是去偶后，从肉眼上都无法直接观测到两种茶叶样品的差异。
表1：谱峰归属表
峰型：s:singlet，单峰；d:doublet，双峰；t:triplet，三重峰；dd:doublet ofdoublets，双重双重峰；m:multriplet，多重峰。
4.2)将之前所获得的纯化学位移谱归一化积分数据导入SIMCA-P+软件中进行变量统计分析，主要采用主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonapartial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。
将步骤3)中所得ASCⅡ积分数据导入SIMCA-P+软件，使用中值标准化Ctr方法进行数据预处理，之后进行主成分分析，获得各组的聚类信息，仙都乡茶叶和祥华乡茶叶都能比较好的聚集，即组间差异大同时组内差异小。为了进一步获取到原始输入变量中相关程度最大的成分，以原始数据作为X变量，组别作为响应变量Y，进行正交偏最小二乘法分析，去除原始数据X变量中与因变量Y无关的信息，能够得到较好的分类判别效果。
即，在分析之前需要对数据进行标准化，常见的标准化方法有中值标准化(meancenter scaling，Ctr)、自适应规格化(unit variance scaling，UV)和帕莱托标度化(paretoscaling，Par)，对于不同的数据模型需要采用不同的标准化方法，判断模型质量的参数有R2X、R2Y和Q2，其中，R2X和R2Y分别表示模型对于X、Y矩阵的解释能力，Q2则表示模型的预测能力。R2和Q2越接近1表明模型越稳定可靠。本例通过比较后选择使用中值标准化方法进行分析。
如图3所示，模型的R2和Q2分别为0.915和0.635，说明模型可靠，图中第1组为祥华茶叶，在图中以黑色圆形点呈现，第2组为仙都茶叶，以方形点呈现。两组组内聚集、组间区分，代表组内差异较小，组间差异较大。
为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的组成成分，对模型继续进行OPLS-DA分析，获得模型得分图，如图4所示。同时，将OPLS数据用MALTLAB软件进行处理后画出分析模型的负载图(loading plot)，如图5所示。负载图可以用来区分模型中两种不同产地茶叶中的代谢差异物。在负载图中，X轴代表化学位移值，Y轴代表相关系数值，颜色的深浅代表此物质对于区分两组差异的贡献程度，颜色越深代表其对组间差异影响越大，而强度代表相对含量，越偏离X轴的物质代表其在对应的组别中含量越高。在本实施例中，偏离X轴向上表明其在仙都乡茶叶中含量较高，相反，偏离X轴向下则表明其在祥华乡茶叶中含量较高。
通过负载图和OPLS分析得到的相关系数可以得到对组间差异即两组茶叶样品之间差异影响最大的积分区间，对应于谱图上即为相应化学位移值所对应的谱峰，进行谱峰归属确定差异代谢物。由图5可以得出结论：对两种产地茶叶之间差异影响最大的物质，即引起差异代谢物主要为：茶氨酸、咖啡因、没食子酸等物质。具体为：在仙都茶叶中茶氨酸、咖啡因、丙氨酸含量较高而在祥华茶叶中没食子酸含量较高。这些差异可能与茶叶种植中阳光、降雨和温度这些因素有关。
上述实施例仅是用来说明本发明，而并非用作对本发明的限定。只要是依据本发明的技术实质，对上述实施例进行变化、变型等都将落在本发明的权利要求的范围内。

Claims (9)

1.一种通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤如下：
1)制备不同产地的茶叶样品；
2)在核磁共振波谱仪上导入预先编译好的纯化学位移NMR谱脉冲序列；设置脉冲序列参数和采样参数，进行数据采集；对采集的数据进行相关的数据处理，得到所有样品的纯化学位移谱图；
3)通过相应的实验数据预处理获得纯化学位移谱图的分段积分数据；
4)将分段积分数据导入到统计分析软件中，通过主成分分析和正交偏最小二乘法分析判断两组组间和/或组内差异大小；
5)分析导致组间差异的化合物，判断不同产地的茶叶之间的化合物差异。
2.根据权利要求1所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤2)中，纯化学位移NMR谱脉冲序列包括PSYCHE序列，常规谱脉冲序列为tnnoesy序列；调用常规一维氢谱序列采集待测样品的一维氢谱，获得其信号峰分布区域及谱线线宽，为谱宽参数设置提供参考；再经过数据采集，得到待测样品的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱。
3.根据权利要求2所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，常规一维氢谱序列由一个非选择性射频脉冲和采样期构成，非选择性射频脉冲作用后进行信号采样。
4.根据权利要求2所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤3)中，对PSYCHE序列所采集到的FID信号进行数据处理，包括傅里叶变换、谱图相位和基线的调整、定标，去除干扰峰、分段积分和归一化后得到磁共振谱图的积分数据；对tnnoesy序列所采集到的FID信号进行傅里叶变换。
5.根据权利要求4所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤3)中，进行所述的数据处理时，对PSYCHE原始FID数据进行数据重组，将FID拼接组合，再通过傅里叶变换得到纯化学位移谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化；
tnnoesy的FID通过傅里叶变换得到常规tnnoesy谱；然后进行谱图相位、基线的调整、去除溶剂峰和谱峰对齐的操作，再通过对谱图的分段积分获得积分数据，并对积分数据进行归一化。
6.根据权利要求5所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤3)中，所得到的PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱分别用MestReNova软件进行数据预处理操作，包括手动相位矫正、多点基线矫正、定标、谱峰对齐和分段积分。
7.根据权利要求6所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，去除PSYCHE纯化学位移谱和常规tnnoesy谱中的水峰部分，对剩余部分区域进行等间隔积分。
8.根据权利要求1所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤4)中，利用统计分析软件SIMCA-P+来完成主成分分析和正交偏最小二乘法分析，获取不同产地的茶叶之间的聚类特征以及引起差异代谢物。
9.根据权利要求1所述的通过纯化学位移NMR谱鉴别茶叶产地差异的方法，其特征在于，步骤1)中，茶叶的溶液样品制备步骤为：将茶叶研磨成粉末，进行水浴加热；取上层清液放入离心机进行离心，再取上层清夜加入缓冲液，混合后移入核磁管密封。
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