CN108913772B - 基于捕获测序的bMSI检测技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于捕获测序的bMSI检测技术。本发明涉及一种用于捕获来自肿瘤患者体液样品的微卫星的探针，所述探针包括以下一种或多种探针：a)在微卫星位点两侧分别设计的探针，所述探针覆盖微卫星位点两侧序列而不覆盖微卫星序列，b)在微卫星位点边界设计的探针，所述探针一部分完全或不完全覆盖微卫星位点，另一部分覆盖微卫星位点一侧的序列，c)跨越微卫星位点设计的探针，所述探针完全覆盖微卫星位点及其两侧的序列。通过本发明的探针能够只将含有微卫星序列的目标DNA片段捕获，改善检测肿瘤患者的微卫星不稳定的状态的灵敏度和特异性，从而有助于促进肿瘤的诊断和治疗。

Description

基于捕获测序的bMSI检测技术
技术领域
本发明涉及肿瘤的检测和治疗领域。具体而言，本发明涉及检测肿瘤患者的微卫星不稳定的状态，从而有助于促进肿瘤的诊断和治疗。
背景技术
微卫星是人类基因组上存在的一些重复串联短序列。这类重复串联短序列有一个最小的重复单位，通常为1至5个碱基对。大多数重复串列序列的总长度为10到60个碱基对，在整个人类基因组上有超过一百万个微卫星位点。大多数微卫星位点位于基因组上的非功能区，也有少量微卫星位点位于蛋白质编码的外显子中。正常细胞在复制的过程中由于有DNA错配修复***的帮助，单个微卫星位点复制的错误率极低，约为0.1％。但是在某些疾病，如林奇综合征和癌症中，DNA错配修复***产生了缺陷，从而导致许多微卫星位点发生短***和缺失变异。这个生物现象被称为微卫星不稳定。微卫星不稳定的状态被分为三种：微卫星稳定(Microsatellite instability stable，MSS)，低度微卫星不稳定(Microsatellite instability low，MSI-L)和高度微卫星不稳定(Microsatelliteinstability high，MSI-H)。临床研究证明，部分高度微卫星不稳定癌症患者对化疗和免疫治疗敏感。而免疫治疗对于大多数微卫星稳定患者没有作用。因此检测微卫星的状态成为临床实践中的常规应用。
现阶段检测微卫星状态主要有两种方法。第一种是利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)从患者的肿瘤组织的DNA样本中扩增数个(通常不超过10个)目标微卫星位点，通过比较同一个患者的正常对照细胞DNA中相同位点的扩增产物长度变化来判断微卫星的状态。该方法对提取DNA的质量要求比较高。当DNA的断裂程度较严重或者肿瘤含量较低时，检测的结果会不准确。第二种是利用免疫组化对肿瘤组织中的四个错配修复蛋白质进行染色，当四个蛋白中有任意一个蛋白质表达量较低甚至是缺失时，该肿瘤就会被判断为错配修复***缺陷。多个研究证明错配修复***缺陷与高度微卫星不稳定的一致性约为90％。但是免疫组化检测对人员技能要求较高，容易在多次重复实验中产生不一样的判断结果。除此之外，这两种检测方法目前都只能被应用于癌症组织提取的DNA中。获取肿瘤组织通常为侵入性的，如手术、组织穿刺等等。对于某些晚期癌症病人来说，侵入性的获取肿瘤组织风险较高，对病人造成较大的痛苦。因此临床实践中往往不能获取这些肿瘤的组织对微卫星状态进行检测，从而对这类病人采取针对性的治疗策略。
发明内容
一些肿瘤患者体内肿瘤细胞的DNA会出现一种叫微卫星不稳定(MSI)的状态。发明人令人吃惊的发现，肿瘤细胞的微卫星片段释放到体液中，这种释放到体液中的微卫星片段上的不稳定状况被称为bMSI。发明人已经证明通过设计针对来自肿瘤患者体液样品的微卫星片段的探针，能够不通过侵入性手段获得肿瘤组织而通过检测肿瘤患者体液中的bMSI确定患者肿瘤组织的微卫星状态。已经证明，与传统的针对侵入性操作获得的肿瘤组织检测的MSI相比，通过患者检测肿瘤患者体液中的bMSI确定患者肿瘤组织的微卫星状态能够获得优异的灵敏度和特异性。更令人吃惊的发现，通过本发明的方法获得的微卫星状态更有利于选择需要进行免疫治疗的患者，从而与传统的针对侵入性操作获得的肿瘤组织检测的MSI相比更有利于精确选择能够获益于特定治疗(如化疗和/或免疫治疗)的肿瘤患者或者排除不适合进行特定疗法的患者。换言之，一些通过传统肿瘤组织检测的MSI表明不能受益于特定治疗的肿瘤患者通过本发明的bMSI方法证明实际上是能够受益的，而一些通过传统肿瘤组织检测的MSI表明能够受益于特定治疗的肿瘤患者通过本发明的bMSI方法证明实际上是不能够受益。
本文提供的微卫星捕获技术是一种只将含有微卫星序列的目标DNA片段捕获下来的一种技术。该技术包含两个关键点：1.设计针对目标微卫星的特异捕获探针；2.通过一套实验流程将包含微卫星序列的目标DNA片段捕获下来。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于捕获来自肿瘤患者体液样品的微卫星片段的探针，所述探针包括以下一种或多种探针：a)在微卫星位点两侧分别设计的探针，所述探针覆盖微卫星位点两侧序列而不覆盖微卫星序列，b)在微卫星位点边界设计的探针，所述探针一部分完全或不完全覆盖微卫星位点，另一部分覆盖微卫星位点一侧的序列，c)跨越微卫星位点设计的探针，所述探针完全覆盖微卫星位点及其两侧的序列。
在一些实施方案中，根据目标微卫星序列，可以采用以下三种方式设计探针：
a)在微卫星的两端，与微卫星区域不重合的区域设计探针。
b)在微卫星的两端，与微卫星区域部分重合的区域设计探针。
c)设计的探针完整跨越整个微卫星区域。
在一些实施方案中，设计的序列可以与染色体的正链一致，也可以与染色体的负链一致。
在一些实施方案中，探针的长度没有特别限制，例如，可以为15个碱基到3000个碱基之间。在一些实施方案中，探针的长度可以为50至1000个碱基之间。在一些实施方案中，探针的长度可以为100个碱基到500个碱基之间。在一些实施方案中，通常探针序列只需与正链或负链部分一致即可。在一些实施方案中，通常只要探针与目标片段连续配对数目超过15个即可有的捕获能力。
在一些实施方案中，所述探针可以i)包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和核酸衍生物如锁核酸(LNA)中的一种或多种；和/或ii)具有功能基团，所述功能基团包括生物素、氨基酸或多肽标签(如多聚组氨酸)、麸胱甘肽、肝素、糖类。
在一些实施方案中，已经发现针对目标微卫星位点设计不同的探针组合能够有利地提供捕获效果和检测效率。在一些实施方案中，a)的探针针对较长DNA片段(例如，150碱基至3000碱基)，b)的探针针对长度跨度较大的DNA片段(例如，50碱基至3000碱基)，c)的探针针对较短的DNA片段(例如，50碱基至500碱基)。
在一些实施方案中，所述探针可以包括a)、b)、c)中任意一种探针的单一探针，a)、b)、c)中任意两种或全部三种的混合探针。已经令人吃惊地发现针对不同DNA片段设计的探针的组合能够检测肿瘤患者体液中的bMSI，确定患者肿瘤组织的微卫星状态，具备任何单一探针或现有探针无法实现的优异的灵敏度和特异性。
在一些实施方案中，所述探针包括针对多个微卫星位点的探针，例如5个以上位点的探针。在一些实施方案中，所述探针包括针对多个微卫星位点的探针，例如6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、l50、180、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个以上位点(或其任意数值之间个位点)或甚至更多位点的探针。例如，在一些实施方案中，所述探针包括针对10-1000个、20-800个、30-700个、40-600个、50-500个、60-400个、70-300个、80-200个、90-150个微卫星位点的探针。
在一些实施方案中，本发明提供设计用于捕获来自肿瘤患者体液样品ctDNA的微卫星的探针的方法，所述方法包括：
1)提供多个微卫星位点区域的核酸序列，其可以通过本领域已知的任何方法获得，例如利用文献中已报道的位点；利用序列模式识别的算法，如Microsatellite RepeatsFinder(http：//www.biophp.org/minitools/microsatellite_repeats_finder/)等，进行全基因组搜索，然后确定目标微卫星位点；和/或利用现成的微卫星数据库获得，
2)设计一种或多种探针：a)在微卫星位点两侧设计探针，使得所述探针覆盖微卫星位点两侧序列而不覆盖微卫星序列，b)在微卫星位点边界设计探针，使得所述探针一部分完全或不完全覆盖微卫星位点，另一部分覆盖微卫星位点一侧的序列，c)跨越微卫星位点两侧设计探针，使得所述探针完全覆盖微卫星位点及其两侧的序列。
在一些实施方案中，所述探针包括以下三种探针的组合，a)的探针针对较长DNA片段(150碱基至3000碱基)，b)的探针针对长度跨度较大的DNA片段(50碱基至3000碱基)，c)的探针针对较短的DNA片段(50碱基至500碱基)。在一些实施方案中，针对不同DNA片段设计的探针的组合能够检测肿瘤患者体液中的bMSI，确定患者肿瘤组织的微卫星状态，具备任何单一探针或现有探针无法实现的优异的灵敏度和特异性。
在一些实施方案中，本发明提供种检测肿瘤患者的微卫星状态的方法，所述方法包括下述步骤：
1)提供来自所述患者体液样品的游离DNA，例如来自患者静脉血、胸积水、脑积液、胆汁和尿液的游离DNA。在一些实施方案中，可以将获得的游离DNA构建文库。在一些实施方案中，提供游离DNA和构建文库可以通过已有试剂盒完成。
2)使本发明的探针与来自所述患者体液样品的游离DNA的文库杂交，以捕获微卫星序列。杂交和检测方法是本领域已知的，也可以采用商业试剂盒完成。在一些实施方案中，通过探针杂交捕获微卫星片段，然后可以通过引物进行PCR扩增。在一些实施方案中，捕获的文库可以进行测序，例如通过二代测序仪进行测序。
3)将检测的来自所述患者体液样品的bMSI与与通过来自患者肿瘤的基因组DNA的微卫星状态和/或来自对照的基因组DNA的微卫星状态相比较。在一些实施方案中，确定微卫星状态的方法可以参考C.Richard Boland等人A National Cancer InstituteWorkshop on Microsatellite Instability for Cancer Detection and FamilialPredisposition：Development of International Criteria for the Determination ofMicrosatellite Instability in Colorectal Cancer.ICANCER RESEARCH 58.5248-5257，November 15.1998中公开的相关方法。例如，在一些实施方案中，如果5个标记中2个以上显示不稳定(具有***/缺失突变)，或在更多个标记(例如10个以上)中30％以上的标记显示不稳定，则确定为MSI-H；如果5个标记中1个显示不稳定，或在多个标记(例如10个以上)中10％以上并且在低于30％的标记显示不稳定则确定为MSI-L。在一些实施方案中，检测的来自所述患者体液样品的bMSI与病人和对照组微卫星状态相比较，确定肿瘤患者的微卫星状态。
在一些实施方案中，本发明提供选择适合进行特定疗法(如化疗和/或免疫治疗)的肿瘤患者和/或排除不适合进行特定疗法(如化疗和/或免疫治疗)的肿瘤患者的方法。本发明还涉及本文提供的探针在制备用于上述方法的选择剂和/或试剂盒的用途。临床研究已经证明，部分高度微卫星不稳定癌症患者对化疗和免疫治疗敏感，而免疫治疗对于大多数微卫星稳定患者没有作用。在一些实施方案中，通过本发明的方法检测为MSI-H的患者适合进行特定疗法(如化疗和/或免疫治疗)。在一些实施方案中，通过本发明的方法检测为阴性的患者不适合进行特定疗法(如化疗和/或免疫治疗，如抗体治疗，例如抗PD-1/PD-L1免疫治疗)。在一些实施方案中，通过本发明的方法检测为阳性的患者高于通过组织检测为MSI-H或dMMR患者例如1倍，1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍，并且显示这样的患者适合进行特定疗法(如化疗和/或免疫治疗，如抗体治疗，例如抗PD-1/PD-L1免疫治疗)。换言之，通过传统组织检测表明不适合这样治疗的患者而实际上能够通过本发明的方法鉴定为能够受益的患者，从而能够使更多患者受益于适当疗法和/或能够更精确确定受益于适当疗法的患者，进而精准指导患者的治疗。
在一些实施方案中，本发明提供本文公开的探针在制备用于检测肿瘤患者的微卫星状态的组合物或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测肿瘤患者的微卫星状态的组合物或试剂盒，其包括本文公开的用于捕获来自肿瘤患者体液样品游离DNA的微卫星的探针。
在一些实施方案中，本发明提供通过本发明的方法评估、诊断、监测和/或治疗受试者肿瘤的组合物和/或试剂盒，其中所述组合物或试剂盒包括针对来自肿瘤患者体液样品游离DNA的探针。在一些实施方案中，试剂盒包含多种探针，所述探针与目标微卫星序列特异性结合。在一些实施方案中，试剂盒包含杂交试剂和/或检测探针的试剂。在一些实施方案中，探针或微卫星序列可以固定于基质上。在一些实施方案中，试剂盒包括含有本发明探针的容器。在一些实施方案中，在一些实施方案中，试剂盒还可以包括第二或更多种探针，其可以分别放入不同容器中或存入同一容器中。在一些实施方案中，试剂盒包括缓冲液，如杂交缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒包括使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括芯片或微阵列。在一些实施方案中，试剂盒包括附有吸附剂的一种或多种基质。在一些实施方案中，试剂盒可以包括例如分离肿瘤患者体液样品游离DNA的试剂和缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒可以包括构建游离DNA文库的试剂和缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒可以包括进行PCR反应的试剂和缓冲液，例如可以包括扩增DNA文库的引物。在一些实施方案中，试剂盒可以包括对捕获的文库测序相关的试剂如引物和缓冲液。
在一些实施方案中，本发明提供评估、诊断、监测和/或治疗患者肿瘤的方法，其包括以下步骤：1)提供来自所述患者体液样品的游离DNA，2)使本发明的探针与来自所述患者体液样品的游离DNA的文库杂交，以捕获微卫星序列，3)将检测的来自所述患者体液样品的bMSI与通过来自患者肿瘤的基因组DNA的微卫星状态和/或来自对照的基因组DNA的微卫星状态相比较，以确定患者的微卫星状态。在一些实施方案中，根据所检测的微卫星状态，确定是否对所述患者采用相关治疗，例如免疫治疗。
在一些实施方案中，本发明涉及对肿瘤患者进行选择或筛选，以确定是否采用特定疗法(例如免疫疗法)的方法，所述方法包括通过本文描述的方法确定肿瘤患者的微卫星不稳定状态，和根据所确定的状态选择进行特定疗法的患者。在一些实施方案中，免疫疗法可以包括靶向特定位点的治疗，例如PD-1/PD-L1治疗。
在一些实施方案中，本发明中包含确定患者的微卫星状态的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括1)用于提取来自所述患者体液样品的游离DNA的试剂和/或装置，和2)用于捕获游离DNA的探针。
本发明的探针、组合物、试剂盒可以用于评估受试者肿瘤的状况；评估受试者中肿瘤的分期；评估受试者中肿瘤的分级；评估受试者肿瘤的良性或恶性性质；评估受试者肿瘤的转移可能性；评估一种或多种候选化合物抑制受试者肿瘤的效果；评估治疗方法的效果；监测受试者肿瘤的进展；筛选抑制受试者肿瘤的组合物或治疗方法；评估试验化合物的致肿瘤能力；以及预防具有发展肿瘤危险的受试者的肿瘤发病。
如本领域技术人员已知的，微卫星状态检测和体液样品的游离DNA检测可以用于多种肿瘤的诊断和治疗中。在一些实施方案中，可以通过本发明的方法和/或试剂盒评估、诊断、监测、治疗和/或选择接受适当治疗的肿瘤包括例如原发癌、转移癌、复发癌等。在一些实施方案中，适用于本发明的方法和/或试剂盒的肿瘤包括例如结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃肠癌、***、乳腺癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、***癌等。
附图说明
图1：微卫星探针设计方式示例。
图2：探针设计与含目标微卫星DNA片段捕获效果示例。
图3-7：目标微卫星捕获效果示例。
图8：设计微卫星探针示例。
具体实施方式
1.发明实现流程。
1.1设计针对目标微卫星的特异捕获探针。
1.1.1探针定义
探针为约15至3000个碱基长度的DNA、RNA及其他核酸衍生物(包括但不限于LNA等)的核酸小分子。这些小分子通常会与一些功能基团(包括但不限于生物素biotin等其他基团)连接。探针会与目标DNA片段以碱基完全互补或部分互补的形式结合，而探针上的功能基团会和与之有强亲和性的其他功能基团(包括但不限于链霉亲和素Streptavidin、卵白素avidin等)或特异性抗体相结合。通常与探针上功能基团相结合的其他功能基团或抗体被连接到磁珠、有吸附性的材料等耗材上，并通过物理的手段将目标片段和探针的结合体从反应溶液中提取出来，达到捕获目标片段的目的。
1.1.2探针设计原理
针对微卫星区域，一共有三种探针的设计方式。第一种方式是在微卫星位点的两端1到20000个碱基对以内的范围根据基因组参考序列设计探针。最终微卫星序列会出现在被捕获到的DNA片段的两端。该设计方案更适合于捕获较长的DNA片段。第二种方式是使探针的一段完全或不完全覆盖微卫星位点，而另一端则覆盖微卫星的临近区域，并根据基因组参考序列设计探针。最终微卫星序列会出现在靠近DNA片段两端的位置。该设计方案可以兼顾长度跨度较大的DNA片段。第三种方式是使探针跨越微卫星位点的两端并完整覆盖整个微卫星区域。最终微卫星序列会出现在DNA片段的中间。该设计方案更适合于捕获较短的DNA片段，但是这样设计的探针的捕获效率可能会比前两种方式稍低。最终探针可以针对不同的产品和检测目的，采用单一或者混合的设计方案。三种探针设计捕获的效果如图2。
4.1.3探针设计可应用的范围
这三种探针的设计方式可以应用于所有微卫星位点。对于不同重复单位长度的微卫星位点，这三种探针的设计方式都可以有效捕获目标微卫星片段(图3)。
1.2捕获目标微卫星片段实验试剂和流程
1.2.1寻找微卫星位点。
微卫星位点可以通过以下三种方式寻找：
(1)查阅文献中已报道的位点
(2)利用序列模式识别的算法，如MicrosatelliteRepeats Finder(http://www.biophp.org/minitools/microsatellite_repeats_finder/)等，进行全基因组搜索，然后确定目标微卫星位点。
(3)利用现成的微卫星数据库，如SNPSTR(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～ino/SNPSTRdatabase.html)等，来寻找目标微卫星位点。
目标微卫星位点多数为单碱基重复序列。2个以上碱基为单位的重复在特殊情况下也能被选择，在后续的计算情况中效率与单碱基重复位点有所不同。
微卫星位点的选择有如下几种方式：
(1)根据计算机的随机算法，如python语言中numpy.random库等，进行完全随机选择。
(2)选择文献报道的常用位点。
(3)根据WES的数据选择探针捕获效率较高的微卫星位点。
选择的位点数目最少为5个点，最多为300百万个微卫星位点。选择的微卫星位点数目越多，检测的准确性越高，但是成本也会相应的增加。
在本实施例中，依据(3)中的方法，总共有100个微卫星被选择。具体的微卫星位点位置信息参见下表1。
Figure BDA0001697544660000101
Figure BDA0001697544660000111
Figure BDA0001697544660000121
1.2.2设计探针捕获目标微卫星片段的探针
(1)确定目标微卫星在基因组上的位置信息，包括所在的染色体编号和起始位置。
(2)下载对应的人类基因组数据库，如NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝human)等。
(3)根据基因组的信息，将目标微卫星和微卫星前后各1至20000个碱基提取出来。
(4)根据提取出来的序列，用以下三种方式设计探针：
a)在微卫星的两端，与微卫星区域不重合的区域设计探针。
b)在微卫星的两端，与微卫星区域部分重合的区域设计探针。
c)设计的探针完整跨越整个微卫星区域。
设计的序列可以与染色体的正链一致，也可以与染色体的负链一致。如图4的例子。
探针的长度为15个碱基到1000个碱基之间。通常探针序列只需与正链或负链部分一致即可。通常只要探针与目标片段连续配对数目超过15个即可有一定的捕获能力。
(5)在探针设计好后，将探针的序列与全基因组的序列进行比对。可以使用如BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK LOC＝blasthome)等序列比对算法进行比对。在比对的结果中，除了探针设计的目标位置外，没有其他的位置的序列能比对到与原来探针相似性在50％以上并且覆盖度在50％以上时，该探针的特异性较好，会被纳入候选。该步骤可以提升探针在捕获中的特异性，并非必须。
(6)探针设计好之后，可以交由第三方核酸合成机构合成。探针可以由以下几种核酸单独或混合搭配合成：
a)核糖核酸(RNA)
b)脱氧核糖核酸(DNA)
c)核酸衍生物，如锁核酸(LNA)等
在本实施例中，探针单独由DNA合成。探针的序列如下：
探针1
Figure BDA0001697544660000131
Figure BDA0001697544660000141
Figure BDA0001697544660000151
Figure BDA0001697544660000161
Figure BDA0001697544660000171
Figure BDA0001697544660000181
Figure BDA0001697544660000191
Figure BDA0001697544660000201
Figure BDA0001697544660000211
Figure BDA0001697544660000221
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(7)在合成好核酸分子后，需要给核酸加上一些亲和功能基团进行修饰。这项工作可以由第三方机构完成，也可以在收到核酸分子后自行添加。包括以下常见几种：
a)生物素(biotin)
b)特殊的氨基酸和多肽，如多聚组氨酸(polyhistidine)
c)麸胱甘肽(glutathione)
d)肝素(heparin)
e)糖类(carbohydrate)。
在本实施例中，DNA探针中加上了生物素。
1.2.3通过实验捕获目标ctDNA片段并进行测序
(1)对病人抽取静脉血，通常为5毫升以上。将血保存在含有游离DNA保护液的采血管中，如Cell-Free DNA BCT(Streck Inc.)等。血液样本需保存在4摄氏度的环境中。
(2)血浆并且必须在48小时内进行血浆分离。分离的方法为在室温下对样本进行1600g速度的离心，时间为20分钟。离心后将上层血浆转移到1.5ml的离心管中，然后再在室温下进行10分钟16000g速度的离心来去除残余的细胞碎片。最后将离心后的上层血浆分离到新的离心管中。
(3)血浆中的游离DNA可以通过商业试剂盒，如QIAamp Circulating NucleicAcid Kit(Qiagen)等，或者自己配方的试剂盒进行抽提。然后抽提的游离DNA量由能精确定量微量双链DNA的仪器和试剂，如Qubit dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies)等，来确定。
(4)抽提的游离DNA需要先进行文库的构建。文库的构建必须使用能添加数字信号标签的试剂盒，例如Accel-NGS 2s Plus DNALibrary Kit(SWIFT)等。每个样本用来构建文库的DNA量建议为15ng以上。
(5)将总量为1ug的DNA文库与DNA blocker和人类Cot-1DNA混合。DNAblocker和Cot-1DNA都可以通过购买商业试剂盒取得。将混合后的溶液干燥成粉末状。该过程可以通过真空浓缩器或者类似的装置完成。之后将干燥后的混合物溶解到杂交液中。杂交液可以自己配置，也可以购买商业试剂，如xGen Lockdown Probes kit(Integrated DNATechnologies)等。之后将之前合成的微卫星捕获探针加入混合溶液捕获目标微卫星片段。这一步可以通过商业试剂盒完成，如
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Hybridization and Wash Kit等。通常1ug的DNA文库可以由多个样本的文库等量混合而成，建议混合的样本数为1至3个。
(6)将捕获后的DNA文库用p5和p7引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。扩增循环数建议10个以上。扩增后的文库最终的定量由能精确定量微量双链DNA的仪器和试剂，如Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies)等，来确定。
(8)捕获后的文库可以用二代测序仪来测序，如Illumina Next-seq 500等。
4.2.4测序数据处理
a)测序的错误率会对最终检测有一定影响，建议测序错误率保持在1％以下。若测序错误率高于1％，假阳性率会提升。
b)测序的结果需转换成短序列的形式，然后用基因组比对工具，如Bowtie等，将每条短序列比对到基因组上。
c)将短序列按照比对到基因组上的起止位置和数字信号标签进行分组。若测序为单端测序，则起止位置按照该序列比对的在基因组上的起始和结束坐标计算。若测序为双端测序，则起止位置按照一对短序列中第一条短序列的起始坐标和第二条短序列的结束坐标计算。由于PCR的过程产生了多个拷贝，每组短序列被认为是来自于同一个DNA片段分子。因此在相同的位置，一组中所有短序列应该拥有相同的测序结果，而其中某些与其他短序列有冲突的测序结果，可以认为是由PCR和测序的过程造成的。因此在比对后，需要将PCR扩增出来的短序列“压缩”成为PCR前的DNA片段的序列情况，即每组短序列需要找到一个代表短序列，该代表的短序列上的每一个碱基的检测结果，都是所有该组短序列在该位置检测结果中所占比例最大的检测结果。如果有两个以上的结果所占的比例都为最大且比例相同，则该位点检测结果不能被确定，这个组的短序列将不会被纳入接下来的计算。
d)根据每个微卫星位点，提取能够完全覆盖该位点的短序列。计算并统计微卫星在每条短序列上的长度，得到该位置微卫星片段长度的分布情况。
e)将检测的来自所述患者体液样品的bMSI与通过来自患者肿瘤的基因组DNA的微卫星状态和/或来自对照的基因组DNA的微卫星状态相比较，或者检测的来自所述患者体液样品的bMSI与病人和对照组微卫星状态相比较，确定bMSI的判断标准。
病人和对照组可以如下建立：
收取一组训练集病人的血液和组织配对样本用于组的建立，其中组织为MSS/pMMR的病人样本为阴性对照组和组织为MSH-H/dMMR的病人样本为阳性对照组。组织的微卫星不稳定状态或MMR的状态可以用传统方法来确定。阴性和阳性对照组建议每组在20人以上。这些病人符合以下入组条件时为最佳：1.肿瘤转移的晚期病人。2.血样在取组织样本前一星期内获得。3.非脑癌患者。4.病人为初诊，未经过任何其他形式的治疗。
f)检测上述病人和对照组的微卫星状态，建立病人和对照的微卫星状态参照组。
g)确定微卫星状态的方法可以参考C.Richard Boland等人A National CancerInstitute Workshop on Microsatellite Instability for Cancer Detection andFamilial Predisposition：Development of International Criteria for theDetermination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer.ICANCERRESEARCH 58.5248-5257，November 15.1998中公开的相关方法。如果5个标记中2个以上显示不稳定(具有***/缺失突变)，或者不稳定标记比例超过30％，则为MSI-H；如果5个标记中1个显示不稳定，或者不稳定标记比例高于10％并且小于30％，则为MSI-L。
h)在病人和对照组确定之后，可以再收集一组验证集病人的血液和组织配对样本用于验证有效性。验证集的验证可以基于两个方向来衡量有效性：1.配对的组织和血液样本，要求与(e)中相似。2.前瞻性的预测bMSI，并对适合使用PD-1/PD-L1治疗的病人并检测出bMSI-H的病人使用PD-1/PD-L1治疗。最终以客观缓解率(ORR)来判断检测的有效性。
4.2.5数据验证结果
(1)我们的训练集病人(主要来自于胃癌和肠癌患者)为40人，其中MSS/pMMR的病人为20人，MSI-H/dMMR的病人为20人。训练后对该组病人的检测的敏感性为85％，特异性为90％，阳性预测率为89.5％，阴性预测率为85.7％，总体准确率为87.5％。
(2)我们的验证集病人为47人，其中MSS/pMMR的病人为26人，MSI-H/dMMR的病人为21人。相同的组和参数下该组病人检测的敏感性为95.2％，特异性为42.3％。我们对这47位病人采用了抗PD-1/PD-L1免疫治疗，其中检测判断为阳性的病人客观缓解率(ORR)为31.4％，与该组病人中组织为MSI-H/dMMR的病人的ORR相近(33.3％)，也与多项已经报道的MSI-H/dMMR的病人的ORR相近(30％～50％)1-3。而该检测判断为阴性的病人的ORR为8.3％，远远低于组织检测为MSS/pMMR病人的19.2％。在临床实践中，只有组织为MSI-H或dMMR的病人推荐使用抗PD-1/PD-L1免疫治疗。在验证集病人中，该检测判断为阳性的病人人数为组织检测为MSI-H或dMMR病人的1.67倍。因此在晚期的转移癌症患者中，使用该检测来检测微卫星不稳定可以取代组织检测，从而精准指导抗PD-1/PD-L1免疫治疗。
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Claims (5)

1.一种用于捕获来自肿瘤患者体液样品的微卫星的探针组，所述探针组包括以下a)、b)、c)中全部三种探针：a)在微卫星位点两侧分别设计的探针，所述探针覆盖微卫星位点两侧序列而不覆盖微卫星序列，b)在微卫星位点边界设计的探针，所述探针一部分完全或不完全覆盖微卫星位点，另一部分覆盖微卫星位点一侧的序列，和c)跨越微卫星位点设计的探针，所述探针完全覆盖微卫星位点及其两侧的序列，其中所述探针组的序列由SEQ IDNO:1-500组成。
2.一种设计用于捕获来自肿瘤患者体液样品的微卫星的探针的方法，所述方法包括：
1)提供多个微卫星位点区域的核酸序列，
2)设计权利要求1所述的探针组：a)在微卫星位点两侧设计探针，使得所述探针覆盖微卫星位点两侧序列而不覆盖微卫星序列，b)在微卫星位点边界设计探针，使得所述探针一部分完全或不完全覆盖微卫星位点，另一部分覆盖微卫星位点一侧的序列，和c)跨越微卫星位点两侧设计探针，使得所述探针完全覆盖微卫星位点及其两侧的序列。
3.权利要求1所述的探针组在制备用于检测肿瘤患者体液样品的微卫星状态的检测剂中的用途，其中所述探针用于与来自所述患者体液样品的微卫星片段的文库杂交，以捕获微卫星序列，其中所述肿瘤为胃癌或肠癌。
4.权利要求1所述的探针组在制备用于检测肿瘤患者体液样品的微卫星状态和/或选择进行免疫治疗的患者的组合物或试剂盒中的用途，其中所述肿瘤为胃癌或肠癌。
5.一种用于检测肿瘤患者体液样品的微卫星状态的组合物或试剂盒，其包括权利要求1所述的探针组。
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