CN108904795B

CN108904795B - 一种猪流行性腹泻病毒的口服疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN108904795B
Application number: CN201810997606.5A
Authority: CN
Inventors: 温志芬; 李薇; 周庆丰; 徐志超; 吴云燕; 曹永长
Original assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd; Sun Yat Sen University
Current assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd; Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN108904795A

Abstract

本发明属于兽医生物技术应用领域，具体涉及一种有效防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备方法，包括：病毒弱毒株冷冻干燥；将病毒的冻干粉离心造粒，得到装载有病毒弱毒株的微丸；将制得的微丸包被隔离包衣；将包被有隔离包衣的微丸包被肠溶包衣，即得口服疫苗。本发明制备出一种能耐受胃酸并有效刺激猪肠道黏膜免疫的PEDV新型口服疫苗，用于生产上防控PED，可以和饲料混合进行饲喂猪，操作更简便；大大降低了其他免疫方式如注射引起的应激、反饲的散毒风险等，更安全。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的口服疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物技术应用领域，具体涉及一种有效防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的急性、高度传染性疾病。感染PEDV的新生仔猪出现腹泻、脱水、呕吐，病死率高。近年来，PED在世界范围内广泛流行，中国、美国、韩国、加拿大等国家相继暴发疫情，严重危害全球养猪业的发展。我国有29个省市自治区发生并流行PED，可导致新生仔猪死亡率高达100％，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。目前该病尚无有效的治疗方法，只能通过疫苗免疫防控为主。PEDV经口、鼻感染猪后，主要侵入猪的小肠上皮细胞，引起细胞损伤，肠绒毛萎缩、脱落，导致小肠吸收面积大幅度减少，无法正常吸收营养物质，最终引起仔猪腹泻、脱水而死。由于PEDV主要通过侵入猪肠道感染机体，机体黏膜免疫应答对于防控PEDV尤为重要，黏膜免疫产生的高亲和力sIgA可以有效阻止病原吸附黏膜和中和病原。因此，如何有效激发猪肠道黏膜免疫，对于防控PEDV感染至关重要。

目前为止，常见的PED疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗、转基因植物疫苗、以细菌、病毒为载体制备的基因工程疫苗以及亚单位疫苗等。其中，生产上正在使用的商品化疫苗包括哈尔滨维科生物的猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-轮状病毒三联活疫苗，以及武汉科前生物股份有限公司制备的猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗；这两种商品化疫苗免疫方式均为肠道外注射。此外，生产上也经常通过直接返饲发病仔猪肠内容物感染怀孕母猪，产生乳汁免疫，进而给予新生仔猪提供被动保护。但目前生产上使用的PED疫苗，不管是弱毒活疫苗还是灭活疫苗均采用肠道外免疫方式，激发猪肠道黏膜免疫的作用非常有限。此外，通过将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内容物，返饲人工感染怀孕母猪，可有效刺激机体产生针对PEDV的母源抗体，新生仔猪吮乳后，获得保护，大大降低了新生仔猪死亡率，同时缩短了PED的流行时间，效果显著，但返饲存在严重散毒风险，可能造成更大经济损失。而如果将PEDV弱毒活疫苗直接饲喂猪又容易受其体内胃酸破坏，进而影响免疫效果。因此，制备能有效且安全性好的PEDV新型口服疫苗已迫在眉睫。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种有效防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备方法。本发明为了克服现有疫苗无法避免胃酸破坏，不能很好的刺激猪肠道产生足够的PEDV特异性黏膜免疫的缺点，制备出一种能耐受胃酸并有效刺激猪肠道黏膜免疫的PEDV新型口服疫苗，为生产上防控PED奠定基础，也为防控其他猪肠道传染病提供新思路。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种有效防控猪流行性腹泻病毒口服疫苗的制备方法，包括：

1)、病毒弱毒株冷冻干燥；

2)、将病毒的冻干粉离心造粒，得到装载有病毒弱毒株的微丸；

3)、将步骤2)制得的微丸包被隔离包衣；

4)、将步骤3)包被有隔离包衣的微丸包被肠溶包衣，即得口服疫苗。

进一步的，步骤1)中，病毒弱毒株冷冻干燥的操作为：

1-1、将培养得到的病毒弱毒株过滤后与等体积的无菌冻干保护剂充分搅拌混匀；

1-2、开启冻干机进行预冻，待板温降至-50℃，将1-1中混合好的病毒液放入冻干机，进箱后保持-50℃，维持2h；

1-3、依次开启后箱降温、抽真空、开大蝶阀、开罗茨泵，使厢体真空度降至20pa并维持1h；

1-4：1h后加热200min使样品温度升至-7℃并维持至少1h；随后通过二次加热120min使所有样品升温至15℃后取出，得到的病毒冻干粉抽真空密封并置于4℃保存。

进一步的，步骤1-1中，所述冻干保护剂可以减少冷冻及干燥过程对病毒蛋白的影响，组成包括：10％脱脂奶粉、5％蔗糖以及85％的水。

进一步的，所述步骤2)中造粒操作包括：将病毒冻干粉与等质量的玉米淀粉充分混合作为物料，以500-3000g丸芯作为母核，50-100ml粘合剂在离心造粒机中进行离心造粒。

进一步的，冻干粉上样量为丸芯的1/10；粘合剂用量约为丸芯的1/10。

进一步的，所述丸芯为蔗糖丸芯、淀粉丸芯、乳糖丸芯、甘露醇丸芯、微晶纤维素丸芯等，从制备效果及对病毒的保护方面优选蔗糖丸芯。

进一步的，所述粘合剂为纯水或者HPMC。

进一步的，所述步骤2)中造粒具体操作为：打开离心造粒机，放入丸芯，设置转盘转速200r/m(转速/分钟)，进风风速0～3000r/m(优选700r/m)、排风风速0～3000r/m(优选900r/m)，物料温度25～45℃(优选28℃)，开启1KW加热，随后在雾化压力0.15mpa、蠕动泵转速10r/m的条件下将粘合剂喷洒到丸芯表面，待丸芯充分润湿后将病毒冻干粉加入上粉料筒中，启动病毒粉的上粉抖动送料，维持仪器的所有参数设置，待病毒粉全部粘合到丸芯表面即可停止蠕动和雾化，继续保持转盘转动和进风、排风风速，进行干燥约15min，即得到了装载有病毒的微丸。

进一步的，所述步骤3)中包被隔离包衣的操作包括：称取隔离包衣材料(优选半合成聚合物羟丙基甲基纤维素(HPMC))，以水为溶剂配置浓度4-6％的隔离包衣溶液，接着开启流化床包衣机，倒入步骤2)离心造粒得到的装载有病毒弱毒株的微丸，设置风机转速为0～2500r/m(优选1700r/m)，物料温度为25～45℃(优选28℃)，开启3KW加热，设置雾化压力0.15mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至20r/m将隔离包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣；待包衣增重约5％后停止蠕动泵蠕动，保持仪器其他参数设置不变，30℃继续干燥20min。

进一步的，所述步骤4)中包被肠溶包衣的操作为：

4-1、制备肠溶包衣液；

4-2、用4-1制得的包衣液包被步骤3)得到的包被有隔离包衣的微丸。

进一步的，所述肠溶包衣液为以滑石粉作为抗黏剂配置的水分散体聚合物，包括：滑石粉聚合物量25-50％、柠檬酸三乙酯聚合物量10％、L30D-55(尤特奇)水分散体增重30％、水余量。

进一步的，所述步骤4-2的操作为：设置风机转速0～2500r/m(优选1700r/m)，物料温度为25～35℃(优选28℃)，进风温度为30-32℃，开启3KW加热，设置雾化压力0.17mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至30r/m将肠溶包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣；待包衣增重约30％后停止蠕动泵蠕动，30℃流化干燥30min，即可。

进一步的，一种本发明方法所制备得到的PEDV口服疫苗，其粒径主要分布在为700-900um。

本发明有益效果：

与现有技术相比较，本发明制备的PEDV新型口服疫苗具有三方面的优点：

1)生产上若选择直接饲喂PEDV病毒液口服免疫，易受猪体内胃酸破坏影响免疫效果，而本发明制备的PEDV新型口服疫苗将PEDV弱毒株装载在蔗糖丸芯上，并添加可以抵抗胃酸的肠溶包衣材料，经过体外人工胃液处理，以及通过饲喂猪体内实验证实，本发明制备的PEDV新型口服疫苗能够耐受胃酸，有效保护PEDV弱毒株免受猪体内胃酸的破坏；并且可以有效刺激猪肠道黏膜免疫应答。

2)目前生产上使用的PEDV疫苗大都为肠道外免疫，无法刺激猪肠道产生足够的黏膜免疫应答，本发明制备的PEDV新型口服疫苗经口免疫可以有效到达猪肠道，进而充分刺激肠道发生黏膜免疫应答产生sIgA。

3)跟返饲相比，本发明在制备PEDV新型口服疫苗过程中可以根据需要选择发病猪场对应的PEDV流行毒株并且可以加以致弱，具有准确性和可操控性，避免了直接返饲PEDV存在的盲目性以及由于返饲强毒株带来的散毒风险。

此外，本发明制备的PEDV新型口服疫苗可以和饲料混合进行饲喂猪，大大降低了其他免疫方式如注射引起的应激。

附图说明

图1为PEDV弱毒株冻干粉。

图2为本发明的猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备工艺流程图。

图3为电子显微镜观察PEDV新型口服疫苗及粒径测定结果，其中：A：空白蔗糖丸芯；B：PEDV口服疫苗；C：PEDV口服疫苗粒径主要分布在为700-900um。

图4为PEDV新型口服疫苗体外耐酸情况；其中：A：经过人工胃酸处理的PEDV口服疫苗；B：在pH 6.8DMEM细胞培养基溶解释放的PEDV口服疫苗；C：PEDV冻干粉未经过人工胃酸处理TCID₅₀＝10^6.5，经过人工胃酸处理TCID₅₀＝0；PEDV口服疫苗未经过人工胃酸处理与经过人工胃酸处理后的病毒TCID₅₀无显著差异。

图5为PEDV新型口服疫苗体内耐酸情况：PEDV口服疫苗免疫断奶仔猪后第6天，100％(8/8)发生排毒；病毒液直接口服仅有25％(2/8)发生排毒。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例一本发明有效防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备

包括以下操作：

1、病毒冷冻干燥：将非洲绿猴肾(Vero)细胞大量培养的猪流行性腹泻病毒(PEDV)弱毒株用4层无菌纱布过滤后与等体积的无菌冻干保护剂(含10％脱脂奶粉、5％蔗糖)充分搅拌混匀。接着，开启冻干机进行预冻，待板温降至-50℃，将混合好的病毒液放入冻干机托盘，进箱后保持-50℃维持2h；之后依次开启后箱降温、抽真空、开大蝶阀、开罗茨泵；使厢体真空度降至20pa并维持1h；1h后加热200min使样品温度升至-7℃并维持超过1h，随后通过二次加热120min使所有样品升温至15℃后取出。得到的PEDV冻干粉抽真空密封并置于4℃冰箱保存、备用。

2、离心造粒：将PEDV冻干粉与等质量的玉米淀粉充分混合作为物料，以蔗糖丸芯作为母核，纯水作为粘合剂在离心造粒机中进行离心造粒。步骤如下：打开离心造粒机，放入蔗糖丸芯，设置转盘转速200r/m(转速/分钟)，进风风速700r/m、排风风速900r/m，物料温度28℃，开启1KW加热，随后在雾化压力0.15mpa、蠕动泵转速10r/m的条件下将纯水喷洒到蔗糖丸芯表面，待丸芯充分润湿后将病毒冻干粉加入上粉料筒中，启动病毒粉的上粉抖动送料，维持仪器的所有参数设置，待病毒粉全部粘合到蔗糖丸芯表面即可停止蠕动和雾化，继续保持转盘转动和进风、排风风速，进行干燥约15min，即得到了装载有PEDV的微丸。

3、隔离包衣：肠溶包衣材料一般呈酸性，为避免病毒粉直接接触肠溶材料导致失活，离心造粒制备的微丸需要在包被肠溶包衣材料前包被一层隔离包衣，从而将病毒与肠溶包衣充分隔开。在本发明中，隔离包衣选用半合成聚合物羟丙基甲基纤维素(HPMC)，并使用流化床包衣机进行包被。步骤如下：按要求称取一定量HPMC，以水为溶剂配置4％浓度隔离包衣溶液，接着开启流化床包衣机，倒入之前离心造粒得到的装载有PEDV的微丸，设置风机转速为1700r/m，物料温度为28℃，开启3KW加热，设置雾化压力0.15mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至20r/m将隔离包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣。待包衣增重约5％后停止蠕动泵蠕动，保持仪器其他设置不变30℃继续干燥20min。

4、肠溶包衣：称取滑石粉聚合物7.5g、柠檬酸三乙酯聚合物3g、加入129.5g水中高速1500r/m搅拌10min，接着缓慢(以倒入时搅拌中液体不溅出为标准)加入100g L30D-55(尤特奇)水分散体增重，继续中速500-800r/m搅拌，即得到浓度为12.5％的肠溶包衣液。将上一步包被有隔离包衣的微丸继续在流化床包衣机上包被肠溶包衣。步骤如下：设置风机转速1700r/m，物料温度为28℃，进风温度为30-32℃，开启3KW加热，设置雾化压力0.17mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至30r/m将肠溶包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣。待包衣增重约30％后停止蠕动泵蠕动，30℃流化干燥30min，即完成了整个口服微丸制备工艺得到PEDV新型口服疫苗。

实施例二本发明方法制得的疫苗功能检测

2.1体外耐酸检测：

称取2g NaCl、3.2g胃蛋白酶(12000U)充分溶解于900ml蒸馏水中配置得到人工胃液，之后加入浓HCL调节pH值至1.2，并定容至1L。采用小杯法(桨法)将制备好的PEDV新型口服疫苗置于智能溶出度试验仪小杯中，接着加入100mL人工胃液，37℃、100r/m搅拌2h。2h后倒掉人工胃液，用纯水清洗一遍转移至pH 6.8DMEM细胞培养基中进行溶解并进行活病毒滴度测定，结果见图4，其中PEDV冻干粉未经过人工胃酸处理TCID₅₀＝10^6.5，经过人工胃酸处理TCID₅₀＝0；PEDV口服疫苗未经过人工胃酸处理与经过人工胃酸处理后的病毒TCID₅₀无显著差异(参见图4C)。

2.2病毒滴度测定：

将生长良好的Vero细胞消化，按10⁴个细胞/100uL/孔接种于96孔细胞培养板。次日将经过人工胃酸处理的PEDV新型口服疫苗溶解于pH6.8DMEM细胞培养基中，作10倍倍比滴度稀释，每个稀释度作8个重复，接着去掉96孔板内的细胞培养液，PBS清洗2遍后将稀释好的病毒液按照100uL/孔从高稀释度到低稀释度的顺序依次加入细胞中，同时设置未经人工胃液处理的微丸、经人工胃酸处理的PEDV冻干粉为对照。之后将细胞培养板置于5％CO₂培养箱，37℃培养3-5天。3-5天后将培养板置于显微镜下观察细胞病变，记录所有病变的孔数，按照Karber法计算TCID₅₀，从而确定PEDV新型口服疫苗经人工胃液处理后是否存在活的病毒粒子。结果显示，本发明方法制备的PEDV新型口服疫苗经人工胃酸处理后，病毒滴度与未经人工胃酸处理的微丸无显著差异，表明PEDV新型口服疫苗能够耐受人工胃酸。

2.3体内耐酸检测：

按照表1将32头健康无腹泻(采集肛拭子、qRT-PCR检测PEDV阴性)、体重均一的断奶仔猪随机分成4组进行免疫。

表1实验动物分组与免疫

断奶仔猪于口服后第1、3、5、6、7天采集肛拭子，同样利用qRT-PCR检测PEDV排毒情况，从而评价PEDV新型口服疫苗在断奶仔猪体内的耐胃酸性情况。

荧光定量PCR(qRT-PCR)检测排毒情况:

1)病毒DNA/RNA提取

取1mL无菌1×PBS加入肛拭子中，于涡旋振荡器充分振荡、混合均匀，若暂时不用可冻于-80℃；若立即提取病毒RNA，按12000r/m室温离心1min，取上清备用；接着按照病毒RNA/DNA提取试剂盒提取病毒基因组，最后取50μL Nuclease Free Water进行洗脱，将洗脱得到的病毒RNA/DNA冻于-80℃、备用。

2)qRT-PCR检测

将提取得到的RNA按照PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒进行反转录得到cDNA。取4μL RNA、0.5μL dNTP Mixture及0.5μL Random 6mers加入PCR管内，按照程序65℃/5min，4℃保存在PCR仪上进行变性、退火反应；之后在上述反应液中依次加入2μL 5×PrimeScriptBuffer、0.25μL RNase Inhibitor、0.25μL PrimeScript RTase、2.5μL RNase Free dH₂O，接着于PCR仪上，按照如下反应程序：30℃/10min,42℃/1h,95℃/5min,4℃保存进行反转录反应。将反转录得到的cDNA按照表2进行PCR扩增，PCR反应在Applied Biosystem 7500Fast instrument PCR仪上进行；

表2 PCR扩增体系

成分	体积(μL)
		Thunderbird Probe qPCR Mix	10
ddH<sub>2</sub>O	7.46
		50×Rox reference dye	0.04
Probe	0.1
		上游引物	0.2
下游引物	0.2
		cDNA	2
Total	20

PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火/延伸40s，共40个循环。其中qRT-PCR特异性引物为：

上游引物:5'-GAATTCCCAAGGGCGAAAA-3'，

下游引物：5'-TTTTCGACAAATTCCGCATCT-3'，

探针为：5'-FAM-CGTAGCAGGCTTGCTTCGGACCCA-BHQ-3'。

由Invitrogen公司合成。同时以PEDV、PRRSV作为阴、阳性对照。最后根据Ct值确定肛拭子是否存在PEDV基因组，从而确定排毒情况，结果参见图5。

实施例三

参见实施例一的防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备方法，不同点在于：步骤2分别将病毒冻干粉与等质量的玉米淀粉、乳糖、糊精、甘露醇充分混合，其他步骤操作同实施例一。观察各冻干粉混合物的状态及后续工艺状况。

本发明方案中，冻干粉因为含有蔗糖奶粉很容易吸湿受潮成块状，玉米淀粉细度很细、吸湿性强，和冻干粉混合可以起稀释和吸湿的作用，保持冻干粉粉末流动状态，而且在肠溶阶段，淀粉可起崩解剂作用加速病毒在肠道释放。且用玉米淀粉上粉收率高，采用乳糖、糊精、甘露醇等粉末和冻干粉混合，都没有加入玉米淀粉的流动状态好，且这些粉末细度不够淀粉细，混合后上粉收率低。

实施例四

参见实施例一的防控猪流行性腹泻病毒新型口服疫苗的制备方法，不同点在于：步骤2分别采用蔗糖丸芯、淀粉丸芯和微晶纤维素丸芯作为母核，其他步骤操作同实施例一。分别制得口服疫苗备用。

选取生长状况一致的24头健康无腹泻(采集肛拭子、qRT-PCR检测PEDV阴性)、体重均一的断奶仔猪随机分成3组，分别使用上述采用蔗糖丸芯、淀粉丸芯和微晶纤维素丸芯作为母核制得的口服疫苗按相同的免疫程序进行免疫。结果显示：

蔗糖丸芯制成的口服疫苗：TCID₅₀＝10^6.0；淀粉丸芯制成的口服疫苗：TCID₅₀＝10^4.0；微晶纤维素丸芯制成的口服疫苗：TCID₅₀＝0。

本发明工艺中，温度及风速直接影响造粒及包衣的效率，理论上，温度及风速越高，液体蒸发越快，完成一次口服疫苗制备工艺需要的时间越短。但是温度太高，对病毒起到灭活作用，温度太低，喷液的速度不能过快从而造成一次制备工艺时间太长；风速过小不利于液体蒸发容易造成丸芯粘连，风速过大造粒时冻干粉损耗大，包衣时可能造成包衣喷雾干燥影响包衣效果。综述，本发明温度及风速都是最利于保持病毒活力及提高工艺效率的参数。

包衣增重主要由包衣后耐酸效果决定的。包衣增重不够时不能抵抗胃酸的消化，但增重太大也会增加溶出的时间。实验数据表明，当增重为10％时，制备的口服疫苗人工胃液处理后，TCID₅₀＝0；增重20％时，制备的口服疫苗人工胃液处理后，TCID₅₀＝10^3.5；增重30％时，制备的口服疫苗人工胃液处理后，TCID₅₀＝10^6.0，与未经人工胃液处理的口服疫苗无显著差异，故本发明选择肠溶包衣增重30％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒口服疫苗的制备方法，其特征在于，步骤包括：

1）、病毒弱毒株冷冻干燥；

2）、将病毒的冻干粉离心造粒，得到装载有病毒弱毒株的微丸；所述造粒为将病毒冻干粉与等质量的玉米淀粉充分混合作为物料，以丸芯作为母核，加入粘合剂在离心造粒机中进行离心造粒；所述丸芯为蔗糖丸芯；造粒的参数为转盘转速200r/m，进风风速700r/m、排风风速900r/m，物料温度28℃，雾化压力0.15mpa，蠕动泵转速10r/m；

3）、将步骤2）制得的微丸包被隔离包衣；包被隔离包衣的操作包括：配置隔离包衣溶液，所述隔离包衣溶液以羟丙基甲基纤维素作为隔离包衣，以水为溶剂配置4%浓度隔离包衣溶液；接着开启流化床包衣机，倒入步骤2）离心造粒得到的装载有病毒弱毒株的微丸，设置风机转速为1700r/m，物料温度为28℃，开启3kw加热，设置雾化压力0.15mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至20r/m将隔离包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣；待包衣增重5%后停止蠕动泵蠕动，保持仪器其他参数设置不变，30℃继续干燥20min；

4）、将步骤3）包被有隔离包衣的微丸包被肠溶包衣，即得口服疫苗；

包被肠溶包衣的操作为：

4-1、制备肠溶包衣液；称取滑石粉聚合物7.5g、柠檬酸三乙酯聚合物3g、加入129 .5g水中高速1500r/m搅拌10min，接着缓慢加入100g L30D-55水分散体增重，继续中速500-800r/m搅拌，即得到浓度为12.5％的肠溶包衣液；

4-2、用4-1制得的包衣液包被步骤3）得到的包被有隔离包衣的微丸；具体操作为：设置风机转速1700 r/m，物料温度为28℃，进风温度为30-32℃，开启3kw加热，设置雾化压力0.17mpa，待物料温度稳定在28℃时，打开蠕动泵，逐步提高转速至30r/m将肠溶包衣液泵入流化床中对微丸进行底喷包衣；待包衣增重30%后停止蠕动泵蠕动，30℃流化干燥30min即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，病毒弱毒株冷冻干燥的操作为：

1-2、开启冻干机进行预冻，待板温降至-50℃，将1-1中混合好的病毒液放入冻干机，进箱后保持-50℃,维持2 h；

1-3、依次开启后箱降温、抽真空使厢体真空度降至20pa并维持1h；

1-4：1h后加热200 min使样品温度升至-7℃并维持至少1h；随后通过二次加热120 min使所有样品升温至15℃后取出，得到的病毒冻干粉抽真空密封并置于4℃保存。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1-1中，所述冻干保护剂组成：10%脱脂奶粉、5%蔗糖以及85%的水。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干粉上样量为丸芯的1/10；粘合剂用量为丸芯的1/10。