CN108926565A - 五羟色胺受体亚型6小分子激活剂及拮抗剂在防治阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents

五羟色胺受体亚型6小分子激活剂及拮抗剂在防治阿尔茨海默症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生命科学研究领域，具体涉及五羟色胺受体亚型6的拮抗剂在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的用途。本发明首次通过elisa实验证明靶向五羟色胺受体亚型6的激动剂及拮抗剂都可以在人的神经细胞系上降低淀粉样蛋白Aβ产生，由于在病人脑脊液中，Aβ的浓度变化早于tau蛋白水平的改变，淀粉样蛋白沉积也早于临床症状的出现，考虑到从Aβ小肽聚集到斑块形成是Aβ浓度依赖的，找到降低Aβ浓度的方法对于治疗而言就显得非常重要。因此，靶向五羟色胺受体亚型6的激活剂及拮抗剂降低Aβ产生及相关机制的揭示可为阿尔茨海默症的治疗及进一步的药物研发提供临床实验的指导意义。

Description

五羟色胺受体亚型6小分子激活剂及拮抗剂在防治阿尔茨海 默症中的应用
技术领域
本发明属于生命科学研究领域，具体涉及五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂在制备淀粉样蛋白(Aβ)抑制剂中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又叫老年性痴呆，是一种中枢神经***变性病，起病隐袭，病程呈缓慢进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。根据在人群中起源情况的不同，AD可被分为散发型和家族型两类，其中家族遗传型病例约占5％，对这类病例的研究显示APP、PSEN1和PSEN2基因上的突变与AD的发病直接相关，其他绝大部分散发病例的致病机理尚不清楚，依据病情发展可分为四个阶段，第一个阶段往往错误地归因于老化或压力，一般距离确切的病理诊断有长达八年的时间，主要表现为轻度认知困难并伴随有短期记忆丧失，会影响到较复杂的日常生活活动。早期阿尔茨海默氏症表现为忘记家人或朋友的名字，通常这些改变只能由亲密的朋友或亲戚发现。中期阿尔茨海默氏症对记住最近了解到的信息出现了更大的困难，并伴随睡眠混乱问题经常出现迷路等情况。晚期阿尔茨海默氏症出现思考能力差，重复同样的对话并伴有焦虑，渐渐地身体机能丧失，生活不能自理，最终导致死亡。据世界卫生组织(WHO)和ADI(Alzheimer Disease International)2015年的统计，全球9亿老龄人口中约有4500万罹患AD，这一数字预计20年后增加一倍，在2050年达到1.3亿，目前全球老年痴呆成本负担约6040亿美元，即使在发达国家，AD也是经济上最昂贵的疾病之一，因此，揭示AD的病理机制并筛选出新型低毒高效药物的研究迫在眉睫。
AD病人的特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经纤维缠结，以及神经元丢失伴随的胶质细胞增生等。关于AD的发病机制，有一系列复杂的遗传及环境因素参与其中至今仍无定论，众说纷纭。而目前较为广泛接受的是β淀粉样蛋白假说。该假说建立在早发性老年痴呆(early-onset AD)分子水平的研究基础上，提出APP、PS1或PS2基因突变会导致细胞内Aβ蛋白的异常增加，Aβ多聚化形成斑块，Aβ寡聚物通过一系列级联反应最终使得神经元轴突间隙受到损伤，在这个过程中小胶质细胞和星型胶质细胞会被激活。受损的神经元细胞会改变离子通透性(钙离子水平在细胞质中大幅度提高)同时会引起氧化性损伤，改变激酶磷酸酶活性形成神经纤维丝缠结，最终导致认知障碍。因此，干扰Aβ形成和防止其产生沉积可能是最有希望的治疗AD方法，也是解释散发性AD病因的主要理论基础。
鉴于复杂的致病机理目前对于阿尔茨海默症的治疗策略及药物分为以下几个方面：
1)胆碱能递质相关的治疗途径，胆碱酯酶抑制剂(AChE I)为目前最常用的胆碱能递质相关药物，包括Aricept(donepezil，多奈哌齐)，Exelon(rivastigmine，利斯的敏)和Razadyne(galantamine，加兰他敏)它们能选择性增强脑皮质和海马等部位乙酰胆碱的作用，明显改善患者的认知功能、日常生活能力，缓解病情严重程度。
2)脑代谢改善。
3)抗炎治疗，非甾体抗炎药的抗AD作用可能通过抑制小胶质细胞的异常增生而影响AD的进程。
4)抗氧化抗自由基，如褪黑激素、红景天提取物、姜黄素等具有对抗细胞氧化性损伤、降低细胞内钙离子浓度及减少神经细胞死亡的作用，通过减少生物体内自由基的水平，保护细胞和组织免受自由基攻击，避免氧化应激损伤的发生抗淀粉样蛋白通过阻止Aβ的合成和沉淀，可以改善神经元的退变及凋亡。
5)干扰β-淀粉蛋白沉积药等，由于目前老年痴呆症病因机制还未完全阐明，大部分抗老年痴呆的药物只是用来改善症状和延缓病情发展。
鉴于此，进一步揭示特异性调节Aβ产生的新型分子机制，成为目前开展抗AD类药物研发和疾病治疗亟待解决的关键问题。
G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)是已知数目最多的细胞膜表面受体家族，约有1000个成员。其特点是具有7次跨膜结构，其N端在细胞外，C端在细胞内。GPCR能够感受细胞外的信号刺激，传导至细胞内，调控下游信号通路，进而对于诸多重要生理、病理过程发挥调节功能。与激动剂结合后GPCR即被激活，发生构象改变，激活G蛋白，改变细胞内第二信使(例如cAMP、Ca2+等)的水平，进而调节效应蛋白活性与功能；与此同时，G-蛋白偶联受体激酶会将受体磷酸化，募集β-arrestin至受体，引起受体从细胞膜表面转运至细胞内，从而终止受体信号转导，一些GPCR也能够参与调节Aβ引起的神经元突触功能变化，发挥神经保护或者神经毒性作用，进而影响AD发病进程。五羟色胺是五羟色胺受体的内源配体。五羟色胺受体(serotonin receptors，HTRs)主要分为7个亚型，除HTR3为配体门控的离子通道外，剩下的6种亚型均为七次跨膜的A类G蛋白偶联受体。HTR6与其他亚型的HTR序列同源性较低，几乎只在中枢神经***中表达。与乙酰胆碱能神经元相比，HTR6在GABA能神经元和谷氨酰胺能神经元中相对表达较高。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂在制备淀粉样蛋白(Aβ)抑制剂中的用途。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂在制备淀粉样蛋白(Aβ)抑制剂中的用途。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂能够抑制淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低淀粉样蛋白(Aβ)水平。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂能够抑制神经细胞中淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低神经细胞中淀粉样蛋白(Aβ)水平。
如本发明一些实施方式中所列举的，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂能够抑制SK-N-SH细胞中淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低SK-N-SH细胞中淀粉样蛋白(Aβ)水平。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂与五羟色胺受体亚型6(HTR6)只有较强的亲和力，而无内在活性，不产生效应，但能阻断激动药与五羟色胺受体亚型6(HTR6)结合，因而对抗或取消激动药的作用，分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的拮抗剂选自SB258585hydrochloride、SB271046 hydrochloride、Intepirdine RVT-101、Idalopirdine。
所述SB258585hydrochloride的结构式如式I所示：
分子式为C18H22IN3O3S.HCl，分子量为523.82，CAS No:1216468-02-8，
化学名称为：
4-Iodo-N-[4-methoxy-3-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]benzenesulfonamide hydrochloride。
所述SB271046hydrochloride的结构式如式II所示：
分子式为C20H22ClN3O3S2.HCl，分子量为488.45，CAS No:209481-24-3，
化学名称为：
5-Chloro-N-[4-methoxy-3-(1-piperazinyl)phenyl]-3-methyl-benzo[b]thiophen-2-sulfonamide hydrochloride。
所述Intepirdine RVT-101的结构式如式III所示：
分子式为C19H19N3O2S，分子量为353.44，CAS No:607742-69-8，
化学名称为：3-Phenylsulfonyl-8-(piperazin-1-yl)quinoline。
所述Idalopirdine的结构式如式IV所示，
分子式为：C20H19F5N2O，分子量为398.141754D，ChemSpider ID：19878969。
优选地，所述用途还包括以下特征的任一项或多项：
(1)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(2)SB258585hydrochloride通过降低BACE1分泌酶活性来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(3)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6介导的经典的GPCR信号通路来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(4)SB258585hydrochloride通过干扰五羟色胺受体亚型6与CDK5的相互作用来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(5)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6介导的β-arrestin2信号通路来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。
本发明的第二方面，提供SB258585hydrochloride在制备BACE1分泌酶抑制剂中的用途。
优选地，所述SB258585hydrochloride能够降低BACE1分泌酶剪切活性。
本发明的第三方面，提供SB258585hydrochloride在制备五羟色胺受体亚型6的组成型活性抑制剂中的用途。
优选地，所述SB258585hydrochloride能够降低五羟色胺受体亚型6的组成型活性介导的cAMP水平。
本发明的第四方面，提供五羟色胺受体亚型6(HTR6)的激活剂在制备淀粉样蛋白(Aβ)抑制剂中的用途。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的激活剂能够抑制淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低淀粉样蛋白(Aβ)水平。
优选地，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的激活剂能够抑制神经细胞中淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低神经细胞中淀粉样蛋白(Aβ)水平。
如本发明一些实施方式中所列举的，所述五羟色胺受体亚型6(HTR6)的激活剂能够抑制SK-N-SH细胞中淀粉样蛋白(Aβ)产生或降低SK-N-SH细胞中淀粉样蛋白(Aβ)水平。
优选地，所述激活剂选自ST1936oxalate。
所述ST1936oxalate的结构式如式V所示：
分子式为：C13H17ClN2.C2H2O4，分子量为326.78，CAS No:1210-81-7，
化学名称为：5-Chloro-3-[2-(dimethylamino)ethyl]-2-methylindoleoxalate。。
本发明的第五方面，提供一种抑制淀粉样蛋白Aβ的方法，包括步骤：将五羟色胺受体亚型6的拮抗剂或激活剂施用于对象。
所述对象可以是神经细胞。例如：SK-N-SH细胞。
所述五羟色胺受体亚型6的拮抗剂选自SB258585hydrochloride、SB271046hydrochloride、Intepirdine RVT-101、Idalopirdine。
所述所述五羟色胺受体亚型6的激活剂选自ST1936oxalate。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次通过elisa实验证明靶向五羟色胺受体亚型6的激动剂及拮抗剂都可以在人的神经细胞系上降低淀粉样蛋白Aβ产生，由于在病人脑脊液中，Aβ的浓度变化早于tau蛋白水平的改变，淀粉样蛋白沉积也早于临床症状的出现，考虑到从Aβ小肽聚集到斑块形成是Aβ浓度依赖的，找到降低Aβ浓度的方法对于治疗而言就显得非常重要。因此，靶向五羟色胺受体亚型6的激活剂及拮抗剂降低Aβ产生及相关机制的揭示可为阿尔茨海默症的治疗及进一步的药物研发提供临床实验的指导意义。
附图说明
图1：SK-N-SH细胞五羟色胺受体不同亚型表达水平。
图2：SB258585hydrochloride能够降低SK-N-SH内源Aβ产生，SK-N-SH细胞给予化合物处理24小时后，收集培液上清，ELISA检测细胞Aβ产生水平，*P<0.05,***P<0.005。
图3：SB258585hydrochloride降低Aβ产生的作用依赖于五羟色胺受体亚型，左图：SK-N-SH慢病毒感染细胞24小时后更换新鲜的培养基，48小时后分盘到48孔板，72小时后给予细胞10μM化合物处理，96小时后收集细胞培养上清，ELISA检测Aβ产生水平，右图：荧光定量pcr检测敲低效率，**P<0.01，与溶剂对照组相比；***P<0.005，感染靶向HTR6shRNA病毒并给予配体刺激组与感染Scrambled shRNA并给予配体刺激组相比。
图4：SB258585hydrochloride间接依赖于降低BACE1分泌酶剪切活性，*P<0.05。
图5：SB258585hydrochloride降低A部分依赖于五羟色胺受体亚型6介导的经典的GPCR信号通路，病毒感染pGlo-20F及HTR6的细胞铺于白色96孔板，转染24小时后更换培液为含有2％GloSensor Reagent的培液，37℃孵育1.5小时，并通过Berthold 941读取Luminescence本底读数；随后，加入一定浓度的化合物处理15分钟，再次通过Berthold941读取Luminescence读数，敲低Gα也能一定程度的抑制了拮抗剂介导的降低Aβ产生的作用*P<0.05，***P<0.005。
图6：SB258585hydrochloride降低部分依赖于五羟色胺6型受体与CDK5的相互作用，1)左上图：SK-N-SH慢病毒感染细胞24小时后换新鲜的培养基，48小时后分盘到48孔板，72小时后给予细胞10μM化合物处理，96小时后收集细胞培养上清，ELISA检测Aβ产生水平；2)右上图：免疫印迹法检测敲低效率；3)下图：加入inhibitor(Roscovitine(Seliciclib,CYC202，选择性CDK抑制剂)预处理45分钟后加入化合物处理，24小时后收集细胞培养上清，ELISA检测Aβ产生水平，**P<0.01，与溶剂对照组相比；**P<0.005，感染靶向CDK5shRNA病毒并给予配体刺激组与感染Scrambled shRNA并给予配体刺激组相比及加了inhibitor预处理并给予配体刺激组与不加inhibitor预处理并给予配体刺激组相比。
图7：SB258585hydrochloride降低Aβ部分依赖于五羟色胺受体亚型6介导的β-arrestin2信号通路，1)左图：SK-N-SH慢病毒感染细胞24小时后换新鲜的培养基，48小时后分盘到48孔板，72小时后给予细胞10μM化合物处理，96小时后收集细胞培养上清，ELISA检测Aβ产生水平；2)右图：免疫印迹法检测敲低效率，**P<0.01，与溶剂对照组相比；**P<0.005，感染靶向β-arrestin2shRNA病毒并给予配体刺激组与转染Scrambled shRNA并给予配体刺激组相比。
图8：其他五羟色胺受体亚型6拮抗剂及激活剂也可以降低Aβ产生，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
一、细胞培养和质粒构建
细胞均培养于含有5％二氧化碳的37℃细胞培养箱，SK-N-SH细胞培养于含10％胎牛血清的MEM.F12培养基；HEK293T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。人源的带有HA标签的五羟色胺受体亚型6质粒由药物所谢欣老师组提供，用亚克隆方法制备了五羟色胺受体亚型6及F20慢病毒质粒。所有shRNA克隆的构建参照了addgene网页上的方法(Addgene,http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/)
二、病毒包转及感染
HEK293T以7.5×106的细胞密度铺在10cm的培养皿中.第二天,用磷酸钙的方法转染20μg的目标质粒,16μg的pSPAX2包装质粒,6μg的pMD2G包装质粒，12小时后换新鲜的培养基。之后分别在48小时和72小时收集病毒上清，1000×g离心5分钟,用0.45-μm滤头过滤后在4℃条件下以27,000×g的超高速离心2小时。沉淀重悬在200μl的PBS中,溶解后分装在-80℃.用流式的方法测定病毒滴度。对于敲低实验,SK-N-SH细胞先以合适的密度铺在10cm培养皿中或24孔板中，待细胞贴壁16-24小时后细胞密度约在50-70％进行病毒感染，24小时后换液，敲低效率在病毒感染的72-96小时内通过荧光定量pcr检测。
三、酶联免疫吸附实验检测Aβ/sAPPα/sAPPβ
铺于48孔板的SK-N-SH细胞给予化合物处理24小时后收集培液上清，以夹心法酶联免疫吸附实验定量检测培液上清的A/sAPPα/sAPPβ水平。
四、细胞存活检测
铺于48孔板的SK-N-SH细胞给予化合物处理24小时后用PBS漂洗2次后加入检测试剂CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay检测细胞活力。
五、GloSensorTM cAMP biosensor检测cAMP水平
病毒感染pGlo-20F及HTR6的细胞铺于白色96孔板，转染24小时后更换培液为含有2％GloSensor Reagent的培液，37℃孵育1.5小时，并通过Berthold 941读取Luminescence本底读数；随后，加入一定浓度的化合物处理15分钟，再次通过Berthold 941读取Luminescence荧光值。
六、基于荧光底物的分泌酶体外活性实验
细胞用裂解缓冲液(5mMTris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA和5mMEGTA)裂解，用29G胰岛素针反复抽吸以破碎细胞。800g于4℃离心10分钟，以去除大的细胞碎片及细胞核，取上清。用BCA法测定上清总蛋白浓度，取适量总蛋白经25,000g于4℃离心1小时，弃上清。膜沉淀用反应缓冲液重悬后，加入对应荧光底物，于37℃金属浴中反应(对于α-分泌酶，10mMTris-HCl，pH 7.5，反应1小时；对于BACE，50mM sodium acetate，pH 4.5，反应30分钟；对于γ-分泌酶，50mMTris-HCl，pH 6.8，2mM EDTA，0.25％CHAPSO，反应2小时)。反应产物用M5spectrum测量荧光值，设定相应激发光波长λex和发射光波长λem。对于α-分泌酶，λex＝325nm，λem＝393nm；对于BACE，λex＝430nm，λem＝520nm；对于γ-分泌酶，λex＝355nm，λem＝440nm。
七、数据统计分析
所有实验至少重复3次。实验数据表示为平均值±标准误差，采用GraphPadPrism6.01软件分析。对于两组实验数据的比较，采用Unpaired Student’s t-test进行分析；多组实验数据采用One-way ANOVA方法Bonfferoni’s多组检验法分析数据；p<0.05时认为组间有显著性差异。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1QPCR检测目标细胞系中五羟色胺受体本底表达水平
SK-N-SH是一株神经母细胞瘤细胞，具有组成型低水平Aβ产生，为了确认是否适合在这个细胞系进行相关研究，首先我们通过QPCR的方法对细胞内五羟色胺受体本底表达水平进行了检测。如图1所示，结果发现在SK-N-SH细胞系上五羟色胺受体亚型6具有较高水平的表达。
实施例2五羟色胺受体亚型6拮抗剂能够呈剂量依赖性降低Aβ产生
利用Aβ产生实验，我们发现如图2所示，靶向五羟色胺受体亚型6的拮抗剂SB258585hydrochloride呈剂量依赖性降低Aβ产生。
实施例3SB258585hydrochloride降低Aβ产生的作用依赖于五羟色胺受体亚型6
为了研究是否SB258585hydrochloride降低Aβ产生的作用是否依赖于五羟色胺受体亚型6，我们通过慢病毒的方法进行了shRNA介导的五羟色胺受体亚型6表达敲低实验。并表达了具有随机核苷酸序列的Scrambled作为阴性对照以荧光实时定量PCR的方法检测了shRNA介导的五羟色胺受体亚型6表达敲低效率。如图3所示，荧光实时定量PCR的实验结果表明，病毒转染靶向五羟色胺受体亚型6型shRNA后能够引起其mRNA水平减少60％左右。与对照组相比，转染靶向五羟色胺受体HTR6序列的shRNA后，对照组细胞中，拮抗剂刺激仍能够降低Aβ产生，而五羟色胺受体HTR6被敲低后则显著抑制了拮抗剂降低Aβ产生的作用。
实施例4SB258585hydrochloride间接依赖于降低BACE1分泌酶剪切活性
α-分泌酶、BACE1或γ-分泌酶的活性与细胞内Aβ产生有关。为了检测SB258585hydrochloride降低Aβ的作用是否是通过直接作用于分泌酶活性的，我们通过荧光底物的方法首先在体外将化合物与提取的细胞膜进行共孵育，如图4所示，发现并没有影响到3个分泌酶的活性，说明SB258585hydrochloride降低Aβ的作用并不是直接通过影响分泌酶介导的，之后我们尝试了加药24小时再提膜检测分泌酶活性，发现BACE1的酶活有显著的下调，说明这种作用是通过间接影响BACE1的酶活导致的。
实施例5SB258585hydrochloride降低Aβ部分依赖于五羟色胺受体亚型6介导的经典的GPCR信号通路
基于已有的报道证实五羟色胺受体亚型6具有本底情况下的组成型活性，那么SB258585hydrochloride作为它的反向激动剂是否会降低它本底水平的cAMP表达而介导Aβ的降低，通过将病毒感染pGlo-20F及HTR6的72小时后的细胞铺于白色96孔板，24小时后更换培液为含有2％GloSensor Reagent的培液，37℃孵育1.5小时，而后加入浓度梯度的拮抗剂，孵育15分钟后再次检测cAMP，发现SB258585hydrochloride确实能够引起细胞受体导致的组成型活性介导的cAMP水平降低。随后我们通过敲低Gα也能一定程度的抑制了拮抗剂介导的降低Aβ产生的作用，说明SB258585hydrochloride降低Aβ部分依赖于五羟色胺受体亚型6介导的经典的GPCR信号通路。
实施例6SB258585hydrochloride降低Aβ部分依赖于五羟色胺受体亚型6与CDK5的相互作用
已有的研究表明SB258585hydrochloride可以干扰五羟色胺受体亚型6与CDK5的相互作用，随后我们用敲低CDK5，以WB检验了敲低效率，与对照组相比，靶向人源的shRNA分别能够显著敲低表达约70％，随后CDK5抑制剂的方法发现也能一定程度的抑制了配体介导的降低Aβ产生的作用，说明SB258585hydrochloride降低部分依赖于五羟色胺6型受体与CDK5的相互作用。
实施例7SB258585hydrochloride降低Aβ部分依赖于五羟色胺受体亚型6介导的β-arrestin2信号通路
接下来我们检测了是否shRNA介导的β-arrestin 2敲低能够影响SB258585
hydrochloride降低Aβ产生的作用。首先我们在SK-N-SH细胞中感染染靶向人源ARRB2的shRNA后，以WB检验了敲低效率。与对照组相比，靶向人源的shRNA分别能够显著敲低表达约60％。在此基础上，我们给拮抗剂处理，检测了细胞Aβ产生。结果表明，敲低ARRB2能够抑制SB258585hydrochloride降低Aβ产生的作用。
实施例8其他五羟色胺受体亚型6激活剂及拮抗剂也可以降低Aβ产生
利用Aβ产生实验，我们又检测了其他几个五羟色胺受体亚型6拮抗剂和1个五羟色胺受体亚型6激活剂(ST1936oxalate)对Aβ产生的作用，结果发现无论是激活剂还是拮抗剂都能够呈剂量依赖性降低Aβ产生。
讨论：
本发明实验证明五羟色胺受体亚型6的激活剂和拮抗剂都能在人的神经细胞系上降低Aβ产生。在用到几个激活剂和拮抗剂中，激活剂ST1936和拮抗剂SB25858hydrochloride未进入临床研究，SB271046hydrochloride由于过血脑屏障的问题于2003年终止于临床研究，idalopirdine由于未达到实验预期终止于去年的临床3期，而另一药物Intepirdine则是近两年屡创融资神话的Axovant公司从GSK买过来的，前景如何还不能轻易下判断。5-HT6拮抗剂开发时间接近20年，适应症几乎都是AD和帕金森等神经退行性疾病，而为什么有的拮抗剂展现的临床效果较好，有的不得不终止在某个临床时期，这其中的原因仍是错综复杂的，而我们针对SB258585hydrochloride靶向五羟色胺6型受体降低Aβ产生的muliti-pathway的机制也给这一问题一些启示，即同样都是拮抗剂是否会由于启动的下游机制不同而导致的效果不同，因此，靶向五羟色胺受体亚型6的激活剂及拮抗剂降低Aβ产生及相关机制的揭示可为阿尔茨海默症的治疗及进一步的药物研发提供临床实验的指导意义。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (11)

1.五羟色胺受体亚型6的拮抗剂在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述五羟色胺受体亚型6的拮抗剂能够抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。
3.根据权要求1所述的用途，其特征在于，所述五羟色胺受体亚型6的拮抗剂选自SB258585hydrochloride、SB271046hydrochloride、Intepirdine RVT-101、Idalopirdine。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括以下特征的任一项或多项：
(1)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(2)SB258585hydrochloride通过降低BACE1分泌酶活性来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(3)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6介导的经典的GPCR信号通路来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(4)SB258585hydrochloride通过干扰五羟色胺受体亚型6与CDK5的相互作用来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平；
(5)SB258585hydrochloride通过作用于五羟色胺受体亚型6介导的β-arrestin2信号通路来抑制淀粉样蛋白Aβ产生或降低淀粉样蛋白Aβ水平。
5.SB258585hydrochloride在制备BACE1分泌酶抑制剂中的用途。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述SB258585hydrochloride能够降低BACE1分泌酶剪切活性。
7.SB258585hydrochloride在制备五羟色胺受体亚型6的组成型活性抑制剂中的用途。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述SB258585hydrochloride能够降低五羟色胺受体亚型6的组成型活性介导的cAMP水平。
9.五羟色胺受体亚型6的激活剂在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂中的用途。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述激活剂选自ST1936oxalate。
11.一种抑制淀粉样蛋白Aβ的方法，包括步骤：将五羟色胺受体亚型6的拮抗剂或激活剂施用于对象。
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