CN108912375A - 定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，所述方法包括以下步骤：培养木醋杆菌得到BC膜，将膜处理干净并粉碎成絮状；将MWCNTs溶液与絮状BC膜混合，经抽滤得到BC/MWCNTs复合膜；用PEI溶液及氯金酸溶液处理所得复合膜，以在其表面固定纳米金粒子，得到BC/MWCNTs/Au NPs复合基材；将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸泡在漆酶及葡萄糖酶溶液中进行酶的吸附。以BC膜作为电极材料基体，简化了MWCNTs的表面吸附程序，同时BC具备良好的生物相容性使其具备广泛的生物应用前景；采用了粉碎BC膜与MWCNTs溶液混合共同抽滤得到复合膜的技术处理方式，使得复合膜表面的碳管分布均匀，导电性能良好；在BC/MWCNTs复合膜表面可控生长纳米金，利用纳米金的电子传递效应和协同催化作用提高传感器的响应灵敏度。

Description

定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法
技术领域
本发明属于生物燃料电池技术领域，涉及生物燃料电池及自供能生物传感器制备方法，具体为定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法。
背景技术
生物燃料电池一般分为微生物型及酶型两种，其中酶型生物燃料电池应用前景更加广阔。燃料在阳极酶催化剂(常见的有葡萄糖氧化酶、纤维二糖脱氢酶、果糖脱氢酶、乙醇脱氢酶等)的作用下被氧化，产生的电子通过外电路到达阴极，质子通过质子交换膜到达阴极，氧化物(一般为氧气)在阴极得到电子被还原(产物一般为水)，整个过程形成一个通路，构成酶型生物燃料电池。
自供能生物传感器的设计原理主要源自于生物燃料电池。研究表明，只要解决生物相容性的问题，基于葡萄糖燃料的自供能生物传感器作为植入式血糖传感器连续监测人体内血糖量变化是切实可行的。
细菌纤维素作为一种化学性质与植物纤维素类似的超细纳米纤维，拥有很多优异的物理化学性能，如大的比表面积、高的结晶度、良好的机械性能和持水率等。且由细菌纤维素所形成的天然纤维素膜具有很好的柔韧性和很好的生物相容性，已经被广泛应用于生物医疗方面，例如人造皮肤、人造血管和伤口敷料等。将细菌纤维素与电导性材料(如碳纳米管、石墨烯、导电高聚物)结合可以赋予其优良的导电性，从而作为柔性电极应用在锂离子电池、超级电容器和传感器等方面。
在BC/CNT膜电极表面可控生长纳米金颗粒可以提高传感器的灵敏度和调控其检测线性范围。纳米金拥有很好的生物相容性，纳米金可以提高酶活性中心与电极间的电子转移效率进而增强生物传感器的响应灵敏度。已经有研究表明可以通过改变环境温度、pH、添加卤素离子等手段来调控在细菌纤维素表面生长的纳米金的形貌尺寸。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，解决目前自供能生物传感器电极灵敏度差、生物相容性低的问题，本发明提供了定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法。
技术方案：定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，所述方法包括以下步骤：
第1步、培养木醋杆菌得到BC膜，将膜处理干净并粉碎成絮状；
第2步、将MWCNTs溶液与絮状BC膜混合，经抽滤得到BC/MWCNTs复合膜；
第3步、用PEI溶液及氯金酸溶液处理所得复合膜，以在其表面固定纳米金粒子，得到BC/MWCNTs/Au NPs复合基材；
第4步、将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸泡在漆酶及葡萄糖酶溶液中进行酶的吸附。
涉及到的缩写或简称解释如下：BC为Bacterial Cellulose，即细菌纤维素膜；MWCNTs为Multi-walled Carbon nanotubes，即多壁纳米碳管；PEI为聚醚酰亚胺。
优选的，培养木醋杆菌得到BC膜的步骤为：将酵母浸菌、胰蛋白胨、甘露醇溶于水，制备木醋杆菌发酵培养液，高温高压灭菌，无菌接种，置于生化培养箱中培养；将生长状况良好的BC膜进行处理，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物，处理后置于蒸馏水中浸泡备用。
优选的，BC/MWCNTs复合膜制备的步骤为：BC膜粉碎成为絮状，配制MWCNTs溶液，将MWCNTs溶液加入絮状分散的BC膜混合液中，搅拌均匀，经抽滤制得碳管均匀吸附的BC/MWCNTs复合膜。
优选的，BC/MWCNTs/Au NPs复合膜制备的步骤为：配制氯金酸溶液、PEI溶液，将步骤(2)得到的BC/MWCNTs复合膜浸没于PEI溶液中，静置处理后加入氯金酸溶液，烘箱中处理，取出后自然风干即制得BC/MWCNTs/Au NPs复合基材。
优选的，BC/MWCNTs/Au NPs复合基材的处理步骤为：配制漆酶和葡萄糖氧化酶的水溶液，将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸入漆酶和葡萄糖氧化酶水溶液中，使漆酶及葡萄糖氧化酶分别固定于BC/MWCNTs/Au NPs基材上，制得BC/MWCNTs/Au NPs复合膜。
优选的，木醋杆菌发酵培养液配方为：酵母浸菌3g/L，胰蛋白胨5g/L，甘露醇25g/L；高温高压灭菌温度是120℃；接菌后培养条件是：在30℃的生化培养箱中培养。
优选的，BC膜处理的具体方法为：用去离子水进行反复冲洗后，置于4g/L的NaOH溶液于80℃水浴锅中处理2h，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物。
优选的，MWCNTs溶液浓度为1mg/mL，配制该溶液过程中加入微量的表面活性剂，使固体分散更加均匀。
优选的，氯金酸溶液和PEI溶液浓度分别为20mmol/L及10g/L，具体处理方法为：取PEI溶液将BC/MWCNTs膜浸没，室温下静置30min，加入的氯金酸溶液体积为0.5倍的PEI溶液体积，并置于60℃烘箱烘燥1小时。
优选的，漆酶和葡萄糖氧化酶溶液浓度为1mg/mL，使漆酶及葡萄糖氧化酶充分吸附固定的处理方法是：将复合膜浸入漆酶及葡萄糖氧化酶溶液后，置于4℃冰箱中8h。
本发明所述定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法的原理在于：以BC作为基体材料引入MWCNTs，使MWCNTs有效沉积在它的纳米多孔网络结构中，以实现均匀分布。以PEI作为还原剂，原位制备Au NPs，同时可以辅助BC起到稳定Au NPs，防止其聚集的作用。
有益效果：(1)本发明以BC膜作为电极材料基体，其具有活性基团简化了MWCNTs的表面吸附程序，同时BC具备良好的生物相容性使其具备广泛的生物应用前景；(2)本发明采用了粉碎BC膜与MWCNTs溶液混合共同抽滤得到复合膜的技术处理方式，使得复合膜表面的碳管分布均匀，导电性能良好；(3)本发明在BC/MWCNTs复合膜表面可控生长纳米金，利用纳米金的电子传递效应和协同催化作用提高传感器的响应灵敏度。
附图说明
图1为BC/MWCNTs/Au NPs膜的扫描电镜图，图1(a)为放大20倍，图1(b)为放大50倍；
图2为BC膜、BC/MWCNTs膜及BC/MWCNTs/Au NPs膜的红外光谱图；
图3为BC膜、BC/MWCNTs膜及BC/MWCNTs/Au NPs膜的热重分析图；
图4为BC膜、BC/MWCNTs膜及BC/MWCNTs/Au NPs膜XRD图谱；
图5为漆酶电极的电化学性质测试结果图，图5A为BC/MWCNTs/Au NPs-Lac电极在0.1M乙酸/醋酸钠缓冲溶液中(pH 4.5)中扫描速率分别为50,100,150,200,250,300,350mV/s的循环伏安曲线图，图5B为阳极与阴极峰值电流对扫速的校准曲线；Lac为漆酶；
图6为葡萄糖氧化酶电极的电化学性质测试结果图，图6A为BC/MWCNTs/Au NPs-GOx电极在含有50mM葡萄糖的0.1M乙酸/醋酸钠缓冲溶液中(pH 4.5)中扫描速率分别为50,100,150,200,250,300mV/s的循环伏安曲线图，图6B为阳极与阴极峰值电流对扫速的校准曲线；GOx为葡萄糖氧化酶。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，所述方法包括以下步骤：
第1步、培养木醋杆菌得到BC膜，将膜处理干净并粉碎成絮状；
第2步、将MWCNTs溶液与絮状BC膜混合，经抽滤得到BC/MWCNTs复合膜；
第3步、用PEI溶液及氯金酸溶液处理所得复合膜，以在其表面固定纳米金粒子，得到BC/MWCNTs/Au NPs复合基材；
第4步、将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸泡在漆酶及葡萄糖酶溶液中进行酶的吸附。
涉及到的缩写或简称解释如下：BC为Bacterial Cellulose，即细菌纤维素膜；MWCNTs为Multi-walled Carbon nanotubes，即多壁纳米碳管；PEI为聚醚酰亚胺。
培养木醋杆菌得到BC膜的步骤为：将酵母浸菌、胰蛋白胨、甘露醇溶于水，制备木醋杆菌发酵培养液，高温高压灭菌，无菌接种，置于生化培养箱中培养；将生长状况良好的BC膜进行处理，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物，处理后置于蒸馏水中浸泡备用。
BC/MWCNTs复合膜制备的步骤为：BC膜粉碎成为絮状，配制MWCNTs溶液，将MWCNTs溶液加入絮状分散的BC膜混合液中，搅拌均匀，经抽滤制得碳管均匀吸附的BC/MWCNTs复合膜。
BC/MWCNTs/Au NPs复合膜制备的步骤为：配制氯金酸溶液、PEI溶液，将步骤(2)得到的BC/MWCNTs复合膜浸没于PEI溶液中，静置处理后加入氯金酸溶液，烘箱中处理，取出后自然风干即制得BC/MWCNTs/Au NPs复合基材。
BC/MWCNTs/Au NPs复合基材的处理步骤为：配制漆酶和葡萄糖氧化酶的水溶液，将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸入漆酶和葡萄糖氧化酶水溶液中，使漆酶及葡萄糖氧化酶分别固定于BC/MWCNTs/Au NPs基材上，制得BC/MWCNTs/Au NPs复合膜。
木醋杆菌发酵培养液配方为：酵母浸菌3g/L，胰蛋白胨5g/L，甘露醇25g/L；高温高压灭菌温度是120℃；接菌后培养条件是：在30℃的生化培养箱中培养。
BC膜处理的具体方法为：用去离子水进行反复冲洗后，置于4g/L的NaOH溶液于80℃水浴锅中处理2h，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物。
MWCNTs溶液浓度为1mg/mL，配制该溶液过程中加入微量的表面活性剂，使固体分散更加均匀。
氯金酸溶液和PEI溶液浓度分别为20mmol/L及10g/L，具体处理方法为：取PEI溶液将BC/MWCNTs膜浸没，室温下静置30min，加入的氯金酸溶液体积为0.5倍的PEI溶液体积，并置于60℃烘箱烘燥1小时。
漆酶和葡萄糖氧化酶溶液浓度为1mg/mL，使漆酶及葡萄糖氧化酶充分吸附固定的处理方法是：将复合膜浸入漆酶及葡萄糖氧化酶溶液后，置于4℃冰箱中8h。
对制备获得的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜进行检测，结果如下：
如图1所示，图1(a)表明碳纳米管及纳米金粒子分布比较均匀，碳纳米管被紧紧包裹在具有超微空隙结构的细菌纤维素中，同时通过金纳米粒子在BC/MWCNTs载体上的分布，也说明采用抽滤法固定碳纳米管及在复合膜表面固定纳米金均取得了较好的效果。由(b)图可见，细菌纤维素呈现出随机定向的三维网状结构，表面孔隙大小不一，细长的碳纳米管随机填充于细菌纤维素的纤维空隙间，大量Au被均匀吸附于复合膜表面，为提高电化学灵敏性提供了必要的条件。
如图2所示，在C-O的伸缩振动区域，1659cm-1和1061cm-1的吸收峰分别对应C-O非对称伸缩振动和吡喃糖环骨架振动，2973cm-1处是由-CH-的振动造成的，3465cm-1处是由-OH基团对称伸缩振动造成的。由图可见，加入多壁碳纳米管后，光谱图高峰在2973cm-1处微量增强，在3465cm-1处明显增强，这是因为多壁碳纳米管的加入使得-CH-键叠加引起的伸缩振动增强，同时引入大量-OH基团，说明BC和多壁碳纳米管之间只有物理相互作用；负载纳米金后，各个波峰无明显变化，则负载纳米金粒子对BC/MWCNTs膜各项化学性质基本不产生影响。
如图3所示，BC的成分为纤维素，它的热分解发生在220～400℃温度区间，这一阶段样品的质量损失率达75％；从DTG曲线可以看到BC有两个明显的失重峰，分别对应220～270℃温度段和300～400℃温度段，这两个失重峰都是BC热分解引起的。其中300～400℃对应的失重峰峰值较大，说明在这一阶段BC质量损失较快，且在温度为320℃左右时，BC热分解速率达到最大。BC/MWCNTs膜的热分解发生在350～400℃温度区间,这一阶段样品的质量损失率约50％；从DTG曲线可以看到BC/MWCNTs有一个明显的失重峰，对应350～400℃温度段。BC/MWCNTs/Au NPs膜的热分解发生在190～250℃及350～400℃温度区间，第一、二阶段样品的质量损失率分别约为5％及20％；DTG曲线显示第一阶段失重峰较小，质量损失较慢，第一阶段为主要质量损失阶段。
对比可得，相比纯BC膜，BC/MWCNTs膜的始失重温度提高约100℃，失重百分比降低约25％；BC/MWCNTs/Au NPs膜始失重温度则降低约30℃，但主要失重温度提高约50℃，且失重百分比大大降低。综上而述，经处理后的BC膜热稳定性能提高。
如图4所示，相比纯BC膜，BC/MWCNTs及BC/MWCNTs/Au NPs膜的细菌纤维素的衍射峰高度增加，衍射强度明显提高，则经处理后的细菌纤维素膜的结晶程度增加；同时，在BC/MWCNTs及BC/MWCNTs/Au NPs膜上，C(002)、C(100)、C(101)、C(004)处均出现高峰，证明碳纳米管在细菌纤维素膜表面吸附状况良好。相比BC/CNT膜，负载纳米Au粒子后的膜在Au(111)、Au(200)、Au(220)处出现高峰，说明纳米Au在膜上的吸附状况良好。
如图5所示，可以观察到明显的阳极和阴极峰值电流，且随着扫描速率的增加，电流的峰值分别正向、反向增大，这说明与电极表面连接的BC上的AuNPs和BC/MWCNTs可以进行漆酶氧化还原反应电子的转移。如图5B所示，将阳极峰及阴极峰电流作为在50-350mV范围内扫描速率的平方根的函数，可见随着扫速的提高，峰电流值呈现线性增长。结果表明，漆酶电极表面的电化学反应具有可控性，为稳定的电化学体系。
如图6所示，在图6A中，同样可以观察到明显的阳极和阴极峰值电流，扫描速率由50mV增加至300mV，阳极峰值电流由0.2mA逐渐增加至约0.7mA，阴极峰电流值由-0.2mA逐渐增加至约-0.83mA，说明葡萄糖氧化酶与BC/MWCNTs/AuNPs生物电极之间耦合良好。如图6B所示，将阳极峰及阴极峰电流作为在50-350mV范围内扫描速率的平方根的函数，同样的规律，随着扫速的提高，峰电流值呈现线性增长。结果表明，葡萄糖氧化酶改性BC/MWCNTs/AuNPs电极表面化学反应具有可控性。

Claims (10)

1.定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
第1步、培养木醋杆菌得到BC膜，将膜处理干净并粉碎成絮状；
第2步、将MWCNTs溶液与絮状BC膜混合，经抽滤得到BC/MWCNTs复合膜；
第3步、用PEI溶液及氯金酸溶液处理所得复合膜，以在其表面固定纳米金粒子，得到BC/MWCNTs/Au NPs复合基材；
第4步、将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸泡在漆酶及葡萄糖酶溶液中进行酶的吸附。
2.根据权利要求1所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，培养木醋杆菌得到BC膜的步骤为：将酵母浸菌、胰蛋白胨、甘露醇溶于水，制备木醋杆菌发酵培养液，高温高压灭菌，无菌接种，置于生化培养箱中培养；将生长状况良好的BC膜进行处理，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物，处理后置于蒸馏水中浸泡备用。
3.根据权利要求1所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，BC/MWCNTs复合膜制备的步骤为：BC膜粉碎成为絮状，配制MWCNTs溶液，将MWCNTs溶液加入絮状分散的BC膜混合液中，搅拌均匀，经抽滤制得碳管均匀吸附的BC/MWCNTs复合膜。
4.根据权利要求1所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，BC/MWCNTs/Au NPs复合膜制备的步骤为：配制氯金酸溶液、PEI溶液，将步骤(2)得到的BC/MWCNTs复合膜浸没于PEI溶液中，静置处理后加入氯金酸溶液，烘箱中处理，取出后自然风干即制得BC/MWCNTs/Au NPs复合基材。
5.根据权利要求1所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，BC/MWCNTs/Au NPs复合基材的处理步骤为：配制漆酶和葡萄糖氧化酶的水溶液，将BC/MWCNTs/Au NPs复合基材浸入漆酶和葡萄糖氧化酶水溶液中，使漆酶及葡萄糖氧化酶分别固定于BC/MWCNTs/Au NPs基材上，制得BC/MWCNTs/Au NPs复合膜。
6.根据权利要求2所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，木醋杆菌发酵培养液配方为：酵母浸菌3g/L，胰蛋白胨5g/L，甘露醇25g/L；高温高压灭菌温度是120℃；接菌后培养条件是：在30℃的生化培养箱中培养。
7.根据权利要求2所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，BC膜处理的具体方法为：用去离子水进行反复冲洗后，置于4g/L的NaOH溶液于80℃水浴锅中处理2h，以洗去膜表面的大量杂质和细菌营养物。
8.根据权利要求3所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，MWCNTs溶液浓度为1mg/mL。
9.根据权利要求4所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，氯金酸溶液和PEI溶液浓度分别为20mmol/L及10g/L，具体处理方法为：取PEI溶液将BC/MWCNTs膜浸没，室温下静置30min，加入的氯金酸溶液体积为0.5倍的PEI溶液体积，并置于60℃烘箱烘燥1小时。
10.根据权利要求5所述的定向生长纳米金细菌纤维素/碳管复合膜方法，其特征在于，漆酶和葡萄糖氧化酶溶液浓度为1mg/mL，使漆酶及葡萄糖氧化酶充分吸附固定的处理方法是：将复合膜浸入漆酶及葡萄糖氧化酶溶液后，置于4℃冰箱中8h。
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