CN108904517B - 抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用 - Google Patents

抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用，所述siRNA正义链的核苷酸序列用SEQ ID No.1所示，所述siRNA反义链的核苷酸序列用序列表中SEQ ID No.2所示。实验证明，抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA能明显特异性抑制人肺鳞状上皮癌细胞内Sestrin2的表达，将所述Sestrin2‑siRNA转染至人肺鳞状上皮癌细胞中，可明显抑制肺鳞状上皮癌细胞的线粒体功能，减少肺鳞状上皮癌细胞的增值率，增加肺鳞状上皮癌细胞凋亡率。

Description

抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA应用。
背景资料
肺鳞癌的是最主要的肺癌病理类型之一，其病例数占非小细胞肺癌的30％左右，经手术、放化疗等综合治疗后，其5年生存率仍低于15％。近年来，分子靶向治疗是肺鳞状上皮细胞癌的重点突破方向，许多潜在治疗靶点及相应靶向药物不断被发现并应用于临床前期阶段，如PI3K/AKT/mTOR通路及其抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)及EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)等，使肺鳞癌的个体化靶向治疗成为可能。
亮氨酸是重要的蛋白质合成原料，同时也可作为信号分子参与调节包括饱感、胰岛素分泌、骨骼肌合成代谢等多种生理活动。Sestrin2作为一种亮氨酸感受器，调控了包括自噬在内的多种细胞功能；同时作为过氧化物还原酶或者过氧化物酶减少细胞内ROS，促进细胞的存活。然而，目前关于Sestrin2与恶性肿瘤特别是肺癌关系的研究仅限于流行病学调查的零星报道。Sestrin2对肺鳞状上皮细胞癌的调控作用还未见相关报道。此外，目前也并没有发现针对Sestrin2促进肺鳞状上皮癌细胞凋亡的相关技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用，所述siRNA正义链的核苷酸序列用SEQ ID No.1所示，所述siRNA反义链的核苷酸序列用序列表中SEQID No.2所示。
正义链：5’to 3’AUAGUCAUCAUAUCUGAUGCC(SEQ ID No.1)；
反义链：5’to 3’CAUCAGAUAUGAUGACUAUGA(SEQ ID No.2)。
本发明的优点：
实验证明，抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA(简称Sestrin2-siRNA)能明显特异性抑制人肺鳞状上皮癌细胞内Sestrin2的表达，将所述Sestrin2-siRNA转染至人肺鳞状上皮癌细胞中，可明显抑制肺鳞状上皮癌细胞的线粒体功能，减少肺鳞状上皮癌细胞的增值率，增加肺鳞状上皮癌细胞凋亡率。
附图说明
图1为siRNA抑制Sestrin2的表达的结果；其中各标号代表：1：对照组；2：1194位点的siRNA；3：1207位点的siRNA；4:1204位点的siRNA(*与对照组相比较p<0.05)。
图2为Sestrin2-siRNA对线粒体膜电位的影响(*与对照组相比较p<0.05)。
图3为Sestrin2-siRNA对肺鳞状上皮癌细胞增殖的影响(*与对照组相比较p<0.05)。
图4为Sestrin2-siRNA对肺鳞状上皮癌细胞凋亡的影响(*与对照组相比较p<0.05)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进一步说明。
以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。
实施例1 Sestrin2-siRNA的来源
(1)Sestrin2-siRNA设计
从Sestrin2蛋白的转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有义链1位为G或C,19位为A或U,有义链15～19至少有3个A或U,或13～19至少有5个A或U。
根据以下原则：GC含量在30％—50％左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效；将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列及EST同源的序列。最后将靶点定位为1194、1204、1207三个位点进行化学合成siRNA。并合成阴性对照的siRNA。
1194位点的siRNA：正义链：5’to 3’UAUCUGAUGCCAAAGACGCAG(SEQ ID No.3)；
反义链：5’to 3’GCGUCUUUGGCAUCAGAUAUG(SEQ ID No.4)；
1204位点的siRNA：正义链：5’to 3’AUAGUCAUCAUAUCUGAUGCC(SEQ ID No.1)；
反义链：5’to 3’CAUCAGAUAUGAUGACUAUGA(SEQ ID No.2)；
1207位点的siRNA：正义链：5’to 3’AUCAUAGUCAUCAUAUCUGAU(SEQ ID No.5)；
反义链：5’to 3’CAGAUAUGAUGACUAUGAUUA(SEQ ID No.6)。
上述siRNA委托上海吉玛制药技术有限公司直接合成。
(2)退火
寡核苷酸酸进行退火，用TE缓冲液将所合成的寡核苷酸溶解为1μg/μl，取对应的寡核苷酸各2μl加去离子水至50μl，使寡核苷酸终浓度为40ng/μl，加热至90℃保持3分钟，放置37℃水浴15分钟退火。
(3)抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA的筛选
将上述合成的siRNA用Lipofectamine 2000(invitrogen)转入人肺鳞癌细胞株NCI-H226(ATCC，CRL-5826TM，购买时间：2017年9月，国家：USA，机构ATCC，联系人，网址https://www.atcc.org/Products/All/CRL-5826.aspx)中，具体操作步骤详见Lipofectamine 2000(invitrogen)说明书。
将转染的细胞消化收集后提取细胞蛋白，进行Western blot检测Sestrin2与GAPDH的表达。结果如图1所示，1204位点的siRNA可以明显抑制Sestrin2的表达。1204位点的siRNA正义链的核苷酸序列用SEQ ID No.1所示，反义链的核苷酸序列用序列表中SEQ IDNo.2所示，本说明书中称为：一种抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA(简称Sestrin2-siRNA)。
实施例2抑制Sestrin2表达对人肺鳞癌细胞的影响
将上述Sestrin2-siRNA用Lipofectamine 2000(invitrogen)转入人肺鳞癌细胞株(NCI-H226)中。具体操作步骤详见Lipofectamine 2000(invitrogen)说明书。48小时后，收集细胞，用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(博士德，AR1156)检测细胞的增殖；或者收集细胞，用JC-1(Solarbio，M8650)进行染色，流式细胞术检测线粒体膜电位。或者收集细胞，70％的乙醇固定细胞过夜后用PI染色液(leagene公司，DA0021)进行染色，流式细胞术检测细胞凋亡。
具体结果如下：
1)流式细胞术检测Sestrin2-siRNA转染对人肺鳞癌细胞线粒体膜电位的影响，结果显示：Sestrin2-siRNA转染至人肺鳞癌细胞后，可导致人肺鳞癌细胞线粒体膜电位明显下降(图2)。
2)MTT检测Sestrin2-siRNA转染对人肺鳞癌细胞增殖的影响，结果显示：Sestrin2-siRNA转染至人肺鳞癌细胞后，可明显抑制人肺鳞癌细胞的增殖(见图3)。
3)流式细胞术检测Sestrin2-siRNA转染对人肺鳞癌细胞凋亡的影响，结果如图4所示：Sestrin2-siRNA转染至人肺鳞癌细胞后，导致人肺鳞癌细胞凋亡率显著升高。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
auagucauca uaucugaugc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caucagauau gaugacuaug a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
uaucugaugc caaagacgca g 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgucuuugg caucagauau g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
aucauaguca ucauaucuga u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagauaugau gacuaugauu a 21

Claims (1)

1.抑制Sestrin2蛋白表达的siRNA在制备抗肺鳞状上皮癌药物中的应用，所述siRNA正义链的核苷酸序列用SEQ ID No.1所示，所述siRNA反义链的核苷酸序列用序列表中SEQ IDNo.2所示。
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Sestrin2 Protein Positively Regulates AKT Enzyme Signaling and Survival in Human Squamous Cell Carcinoma and Melanoma Cells;Baozhong Zhao等;《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20141226;第289卷(第52期);35806-35814 *
应激诱导蛋白Sestrin2研究进展;王丽雪等;《生理科学进展》;20180425(第02期);139-143 *

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