CN108918857A

CN108918857A - 纳米金笼复合物及其在制备检测人尿液或血液中的cMyBP-C的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN108918857A
Application number: CN201810449820.7A
Authority: CN
Inventors: 张寄南; 张雷
Original assignee: NANJING BOTIAN KEZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: NANJING BOTIAN KEZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN108918857B

Abstract

本发明公开一种纳米金笼复合物及其制备方法和在制备检测人尿液或血液中的cMyBP‑C试剂盒中的应用。纳米金笼复合物与一对抗人心肌球蛋白C单抗BT09和BT10共价结合，形成快速检测人尿液或血液中的cMyBP‑C的试剂盒。本发明使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP‑C检测敏感性和特异性极高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。应用特定条件下（形状、尺寸）正方体中空纳米晶体与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，较胶体金纳米球POCT产品增强检测信号达5000~10000倍。结果易观察，灵敏度达到100fg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。

Description

纳米金笼复合物及其在制备检测人尿液或血液中的cMyBP-C 的试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种纳米金笼复合物及其制备方法和应用，尤其涉及该纳米金笼复合物在制备血和/或尿液心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条方面的应用。

背景技术

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和/或损伤(myocardialinjury,MCI) 是一类高发病率的临床重大疾病。欧美、中国乃至全球人群中AMI、MCI的死亡率、住院和就诊花费均居前列。心肌坏死生物标志物心肌肌钙蛋白(cTn)T/I是目前诊断AMI、危险度分层的首选标志物(Nat Rev Cardiol.2012Nov；9(11):620-633)。但值得注意的是，血液cTn浓度是在心肌损伤后6-8小时才开始增高，16-18小时左右达峰值，因此胸痛发作时间＜6h的AMI患者，其cTn升高并不明显，缺乏诊断敏感性。近年新一代高敏感方法检测cTn(hs-cTn)相继问世，引起关注，可在胸痛＜3h检测增高，但因新一代高敏感方法可在大约99％的表面健康人群中也可观察到，增高了假阳性结果(Swiss Med Wkly. 2011May10；141:w13202.Intern Emerg Med.2017Mar；12(2):147-155.中华内科杂志2015, 54(10):899-904)。其他如长跑、肾脏疾病等非心脏因素也可以引起cTn增高。目前其他心肌损伤生物标志物如肌红蛋白、CK-MB等缺乏敏感性或者特异性。在此背景下，寻找特异性更高、出现时间更早的AMI标志物具有十分重要的临床意义。

心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)是心脏组织含量最丰的蛋白质之一(位列心脏2300个蛋白质的第19位)，其总量分别是心脏cTnI及cTnT 2倍多(cTnI及cTnT分别位列第118位及92位，Mol Cell Proteomics.2009Dec；8(12):2687-99)。cMyBP-C的分子量约140KD，位于心肌粗肌丝肌球蛋白头部的横桥处，是调节心肌收缩的关键蛋白质。 cMyBP-C蛋白质N端与其他横纹肌肌球蛋白结合蛋白C不同，是心脏组织特异表达。急性心肌损伤、AMI状态下，心肌受损，其N端约40KD片断释放入血，从而使得血液 cMyBP-C浓度升高，cMyBP-C成为自cTn以来最有前途的心肌损伤生物标志物。

发明内容

发明目的：为达到从AMI和/或急性心肌损伤病人血液和/尿液中快速检测cMyBP-C的目的，近年即时检验(point-of-care testing,POCT)快速检测心脏标志物发展迅速，包括胶体金技术，采用免疫层析双抗体夹心法原理，利用胶体金可以牢固吸附在抗体的表面而不影响抗体的活性，当标记抗体与抗原反应聚集到一定浓度时，可以直接呈现颜色，可直接定性进行标志物浓度判断，结合专用阅读仪可达到半定量结果。整个检测过程可控制在15分钟内。目前尚无cMyBP-C快速检测试剂盒的专利或产品。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种纳米金笼复合物，所述纳米金笼复合物是通过中空正方体金纳米粒子与特定单链DNA以及显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09相连接而成的复合物。

其中，上述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4。

其中，上述纳米金笼标记物包含有显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09。

其中，上述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA 3'端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基。

其中，上述纳米金笼复合物的尺寸为10-16nm和40-60nm。

本发明内容还包括一种纳米金笼复合物的制备方法，包括以下步骤：

1)纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl₄溶液，在室温下用注射泵在HAuCl₄溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色离心去除上清，获得不同尺寸的中空正方体金纳米晶体，然后用去离子水重悬中空正方体金纳米晶体，离心除过多的Au³⁺离子，去离子水重悬沉淀，加入5～20mg/ml PVP单体及0.1％Tween得到纳米金笼溶液；

2)用0.1M K₂CO₃调节纳米金笼溶液pH8.5-9.0；将特定单链DNA与纳米金笼溶液联接反应6-8小时，加进PVP单体使其终浓度为0.2-1.0％，用2M NaCl，20mM phosphate 调节pH至7.4得到纳米金标记复合物；

3)纳米金笼复合物的制备：用K₂CO₃调节纳米金标记复合物至pH为7.4-9.0，于纳米金标记复合物中逐滴加入显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09得到纳米金笼复合物。

本发明内容还包括所述的纳米金笼复合物在检测人尿液或血液中的cMyBP-C中的应用。

本发明内容还包括一种心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条，所述检测试纸条上设有所述的纳米金笼复合物。

本发明内容还包括心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1)纳米金笼复合物的制备：按照上述的方法制备纳米金笼复合物；

2)纳米材料垫制备及喷垫：将纳米金笼复合物喷印在纳米材料垫上；

3)检测线制备：将单克隆抗体BT10划在醋酸纤维膜上，制成检测线；

4)质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体划在醋酸纤维膜上，制成质控线；

5)试纸条装配；

6)检测。

有益效果：本发明使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP-C检测，敏感性和特异性极高，特异性能到达95％以上，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。本发明使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP-C检测敏感性和特异性极高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。应用特定条件下(形状、尺寸)正方体中空纳米晶体与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，较胶体金纳米球POCT产品增强检测信号达5000～10000倍。结果易观察，灵敏度达到10Fg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于各种原因导致的急性心肌损伤的早期诊断、危险度分层及治疗效果评判。尤其适宜在广大基层医院推广和应用。

具体实施方式

本实验用到的材料：

检测线抗体为抗人cMyBP-C单克隆抗体BT10为捕捉抗体(金斯瑞生物科技购买、货号2G2F3)，质控线抗体为羊抗鼠IgG，鼠抗人cMyBP-C抗体BT09(金斯瑞生物科技购买、货号9B11C5)。

特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQID NO:4由本公司设计合成制得。

其他材料均自市场上购买。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：纳米金笼复合物的制备

1)纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl₄溶液，在室温下用注射泵在HAuCl₄溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色离心去除上清，获得不同尺寸的正方体中空纳米晶体，然后用去离子水重悬正方体中空纳米晶体，离心除过多的Au³⁺离子，去离子水重悬沉淀，加入5mg/ml PVP单体及0.1％Tween得到纳米金笼溶液；该正方体中空纳米晶体尺寸为16nm和42nm。

2)用0.1M K₂CO₃调节纳米金笼溶液pH8.5-9.0；将特定单链DNA与纳米金笼溶液联接反应6-8小时，加进PVP单体使其终浓度为0.2％，用2M NaCl，20mM phosphate调节pH至7.4得到纳米金标记复合物；

实施例2：纳米金笼复合物的制备

与实施例1基本相同，所不同的在于，步骤2)中PVP单体加入浓度为20mg/ml，步骤3)中的PVP单体使其终浓度为1.0％。

实施例3纳米金笼复合物的制备

与实施例1基本相同，所不同的在于，步骤2)中PVP单体加入浓度为12mg/ml，步骤3)中的PVP单体使其终浓度为0.6％。

实施例4用于尿液或血液检测的心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条的制备

1、纳米材料垫制备及喷垫：将实施例1～3制备的纳米金笼复合物喷印在纳米材料垫上；

2、检测线制备；取另1株抗人cMyBP-C单克隆抗体BT10(可与金标抗体BT09配对形成夹心)做检测线抗体，以缓冲液5-20％海藻糖，3-8％甲醇稀释为0.5-2.0mg/mL；用划膜仪将抗体划在醋酸纤维素膜上，浓度为1μL/cm形成检测线，真空干燥；

3、质控线制备：羊抗鼠IgG用缓冲液5-20％海藻糖，3-8％甲醇稀释为0.2-1.0mg/mL；用划膜仪将抗体划在醋酸纤维素膜上，浓度为0.5μL/cm形成质控线，真空干燥；

4、试纸条装配：将样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸水纸按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，在醋酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；切割粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存；

5、检测：将样品滴加入加样孔，10-20分钟时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失效，质控线处无显色条带。将cMyBPC标准品配制的15pg/ml、50pg/ml、 100pg/ml和200g/ml。cMyBP-C标准品样品滴加入样品孔，10min观察结果，检测结果： 15pg/ml的参考品5min内检测线位置出现微弱条带；50pg/ml的参考品10min内检测线位置出现条带；100ng/ml,200pg/ml的参考品10min内检测线位置出现明显条带； 500pg/ml出现极明显条带。上限为2000pg/ml。

以上试纸条是用于血液检测的试纸条.尿液检测试纸条的不同之处在于，在纳米材料垫中增加一层结合BT10专用于尿检的商用醋纤膜。

实施例5尿液检测

1、检测对象

首先在江苏南京地区就诊汉族人群中选取了确认为急性心肌梗死和急性心肌损伤的患者共500例的尿液样本，收集了对照为排除急性心梗和心肌损伤的健康者500例的尿液样本。

2、病例和对照样本入选标准

按照2007年、2012年全球中国急性心肌梗死定义标准住院确诊为急性心肌梗死的病人，进行心脏手术损伤心肌病人。

3、检测方法

将实施例4制备的心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条浸入新鲜的尿液样品中滴加入加样孔，15分钟时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失效，质控线处无显色条带。

4、检测结果

正常健康人尿液中的cMyBP-C浓度为0～100pg/ml，通过对500例患者尿液的检测和对正常健康人群的尿液的检测，急性心肌梗死的病人的尿液中的cMyBP-C浓度 5000～10000pg/ml，检测的准确度达到99％，特异性为96％。

实施例6血液检测

3、检测对象

首先在江苏南京地区就诊汉族人群中选取了确认为急性心肌梗死和急性心肌损伤的患者共500例的血液样本，收集了对照为排除急性心梗和心肌损伤的健康者500例的血液样本。

4、病例和对照样本入选标准

3、检测方法

将收集的血液样品滴加入试纸的加样孔中，15分钟时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失效，质控线处无显色条带。

4、检测结果

正常健康人血液中的cMyBP-C浓度为0～100pg/ml，通过对500例患者尿液的检测和对正常健康人群的尿液的检测，急性心肌梗死的病人的尿液中的cMyBP-C浓度 5000～10000pg/ml，检测的准确度达到99％，特异性为96％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京博天科智生物技术有限公司

<120> 纳米金笼复合物及其制备方法和在检测人尿液或血液中的cMyBP-C中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggctcagt cttagtttat tatatggatg atgtggtatt catttt 46

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttttcgagt ttagctagtc agctacgagt taattcctgc tt 42

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatgcgtat ttatgcggct ttttcgtact attt 34

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttatactt ttaggcttga tatagattat tttgaatgtt gatagttagt ggatgttt 58

Claims

1.一种纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼复合物是通过中空正方体金纳米粒子与特定单链DNA以及显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09相连接而成的复合物。

2.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼标记物包含有显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09。

4.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA 3'端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基。

5.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼复合物的尺寸为10-16 nm和40-60 nm。

6.权利要求1~5任一项所述的纳米金笼复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl₄溶液，在室温下用注射泵在HAuCl₄溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色后离心去除上清，获得不同尺寸的中空正方体金纳米晶体，然后用去离子水重悬中空正方体金纳米晶体，离心除过多的Au³⁺ 离子，去离子水重悬沉淀，加入5~20mg/ml的PVP单体及0.1% Tween得到纳米金笼溶液；

2）用0.1 M K₂CO₃调节纳米金笼溶液 pH8.5-9.0；将特定单链DNA与纳米金笼溶液联接反应6-8小时，加进PVP单体使其终浓度为0.2-1.0%，用2 M NaCl，20 mM phosphate调节pH至7.4得到纳米金标记复合物；

3）纳米金笼复合物的制备：用K₂CO₃调节纳米金标记复合物至pH为7.4-9.0，于纳米金标记复合物中逐滴加入显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09得到纳米金笼复合物。

7.权利要求1~5任一项所述的纳米金笼复合物在检测人尿液或血液中的cMyBP-C中的应用。

8.一种心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条上设有权利要求1~5任一项所述的纳米金笼复合物。

9.权利要求8所述的心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）纳米金笼复合物的制备：按照权利要求6所述的方法制备得到纳米金笼复合物；

2）纳米材料垫制备及喷垫：将纳米金笼复合物喷印在纳米材料垫上；

3）检测线制备：将单克隆抗体BT10划在醋酸纤维膜上，制成检测线；

4）质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体划在醋酸纤维膜上，制成质控线；

5）试纸条装配；

6）检测。