CN108892735A - 一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用 - Google Patents

一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用。本发明的白芨寡糖聚合度为2‑20，分子量范围为200‑5000Da。本发明的白芨寡糖具有促进血管细胞迁移，促进血管细胞成管，促进离体血管成管的活性，并呈一定量效关系。本发明的白芨寡糖可用于改善因血管生成不良的疾病以及冠心病、心肌梗死、脑梗塞、血管闭塞性血栓性脉管炎等血管新生受抑制的疾病。

Description

一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用。
背景技术
功能糖是一类不能提供能量但具有功能调节活性的糖链或糖链衍生物。功能糖根据糖单元的聚合度可分为功能寡糖(聚合度为2-20)与功能多糖(聚合度大于20)。目前已上市的功能糖产品主要以多糖为主(如菊粉、低聚果糖)，并在食品、医药及农业等领域被广泛应用。与多糖相比，功能寡糖因其易吸收、体内可降解、无毒副作用、生物兼容性更好等，近年来日益受到关注。血管新生与血管内皮细胞的关系极其密切，主要分为两种类型：一种是在胚胎期，由血管母细胞通过原位分化增殖形成初步的血管网络结构，即血管形成；另一种是在已有血管网络结构的基础上，经过内皮细胞的迁移、增生，最后以芽生的方式扩展出更多的血管网，称为血管生成。血管新生是机体组织修复的基础，近年来的研究发现，临床实践中常用的一些中药可影响血管新生的环节，从天然药物尤其传统中药中寻找治疗性血管新生药物一直受到药物研发的高度关注。
白芨(Bletilla striata)，为兰科植物白芨的干燥块茎，气微，味苦，嚼之有黏性。多年生草本，其味甘，气薄而味浓。白芨的药用迄今已有数千年历史，其主要成份为联苄类和糖苷类化合物。白芨主要作为医药辅料和生物材料的原料，被广泛应用于食品、医药、日用化工等领域，具有很高的经济效益，并在贵州、云南、湖北等省被各级政府作为精准扶贫项目大力推广。然而，随着白芨人工栽培技术的成熟，目前的全国种植面积超过10万亩，但市场需求并没有大的增加，预期在未来几年内白芨的市场价格将一路下跌。因此，白芨的深度开发已成为白芨产业亟需解决的行业问题和技术难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用。
提供一种白芨寡糖，所述白芨寡糖的聚合度为2-20，分子量范围为200-5000Da。
提供了一种白芨寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)白芨块茎经研磨成粉，白芨粉末与水按一定比例混合，在一定温度条件下浸润抽提一定时间；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置一定时间；
(3)步骤(2)所得沉淀用水复溶，加入一定浓度的强酸或多糖水解酶降解，加入碱性试剂或升温终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
按上述方案，步骤(1)中白芨块茎经研磨成粉的粒径大于70目。
按上述方案，所述多糖水解酶包括葡萄糖糖苷类水解酶如葡聚糖酶、甘露糖糖苷类水解酶如甘露聚糖酶、半乳糖糖苷类水解酶等。
优选的，所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入10-60倍体积水进行混合，在10-100℃条件下浸润抽3-12h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置8-24小时，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成0.8％-5％的溶液，加入浓度0.5-3M的强酸或多糖水解酶在25-50℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加1-30mg多糖水解酶；所述强碱可为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等。更优选的，所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入20-40倍体积水进行混合，在20-90℃条件下浸润抽4-8h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-80％乙醇，静置12-20h，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成1％-3％的溶液，加入浓度1-2M的强酸或多糖水解酶在25-40℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉(即为白芨寡糖)；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加2-20mg多糖水解酶。
另一方面，本发明提供上述白芨寡糖在制备促进血管新生药物中的应用。
本发明还提供上述白芨寡糖在制备改善血管新生异常的药物中的应用。
本发明还提供上述白芨寡糖在制备用于治疗血管新生受抑制的疾病的药物中的应用。
具体地，所述的血管新生受抑制的疾病包括冠心病、心肌梗死、脑梗塞、血管闭塞性血栓性脉管炎等疾病。
本发明的有益效果：本发明通过利用人脐静脉内皮细胞和小鼠主动脉环体外培养模型对白芨寡糖进行促血管新生活性研究，实验结果表明，一定浓度的白芨寡糖能显著诱导人脐静脉内皮细胞迁移，促进人脐静脉内皮细胞管腔结构形成，主动脉体外血管新生，即具有促进血管细胞迁移，促进血管细胞成管，促进离体血管成管的活性，并呈现一定的量效关系(白芨寡糖的一般用量为25-100μg/ml，优选用量为50-100μg/ml)。白芨寡糖在体内、体外实验中均具有显著的促血管新生活性，可进一步开发用于改善血管新生异常的疾病或其它情况。
附图说明
图1.酸水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图，结果表明：酸水解法制备的白芨寡糖的主要成分为三糖、四糖、五糖，其中：1三糖，2四糖，3五糖，经分析计算：三糖、四糖、五糖所含比例分别为40％，30％，20％，分子量200-1000；
图2.酶水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图，酶水解法制备的白芨寡糖的的主要成分为三糖、四糖、五糖，其中：1三糖，2四糖，3五糖，经分析计算：三糖、四糖、五糖所含比例分别为28％，49％，20％，分子量200-1000；
图3.实施例2的白芨寡糖对内皮细胞迁移的影响(Ctrl，BO-25μg/ml，BO-50μg/ml，BO-100μg/ml，分别指对照组和经25、50、100μg/ml白芨寡糖加药组。该结果显示，与对照组相比，加药组的细胞迁移能力显著增强，且与药物浓度成正相关)；
图4.实施例2的白芨寡糖对内皮细胞管腔形成的作用(Ctrl，BO-25μg/ml，BO-50μg/ml，BO-100μg/ml，分别指对照组和经25、50、100μg/ml白芨寡糖加药组。该结果显示，与对照组相比，加药组的内皮细胞官腔形成的数量明显增多，且呈一定剂量依赖性)；
图5.实施例2的白芨寡糖对主动脉环体外成管的促进作用(Ctrl，BO-25μg/ml，BO-50μg/ml，BO-100μg/ml，分别指对照组和经25、50、100μg/ml白芨寡糖加药组。该结果显示，与对照组相比，加药组的主动脉内皮细胞出芽数大幅提高，且呈一定剂量依赖性)；
具体实施方式
如下为本发明的实施例，其仅用作对本发明的解释而并非限制。
实施例1强酸法制备白芨寡糖
在本实施例中，提供一种强酸水解法制备白芨寡糖的方法，具体实施步骤如下：
(1)取25g白芨块茎研磨成80目粉末，加入500ml的水混匀，在80℃条件下溶解抽提8h，得到抽提液；
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤，截留沉淀后获得滤出液，减压蒸馏成得到50ml的浓缩液；
(3)步骤(2)所述浓缩液加入150ml的95％乙醇，静置过夜12h。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤，截留后获得沉淀物；
(5)步骤(4)所述沉淀物复溶后，加入三氟乙酸(终浓度为1.0M)50℃进行水解2h，然后使用一定氨水中和其水解产物，直到pH到达6-8，减压浓缩后，冻干成白芨寡糖干粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图1所示。
实施例2酶解法制备白芨寡糖
在本实施例中，提供多糖水解酶制备白芨寡糖的一种方法，具体实施步骤如下：
(1)取40g白芨经块研磨料粉末，加入600ml的水混匀，在40℃条件下溶解抽提12h，得到抽提液；
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤，截留沉淀后获得滤出液，减压蒸馏成得到60ml的浓缩液；
(3)步骤(2)所述浓缩液加入200ml的90％乙醇，静置过夜。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤，截留后获得沉淀物；
(5)步骤(4)所述沉淀物加50ml水复溶，加入1g甘露聚糖酶，在pH 6.8条件下40℃水解4小时，加入一定0.1M氢氧化钠溶液直到pH到达10终止反应；
(6)向步骤(5)所述反应液80℃加热10min，过滤所得滤液冻干成粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图2所示。
实施例3白芨寡糖促进血管内皮细胞的迁移作用
在本实施例中，为评价实施例2的白芨寡糖对血管是否有促进作用，本发明采用原代人脐静脉内皮细胞为血管细胞模型，分别利用0、25、50、100μg/ml的白芨寡糖处理细胞，观察该细胞的迁移情况。具体步骤如下：
(1)将人脐静脉内皮细胞细胞培养至融合成单层。
(2)PBS洗后换无血清饥饿24h。
(3)用1ml蓝枪头在单层细胞上划出一道划痕，培养液洗细胞2遍。
(4)对照组加入PBS，药物处理组加入25、50及100μg/ml白芨寡糖，继续培养12h。
(5)显微镜下拍摄各实验组内皮细胞的迁移变化，并用Photoshop软件计算细胞覆盖的面积。
实验结果见附图3。该结果显示，加药组的损伤面积均比对照组明显缩小，具有统计学意义(**P<0.01)。表明，白芨寡糖能显著诱导人脐静脉内皮细胞迁移，并呈现一定的量效关系。
实施例4白芨寡糖促进内皮细胞管腔形成
在本实施例中，为评价实施例2的白芨寡糖是否可促进血管管腔形成，本发明采用原代人脐静脉内皮细胞为血管细胞模型，分别利用0、25、50、100μg/ml的白芨寡糖处理细胞，观察该细胞的官腔形成情况。具体步骤如下：
(1)将300μl Matrigel胶涂于24孔细胞培养板底部，37℃下培养1h使其成胶。
(2)选择生长旺盛、80％融合生长的内皮细胞消化备用。
(3)用含10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞浓度调整为2×105/ml，将细胞悬液加入铺有Matrigel Matrix的24孔板中，每孔500μl，实验组0、25、50、100μg/ml白芨寡糖，对照组加入生理盐水，每组设置3个复孔。
(4)将24孔板放入培养箱中，6h后在倒置显微镜下(×100)观察管腔形成情况，并拍照。
(5)每孔取5个视野计数管腔形成数，取平均值进行统计处理。
实验结果见附图4。结果显示，与对照组相比，加药组的管腔形成数目明显增多，小管间距变小并逐渐交织成网状结构。其中50和100μg/ml白芨寡糖组，管腔形成数与对照组比较，具有统计学意义(*P<0.05或0.01)，表明白芨寡糖能促进人脐静脉内皮细胞管腔结构形成。
实施例5白芨寡糖促进主动脉环体外成管
本实施例中，实施例2的白芨寡糖可促进对离体的主动脉环体外成管，具体实施步骤如下：
(1)取6周龄C57BL/6J小鼠，10％水合氯醛麻醉，用75％乙醇将体表消毒，转移至超净台内，将小鼠胸部沿一侧剪开，小心剥离***，切取3cm长的胸主动脉，迅速放入预冷的PBS(含100U/mL青霉素和100U/ml链霉素)，反复清洗，将血管内外表面的残余血细胞去除干净，用消毒后的锋利刀片切取1mm宽度的动脉环，选取大小相似的置于预冷的M199培养基中备用。
(2)在24孔板中加入稀释好的Matrigel胶(400μl/孔，用不含血清的M199培养基以1:1的比例稀释)，每孔随机植入1个动脉环，使其尽量置于孔的中央并紧贴孔底，于37℃、5％CO2，培养箱中放置30min，待胶凝固。
(3)每孔加入200μl含药培养基(0、25、50、100μg/ml白芨寡糖)，继续培养，隔天换液一次。
(4)6天后，在倒置显微镜下分别由4名不同观察者观察内皮细胞出芽情况并计数，取平均值进行统计处理。
实验结果见附图5。结果显示，与对照组相比，加药组的内皮细胞出芽数目明显增多，具有统计学意义(**P<0.01)，表明白芨寡糖能促进主动脉体外血管新生，并呈现一定的量效关系。

Claims (10)

1.一种白芨寡糖，其特征在于：所述白芨寡糖的聚合度为2-20，分子量范围为200-5000Da。
2.一种白芨寡糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)白芨块茎经研磨成粉，白芨粉末与水按一定比例混合，在一定温度条件下浸润抽提一定时间；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置一定时间；
(3)步骤(2)所得沉淀用水复溶，加入一定浓度的强酸或多糖水解酶降解，加入碱性试剂或升温终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
3.根据权利要求2所述的白芨寡糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中白芨块茎经研磨成粉的粒径大于70目。
4.根据权利要求2所述的白芨寡糖的制备方法，其特征在于：所述的多糖水解酶为葡聚糖酶或甘露聚糖酶；所述的强酸为三氟乙酸或盐酸或硫酸。
5.根据权利要求2所述的白芨寡糖的制备方法，其特征在于：所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入10-60倍体积水进行混合，在10-100℃条件下浸润抽3-12h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置8-24小时，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成0.8％-5％的溶液，加入浓度0.5-3M的强酸或多糖水解酶在25-50℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加1-30mg多糖水解酶。
6.根据权利要求2所述的白芨寡糖的制备方法，其特征在于：所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入20-40倍体积水进行混合，在20-90℃条件下浸润抽4-8h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-80％乙醇，静置12-20h，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成1％-3％的溶液，加入浓度1-2M的强酸或多糖水解酶在25-40℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加2-20mg多糖水解酶。
7.权利要求1所述的白芨寡糖在制备促进血管新生药物中的应用。
8.权利要求1所述的白芨寡糖在制备改善血管新生异常的药物中的应用。
9.权利要求1所述的白芨寡糖在制备用于治疗血管新生受抑制的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的血管新生受抑制的疾病为冠心病、心肌梗死、脑梗塞、血管闭塞性血栓性脉管炎。
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