CN108885215B - AKT-mTOR通路蛋白的检测和量化 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及质谱分析的领域。在一些实施方式中，本公开涉及用于通过免疫沉淀富集随后进行质谱分析来检测和量化AKT‑mTOR通路中蛋白质的组合物和方法。

Description

AKT-mTOR通路蛋白的检测和量化
本申请要求2016年3月14日提交的美国临时专利申请号62/308,051的优先权的权益，为了所有目的，其通过引用的方式整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及通过免疫沉淀和质谱来检测和量化AKT-mTOR通路蛋白，包括磷酸化的蛋白的领域。
背景技术
AKT-mTOR通路在肿瘤进展和抗癌症药物抗性中起到核心作用。量化测量AKT-mTOR通路的蛋白表达和转译后修饰对于精确表征癌症、监测癌症进展，以及确定治疗反应是必要的。见Logue, J. S.；Morrison, D. K.；《基因与发展（Genes Dev.）》2012年4月1日，26（7）, 641–50。
检测和量化AKT-mTOR通路蛋白的主要限制是缺少严格验证的方法和试剂。目前，仅可使用来自蛋白质印迹、ELISA以及Luminex试验的半定量结果。质谱（MS）逐渐成为被选择用来分析蛋白质丰度和转译后修饰的检测方法。但是，迄今为止，MS还未成功量化AKT-mTOR通路蛋白，可能是由于它们的低丰度和大量的转译后修饰特性。
免疫沉淀（IP）是通常在MS的上游用作低丰度蛋白质靶的富集工具。见，Gingras等人，《自然综述：分子细胞生物学（Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.》，2007年8月，8 （8），645–54；和Carr，S. A．等人，《分子与细胞蛋白质组学（Mol. Cell. Proteomics）》，2014年3月，13 （3），907–17。鉴定用于MS上游的IP的适当抗体很重要，因为并不是所有结合蛋白质的抗体都是有效的免疫沉淀工具，而且，并不是所有作为有效的免疫沉淀工具的抗体都能通过MS成功鉴定。
发明内容
本公开提供了用于通过免疫沉淀（IP）、质谱（MS）以及免疫沉淀随后质谱（IP-MS）来检测和量化AKT-mTOR通路蛋白的试剂和方法。
在一些实施方式中，提供了用于免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白（靶蛋白）的方法，其包括使生物样品接触表1中列举的任何一种抗体。在一些实施方式中，用于IP方法的抗体包括表8中列举的抗体。在一些实施方式中，用于IP方法的抗体包括表9中列举的抗体。方法可包括冲洗接触的生物样品，以富集抗体-蛋白质缀合物。进一步，方法包括检测抗体-蛋白质缀合物（免疫沉淀的靶蛋白质），以确定生物样品中的AKT-mTOR通路蛋白。在一些实施方式中，抗体是标记的。在一些实施方式中，为富集的抗体-蛋白质缀合物提供检测试剂。在一些实施方式中，标记为生物素并且检测试剂为链霉亲合素。
在一些实施方式中，IP为单重的。在一些实施方式中，IP为多重的。用于多重的IP的抗体可包括表8和表9的抗体。
在一些实施方式中，提供了用于经MS检测AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括从生物样品分离蛋白质，分解分离的蛋白质，经质谱分析分解的蛋白质以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，以及确定样品中一种或多种AKT-mTOR通路蛋白的身份。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中，肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO:213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。
在一些实施方式中，提供了用于经MS量化AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括从生物样品分离蛋白质，分解分离的蛋白质，经质谱分析分解的蛋白质以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，以及确定样品中一种或多种AKT-mTOR通路蛋白的数量。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中，肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO:213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，提供了用于经IP-MS检测AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括用至少一种能够免疫沉淀来自生物样品的AKT-mTOR靶通路蛋白的抗体处理生物样品，分解分离的蛋白质，经质谱分析分解的蛋白质以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，以及确定样品中一种或多种AKT-mTOR通路蛋白的身份。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO:424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中SEQID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，提供了用于经IP-MS量化AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括用至少一种能够免疫沉淀来自生物样品的AKT-mTOR靶通路蛋白的抗体处理生物样品，分解分离的蛋白质，经质谱分析分解的蛋白质以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，以及确定样品中一种或多种AKT-mTOR通路蛋白的数量。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO:424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中SEQID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，AKT-mTOR通路靶蛋白为磷酸化的。
提供了用于确定磷酸化的与非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的比率的方法，其包括上述IP、MS或MS-IP方法的任何一种，其中提供了确定磷酸化的与非磷酸化的蛋白的比率的进一步的步骤。在一些实施方式中，方法是MS-IP方法，其包括用一种或多种能够免疫沉淀一种或多种磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的抗体处理生物样品，和用一种或多种能够免疫沉淀至少一种或多种相同或不同非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的抗体分别处理相同的生物样品；分解免疫沉淀的AKT-mTOR通路蛋白；将已知量的第一和第二可检测地标记的内部标准肽添加至分解的蛋白质中，其中第一内部标准肽具有与用于鉴定磷酸化的蛋白的磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列，并且第二内部标准肽具有与用于鉴定非磷酸化的蛋白的非磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列；经质谱分析分解的蛋白质和内部标准品，以确定磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的存在和数量，其中AKT-mTOR通路肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的肽，并且长度小于40个氨基酸；确定样品中AKT-mTOR磷酸化的和非磷酸化的通路蛋白的数量，和确定磷酸化的与非磷酸化的通路蛋白的比率。在一些实施方式中，用于AKT-mTOR通路蛋白的肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ IDNO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，生物样品为人。在一些实施方式中，生物样品为非人。在一些实施方式中，生物样品为哺乳动物。在一些实施方式中，生物样品来自大鼠、小鼠、荷兰猪、仓鼠、母牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫或非人灵长类。
在利用AKT-mTOR通路肽的实施方式中，肽可用可检测的标记修饰。可检测的标记可包括同位素，比如重同位素，比如本领域技术人员已知的那些，包括13C、15N、2H和18O。在一些实施方式中，修饰/标记的肽包括SEQ ID NO: 213-424的肽。在一些实施方式中，肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，修饰/标记的肽由SEQ ID NO: 213-424的肽组成。在一些实施方式中，修饰/标记的肽由SEQ ID NO: 213-424的肽组成，其中肽是进一步修饰的。
在一些实施方式中，用于IP的抗体选自由表1中列举的抗体所组成的群组。在一些实施方式中，用于IP的抗体是具有表1的任何抗体的六个CDR的抗体。抗体可能能够免疫沉淀多于一种AKT-mTOR通路蛋白。在一些实施方式中，抗体是标记的或能够被标记的。标记可为本领域技术人员已知的任何标记，包括酶和荧光标记，比如生物素。在一些实施方式中，多于一种抗体用于多重的IP。在一些实施方式中，多重的IP包括表8的抗体。在一些实施方式中，多重的IP包括表9的抗体。
在一些实施方式中，两种或更多种抗体用于分析一种生物样品。例如，第一抗体能够免疫沉淀磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，第二抗体能够免疫沉淀被第一抗体沉淀的非磷酸化形式的AKT-mTOR通路蛋白。在一些实施方式中，单个抗体能够免疫沉淀磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白。
在一些实施方式中，免疫沉淀包括用能够结合AKT-mTOR通路蛋白的标记的抗体来处理样品，以提供标记的抗体-蛋白质缀合物。所述方法可另外包括使标记的抗体-蛋白质缀合物接触能够结合标记的抗体的捕获试剂，以从样品分离通路蛋白。标记可为生物素并且捕获试剂可为链霉亲和素。
AKT-mTOR通路蛋白的数量可通过将已知量的内部标准肽添加至分解蛋白质，然后进行质谱而确定。在一些实施方式中，内部标准肽具有与AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，内部标准品被可检测地标记。所述方法可另外包括通过与内部标准品比较而确定AKT-mTOR通路肽的数量。
在一些实施方式中，内部标准肽包括SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中，肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，肽由SEQ ID NO: 1 - SEQID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO:424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，量化AKT-mTOR通路蛋白包括比较样品中AKT-mTOR通路肽的数量与对照样品中相同AKT-mTOR通路肽的数量。
量化AKT-mTOR通路蛋白可包括比较AKT-mTOR通路肽的数量与已知量的内部标准肽，其中生物样品中的肽和内部标准肽二者都包括SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 424，其中标准肽被可检测地标记，并且其中肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，标准肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO:213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，质谱选自串联质谱和发现质谱。靶向的质谱可选自多反应监测（MRM）、选择反应监测（SRM）和平行反应监测（PRM），或其组合。
在一些实施方式中，生物样品选自分离的人细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织和肿瘤组织。
在一些实施方式中，所述方法另外包括量化AKT-mTOR通路蛋白的相对量。在一些实施方式中，方法另外包括量化AKT-mTOR通路蛋白的绝对量。
在一些实施方式中，分解包括蛋白酶或化学分解。在一些实施方式中，分解可为单次的或相继的。蛋白酶分解可包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
化学切割可包括CNBr、邻亚碘酰苯甲酸盐或甲酸。
在一些实施方式中，分解为用胰蛋白酶的蛋白酶分解。
在一些实施方式中，所述方法另外包括在分解之后和进行质谱之前脱盐。
AKT-mTOR通路蛋白可选自AKT1 （UniProtKB - P31749）、AKT2（UniProtKB -P31751）、IR（也称为INSR）（UniProtKB P06213）、IGF1R（UniProtKB - P08069）、IRS1（UniProtKB - P35568）、TSC2（UniProtKB - P49815）、mTOR（UniProtKB - P42345）、GSK3a（UniProtKB - P49840）、GSK3b（UniProtKB - P49841）、GSK3a/GSK3b、p70S6K（也称为RPS6KB1）（UniProtKB - P23443）、RPS6（UniProtKB - P62753）、PRAS40（也称为AKT1S1）（UniProtKB - Q96B36）和PTEN （UniProtKB - P60484）。
在一些实施方式中，AKT-mTOR通路是与下述任何相互作用的蛋白：AKT1（UniProtKB - P31749）、AKT2（UniProtKB - P31751）、IR（也称为INSR）（UniProtKBP06213）、IGF1R （UniProtKB - P08069）、IRS1（UniProtKB - P35568）、TSC2（UniProtKB -P49815）、mTOR（UniProtKB - P42345）、GSK3a（UniProtKB - P49840）、GSK3b（UniProtKB -P49841）、GSK3a/GSK3b、p70S6K（也称为RPS6KB1）（UniProtKB - P23443）、RPS6 （UniProtKB- P62753）、PRAS40（也称为AKT1S1）（UniProtKB - Q96B36）和PTEN （UniProtKB -P60484）。
在一些实施方式中，AKT-mTOR通路蛋白为磷酸化的。
在一些实施方式中，可被检测的AKT-mTOR蛋白质的浓度的范围为约0.08 fmol至约2000 fmol。
在一些实施方式中，检测下限为约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25 fmol。检测下限可在约0.05至0.25 fmol的范围内。
在一些实施方式中，定量下限为约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70或0.75 fmol。定量下限可在约0.05至0.75 fmol的范围内。
包括试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种能够免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的抗体。
也提供了试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种能够免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的抗体，和用于进行质谱的试剂，以检测AKT-mTOR通路蛋白。
也包括试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种能够免疫沉淀AKT-mTOR通路靶蛋白的抗体，和用于进行质谱的试剂，以量化AKT-mTOR通路蛋白。
包括在试剂盒中的抗体可选自表1中列举的任何一种或多种抗体。在一些实施方式中，抗体是标记的或能够被标记的。标记可为本领域技术人员已知的任何标记，包括酶和荧光标记，比如生物素。在一些实施方式中，试剂盒包括大于一种抗体。在一些实施方式中，试剂盒包括选自表8中列举的抗体中的两种或更多种抗体。在一些实施方式中，试剂盒包括选自表9中列举的抗体中的两种或更多种抗体。在一些实施方式中，试剂盒包括选自表8中列举的抗体中的两种或更多种抗体和选自表9中列举的抗体中的两种或更多种抗体。在一些实施方式中，试剂盒包括表8、表9，或表8和9中列举的各抗体。
试剂盒可进一步包括AKT-mTOR通路肽。在一些实施方式中，肽包括SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 424的序列。在一些实施方式中，肽的长度小于40个氨基酸。在一些实施方式中，肽由SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 424的序列组成。SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽可为标记的。在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212上的标记不同于SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽上显示的标记。在一些实施方式中，肽包括选自表5中显示的肽的肽或由其组成（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。
在一些实施方式中，试剂盒可包括选自SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽中的至少一种肽，其中肽小于或等于40个氨基酸。在一个实施方式中，试剂盒包括由SEQ IDNO: 213 - SEQ ID NO: 424的肽组成的至少一种肽。
试剂盒中提供的肽可为可检测地标记的或能够被修饰以被可检测地标记。在一些实施方式中，试剂盒可包括选自SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 212的肽中的至少一种肽，其中肽被可检测地标记或能够被修饰以被可检测地标记。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括能够分解免疫沉淀的蛋白质样品的蛋白酶或化学试剂。蛋白酶试剂可为胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。化学试剂可为CNBr、邻亚碘酰苯甲酸盐或甲酸。
可用于检测AKT-mTOR通路蛋白的试剂盒，包括AKT1 （UniProtKB - P31749）；AKT2（UniProtKB - P31751）、IR（也称为INSR）（UniProtKB P06213）、IGF1R（UniProtKB -P08069）、IRS1（UniProtKB - P35568）、TSC2（UniProtKB - P49815）、mTOR（UniProtKB -P42345）、GSK3a（UniProtKB - P49840）、GSK3b（UniProtKB - P49841）、GSK3a/GSK3b、p70S6K（也称为RPS6KB1）（UniProtKB - P23443 （KS6B1_HUMAN））、RPS6（UniProtKB -P62753）、PRAS40 （也称为AKT1S1）（UniProtKB - Q96B36）和PTEN（UniProtKB - P60484）。
通过试剂盒检测和量化的AKT-mTOR蛋白可为磷酸化的。
也包括表1中列举的用于免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的抗体。抗体可用于包括免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白然后经质谱分析蛋白质的方法。
包括选自表3的肽的AKT-mTOR通路肽。AKT-mTOR通路肽可用于检测和量化生物样品中的AKT-mTOR通路蛋白的方法。AKT-mTOR通路肽可用于包括免疫沉淀来自生物样品的AKT-mTOR通路蛋白，和经质谱分析免疫沉淀的蛋白质的方法。
附图说明
图1显示了AKT-mTOR通路蛋白的示意图。
图2显示了用于免疫沉淀-富集的质谱试验，以鉴定AKT-mTOR通路蛋白的一个代表性流程。
图3显示了来自从A549细胞富集低丰度AKT-mTOR通路蛋白的实验的结果。
图4显示了肽对于12 AKT-mTOR通路蛋白的检测和量化界限。
图5显示了对于10个磷酸化的和11个总计的AKT-mTOR通路蛋白，多重免疫沉淀加nanoLC-MS/MS试验的结果。
图6显示了来自多重免疫沉淀加nanoLC-PRM/MS试验AKT-mTOR通路蛋白的代表性结果。深灰色柱为A549细胞，浅灰色柱为HCT116细胞。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F和7G显示了IGF刺激（深灰色）和非刺激（浅灰色）细胞中检测AKT-mTOR通路蛋白的各种方法的比较，包括Luminex、ELISA、蛋白质印迹和IP-质谱试验。图7E-7H显示了根据所有4种技术的磷酸化的IGF1R的量化。
图8显示了两个不同细胞系中，存在和不存在免疫沉淀富集情况下，使用质谱方法进行的AKT-mTOR通路蛋白鉴定和量化的总结。
图9显示了总AKT-mTOR通路靶的技术相关性。
图10显示了对于磷-AKT-mTOR通路靶的技术相关性。
图11显示了AKT-mTOR通路靶的IP至蛋白质印迹验证。
具体实施方式
本说明书和示例性实施方式不应视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另外指出，表示数量、百分数或比例的所有的数值，和本说明书和权利要求中使用的其他数值，在所有情况下应理解为被术语“约”修饰，至它们还未如此修饰的程度。因此，除非相反指出，在下面说明书和所附权利要求中阐释的数值参数是近似值，因为其可取决于期望寻求获得的特性而改变。至少，并且不尝试将等同原则的应用限于权利要求的范围，每个数值参数应至少从报告的有效数字的值的角度考虑并且应用常规的四舍五入技术。
注意，如在本说明书和所附的权利要求中所使用，单数形式“一个（a）”、“一个（an）”和“所述”和任何词语的任何单数使用，包括复数形式，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所使用，术语“包括”和其语法变型旨在是非限制性的，使得列表中项目的叙述不排除可替换或添加至所列项目的其他类似的项目。
如本文所使用，“AKT-mTOR通路蛋白”包括但不限于AKT1（UniProtKB - P31749）、AKT2（UniProtKB - P31751）、IR（也称为INSR）（UniProtKB P06213）、IGF1R （UniProtKB -P08069）、IRS1（UniProtKB - P35568）、TSC2 （UniProtKB - P49815）、mTOR（UniProtKB -P42345）、GSK3a（UniProtKB - P49840）、GSK3b（UniProtKB - P49841）、GSK3a/GSK3b、p70S6K（也称为RPS6KB1） （UniProtKB - P23443）、RPS6（UniProtKB - P62753）、PRAS40（也称为AKT1S1）（UniProtKB - Q96B36）和PTEN （UniProtKB - P60484）。
如本文所使用，“蛋白质”、“肽”和“多肽”通篇替换使用，指其中每个氨基酸与下一个氨基酸通过肽键连接的氨基酸链。在一些实施方式中，当氨基酸链由约两个至四十个氨基酸组成时，使用术语“肽”。但是，术语“肽”不应解释为限制性的，除非明确指出。
术语“抗体”以最宽的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（比如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们展示期望的免疫沉淀活性。这样，术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，比如Fv、单链Fv（scFv）、Fab、Fab'、di-scFv、sdAb（单个结构域抗体）和(Fab')2（包括化学连接的(Fab')2）。抗体的木瓜蛋白酶分解产生两个相同的抗原-结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原-结合位点，和残留的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原-结合位点的(Fab')2片段。术语抗体也包括但不限于嵌合抗体、人源化的抗体和各种物种，比如小鼠、山羊、马、绵羊、鸡等的抗体。此外，对于本文提供的所有抗体构建体，也考虑具有来自其他生物体序列的突变体，比如CDR-移植的抗体或嵌合抗体。抗体片段也包括单链scFvs、串联双-scFv、双抗体、串联三-sdcFv、微抗体等的定向。抗体片段也包括纳米抗体（sdAb，具有单个单体结构域，比如一对重链的可变域，而没有轻链的抗体）。在一些实施方式中，抗体片段可称为特异性物种（例如，人scFv或小鼠scFv）。这表示至少部分非CDR区域的序列，而不是构建体的来源。参考名称和登记参考来提及本文提供的抗体。技术人员通过所述名称和登记信息能够确定抗体的序列，所以本公开包括具有参考抗体的至少部分序列的任何抗体，只要抗体保持其免疫沉淀其抗原蛋白的能力。在一些实施方式中，抗体包括具有与表1中提供的抗体相同CDR的抗体。
质谱（MS）是用于基于它们的质荷比（m/z）分析蛋白质的主要技术。MS技术一般包括化合物的电离和任选的将所得离子碎片化，以及检测和分析离子和/或片段离子的m/z，随后计算相应的离子质量。“质谱仪”一般包括离子发生器和离子检测器。“质谱（Massspectrometry）”、“质谱（mass spec）”、“质谱法”和“MS”通篇替换使用。
“靶向质谱”，本文也称为“靶向质谱法”、“靶向MS”和“tMS”提高了质谱分析的速度、灵敏度和量化的精度。非靶向质谱，有时称为“数据-依赖性扫描”、“发现MS”和“dMS”以及靶向质谱的相似性在于：在每个中，分析物（蛋白质、小分子或肽）从与液体色谱工具连接的反相柱注入或洗脱并且通过电喷射电离转化成气相离子。分析物在质谱中片段化（称为串联MS或MS/MS的过程），并且片段和母体质量用于确定分析物的身份。发现MS分析MS/MS片段谱的整体含量。相反，在靶向质谱中，参考谱用于引导分析仅仅数个选择的片段离子而不是整体含量。
“多反应监测”、“MRM”、“选择反应监测”和“SRM”通篇替换使用，指依赖于三节四极（QQQ）工具可用的独特的扫描模式的一类靶向质谱。见，例如，Chambers等人，《蛋白质组学专家综述（Expert Rev. Proteomics）》，1-12 （2014）。
“平行反应监测”和“PRM”在本文替换使用，以描述另一类靶向质谱，其中SRM中使用的第二质量分析仪（四极）在PRM中被高分辨率轨道阱质量分析仪替换。与SRM允许在给定的时间测量一个单个转变不同，PRM允许在MS/MS谱中平行监测。PRM也允许分离具有接近m/z值（即，在10 ppm范围内）的离子，并且所以可允许更低的检测和量化界限（LOD或LLOD和LOQ或LLOQ）。
本文公开的方法可应用于任何类型的MS分析。本公开不受使用的具体装置或分析的限制。用于分析样品的m/z的任何装置的使用将包括在质谱的定义中。可使用的MS分析和/或装置的非限制性例子包括电喷射电离、离子迁移率、时飞、串联、离子捕获、MRM、SRM、MRM/SRM、PRM和轨道阱。本公开既不受MS分析中使用的离子发生器或检测器的限制也不受MS的具体构造的限制。本公开不限于与具体装置或软件的一起使用。本公开不限于实施例中描述的装置和软件。
在一些实施方式中，提供了免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括使生物样品接触表1中列举的至少一种抗体。免疫沉淀方法可为单重的或多重的。“单重的”IP每个试验使用一种抗体，而“多重的”IP每个试验使用多于一种抗体。
在一些实施方式中，提供了用于检测和量化磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP-MS方法。所述方法可包括使生物样品接触表1中列举的至少一种抗体，分解免疫沉淀的蛋白质，以及经质谱分析分解的蛋白质。IP和MS可为单重的或多重的。“单重的”MS指在单个MS试验中监测单个肽，而“多重的”MS指在单个MS试验中监测多于一种靶肽。
表1提供了用于本文所述的IP和IP-MS方法的抗体的列表。表2提供了已知结合它们的抗原AKT-mTOR蛋白，但是发现较少用于本文所述的IP和IP-MS方法的抗体的列表。图11和表3提供了用于AKT-mTOR通路蛋白的IP的抗体的总结，如由蛋白质印迹所验证的。
表1：用于AKT-mTOR通路蛋白的IP至MS验证的抗体
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Figure 349075DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
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表2：针对AKT-mTOR通路蛋白的IP至MS较不成功的抗体的列表
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Figure 203789DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
免疫沉淀的AKT-mTOR通路蛋白可被还原和烷基化，然后片段化（例如，分解）。已经被还原和烷基化的样品可包括修饰，比如对半胱氨酸残基的修饰（例如，CAM）。在SEQ IDNO: 1 – 424的AKT-mTOR肽显示源自，例如，还原/烷基化的修饰的情况下，也包括未被修饰的肽。例如，在提及SEQ ID NO: 1 – 424的AKT-mTOR通路肽的每种情况下，也包括SEQ IDNO: 1 – 424未经修饰的肽。
样品可任选地被脱盐，然后通过质谱分析。包括酶和化学分解二者。酶分解包括但不限于蛋白酶的分解，比如，例如，胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN Promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。化学分解包括使用，例如，CNBr、邻亚碘酰苯甲酸盐和甲酸。
在一些实施方式中，在片段化（例如，分解）之后，通过质谱（MS）分析肽样品，以及将所得谱与来自已知蛋白质的理论谱比较，以确定样品中的肽和蛋白质。对于AKT-mTOR通路蛋白，发现MS是繁琐的和耗费时间的，且非切实可行的临床方法。所以，发明人已经鉴定了与AKT-mTOR通路蛋白相关的新的肽，用于本公开的IP-MS方法。在靶向MS和IP-靶向MS方法中使用这些肽允许量化甚至低丰度的AKT-mTOR蛋白。而且，在靶向MS和IP-靶向MS方法中使用这些肽允许量化磷酸化的AKT-mTOR蛋白。
理论上，用于MS以检测和量化AKT-mTOR通路蛋白的肽可通过使用计算机软件等设计。但是，许多这些潜在的肽序列在基于MS的试验，包括SRM/MRM和PRM中是不合适的或低效的。因为不可能预测最合适的用于MS分析的肽，所以有必要实验鉴定修饰和未经修饰的肽，以开发为临床试剂。为了完成分析，发现在分析典型的样品时有用的某些肽在分析进行了免疫沉淀的样品时是没有预测性的。
典型地，通过量化蛋白质的特定独特的肽进行靶向MS。在一些实施方式中，已知量的同位素-标记（例如，重同位素-标记）形式的这些靶向肽可用作内部标准品进行绝对量化。在一些情况下，感兴趣的蛋白质是不可检测的，即使在鉴定独特的肽标准之后。特异性抗体与特定靶肽的组合已经使得发明人改善了通过MS检测AKT-mTOR通路蛋白的灵敏度，并且已经允许比先前所见的更低水平的检测和更低水平的量化。见，例如，图4。
在一些实施方式中，试剂盒中提供的用于描述的方法的AKT-mTOR通路肽列在表3中。SEQ ID No：1-212是天然肽序列，其用于鉴定“靶ID”列中列举的AKT-mTOR通路蛋白。某些肽序列在修饰残基之后，在某些残基处被磷酸化，如括号中显示的“（PO3H2）”。
某些肽在修饰的残基之后，在半胱氨酸残基处修饰，如“（CAM）”所显示。“CAM”转译后修饰是本领域技术人员熟知的，指源自蛋白质/肽的烷基化的脲甲基化。肽可如表3中显示，或可为缺少脲甲基化的这些肽的非修饰形式。
表3.量化AKT-mTOR通路蛋白的肽的列表
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Figure DEST_PATH_IMAGE011
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Figure DEST_PATH_IMAGE023
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Figure 524653DEST_PATH_IMAGE026
在一些实施方式中，肽试剂列举在表5中（SEQ ID Nos：98、96、157、163、40、42、37、25、73、80、52、57、59、208、209、16、23、124、120、195、200、129、133、1、6、27、91和204）。在一些实施方式中，表5的肽用于多重的MS方法。
在一些实施方式中，蛋白质样品在片段化之前被变性或溶解。
在一些实施方式中，片段化方案使用化学切割。在一些实施方式中，化学切割使用CNBr。在一些实施方式中，使用酶进行片段化方案。在一些实施方式中，片段化方案使用MS级商业上可得的蛋白酶。可用于分解样品的蛋白酶的例子包括胰蛋白酶、蛋白内切酶GluC、蛋白内切酶ArgC、胃蛋白酶、糜蛋白酶、LysN蛋白酶、LysC蛋白酶、GluC蛋白酶、AspN蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。在一些实施方式中，使用不同蛋白酶的混合物以及在分解之后将个体结果组合在一起并且分析。在一些实施方式中，分解是不完全的，以便看到较大的重叠肽。在一些实施方式中，用IdeS、IdeZ、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行抗体分解，以产生大的抗体结构域，用于“中下游”蛋白质表征。在一些实施方式中，片段化方案使用修饰的胰蛋白酶。在一些实施方式中，可使用10:1、20:1、25:1、50:1、66:1或100:1的蛋白质:蛋白酶的比率（w/w）。在一些实施方式中，使用的胰蛋白酶的浓度为约100ng/ml-1 mg/ml，或约100 ng/ml-500µg/ml，或约100 ng/ml-100µg/ml，或约1μg/ml-1mg/ml，或约1μg/ml-500μg/ml，或约1μg/ml-100μg/ml，或约10μg/mg-1mg/ml，或约10μg/mg-500μg/ml，或约10μg/mg-100μg/ml。在一些实施方式中，分解步骤为10分钟至48小时，或30分钟至48小时，或30分钟至24小时，或30分钟至16小时，或1小时至48小时，或1小时至24小时，或1小时至16小时，或1至8小时，或1至6小时，或1至4小时。在一些实施方式中，分解步骤在20℃和45℃之间，或20℃和40℃之间，或22℃和40℃之间，或25℃和37℃之间的温度下温育。在一些实施方式中，分解步骤在37℃或30℃下温育。在一些实施方式中，包括一个步骤，以结束分解步骤。结束分解方案的所述步骤可为添加终止液或将样品旋转或粒化的步骤。在一些实施方式中，分解随后是胍基化。
在一些实施方式中，片段化方案包括的使用蛋白质凝胶。在一些实施方式中，片段化方案包括胶内分解。用于进行胶内分解的示例性商业上可得的试剂盒是胶内胰蛋白酶分解试剂盒（赛默飞世尔Cat#89871）。
在一些实施方式中，片段化方案在溶液中进行。用于进行溶液内分解的示例性商业上可得的试剂盒是溶液内胰蛋白酶分解和胍基化试剂盒（赛默飞世尔Cat#89895）。
在一些实施方式中，片段化方案使用珠子。在一些实施方式中，片段化方案包括珠上分解。在一些实施方式中，使用琼脂糖珠子或蛋白质G珠子。在一些实施方式中，使用磁珠。
在一些实施方式中，在MS分析之前，使用液体色谱将蛋白质样品分开。在一些实施方式中，在MS分析之前，使用液体色谱将片段化样品分开。
本文所述的IP和IP-MS方法能够检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，包括表4中描述的那些。
表4.总的和磷酸化的AKT-mTOR通路靶蛋白的列表
Figure DEST_PATH_IMAGE027
在一些实施方式中，本文所述的MS方法中使用的AKT-mTOR通路肽具有被视为在临床和研究方法中有用的检测限。见，例如，表5。在一些实施方式中，MS和IP-MS方法中使用的AKT-mTOR通路肽包括表5描述的肽或由其组成。在一些实施方式中，表5的肽为可检测地标记的。SEQ ID NO: 163的肽可缺少第五个氨基酸上显示的“CAM”修饰。
表5.用于AKT-mTOR通路蛋白的肽的定量下限
Figure 635829DEST_PATH_IMAGE028
在一些实施方式中，包括用于检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的方法。在一些实施方式中，根据检测总的（非磷酸化的）AKT-mTOR通路蛋白，分别进行IP、MS和IP-MS方法以检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白。在一些实施方式中，检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP和IP-MS方法使用表9的抗体。在一些实施方式中，检测非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP和IP-MS方法使用表8的抗体。在一些实施方式中，检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP-MS方法使用表9的抗体和表5的肽。在一些实施方式中，检测非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP-MS方法使用表8的抗体和表5的肽。
表8.用于多重的IP、单重的IP（+/-MS）的非磷-抗体的列表。
Figure DEST_PATH_IMAGE029
实施例
提供下述实施例，以阐释某些公开的实施方式并且决不视为限制本公开的范围。
实施例1–AKT-mTOR通路蛋白的免疫沉淀和发现-MS
AKT-mTOR通路蛋白在包括癌症的疾病中起到核心作用。AKT-mTOR通路蛋白的鉴定，尽管期望作为监测疾病进展的方式，和作为科学研究的工具，已经受到限制，部分原因是AKT-mTOR通路蛋白的低丰度，并且部分原因是缺少验证方法和试剂。磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白作为蛋白质激活状态的量度，和作为疾病进展的标记，对于鉴定和量化是尤其重要的。如图2中所显示，设计和测试了用于检测AKT-mTOR通路蛋白，包括磷酸化的蛋白，和它们的蛋白质相互作用的方法和试剂。多重免疫沉淀（IP）至MS（mIP-MS）测量总的和磷酸化的AKT-mTOR通路靶的能力进行了评估。还将mIP-MS方法与现有单重免疫试验（蛋白质印迹（WB）和ELISA）和多重Luminex试验进行了比较。
细胞培养
对于所有试验，HCT116（ATCC产品#CCL-247）、MCF7，（ATCC产品#HTB-22）和A549（ATCC产品#CCL-185）细胞分别在具有10% FBS/1xPenStrep的Hamm's F-12K培养基、McCoy's 5A培养基和MEM培养基中生长，至约70-80%的汇合。使细胞在0.1%炭剥离的FBS中挨饿24小时，然后用100ng/ml的IGF（CST产品#8917SF）刺激15分钟。
对照
蛋白质印迹（WB）、ELISA和Luminex试验用作对照，以比较本文所述的IP-MS方法。用于蛋白质印迹的试剂和方法总结在表6中。
表6 –针对AKT-mTOR通路靶验证的用于IP至蛋白质印迹的抗体的列表
Figure 521877DEST_PATH_IMAGE030
Figure DEST_PATH_IMAGE031
二级抗体：山羊抗兔子Ab（赛默飞世尔科技，PN:32460）、山羊抗小鼠Ab（赛默飞世尔科技，PN:32430）、Pierce高灵敏度链霉亲和素-HRP（赛默飞世尔科技，PN：21130）
SDS-PAGE凝胶：NuPAGE 3-8% Tris-乙酸盐凝胶（赛默飞世尔科技，PN：EA03752BOX），Novex 4-20% Tris-甘氨酸Midi凝胶（赛默飞世尔科技，PN：WT4201BX10）
Clean Blot：赛默飞世尔科技，PN：21232
用于ELISA试剂盒的试剂显示在表7中。
表7.用于11种总的和10种磷酸化的AKT-mTOR通路靶的ELISA试剂盒
Figure 926051DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE033
对于Luminex试验，AKT通路（总）磁性7-重面板（赛默飞世尔科技，PN：LHO0002M）、AKT通路（磷）磁性7-重面板（赛默飞世尔科技，PN：LHO0001M）、Milliplex Map Akt/mTOR磷蛋白磁珠11-重试剂盒（密理博，PN：48-611MAG）和Milliplex Map总Akt/mTOR磁珠11-重试剂盒（密理博，PN：48-612MAG）按照说明书手册的建议使用。Luminex MagPix工具用于获取和分析Luminex试验数据。
免疫沉淀和MS样品制备
Thermo Scientific ™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（蛋白质A/G）用于从500µg细胞裂解物中筛选和验证用于11种总的和10种磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的抗体。验证的抗体被Thermo Scientific™ Pierce抗体生物素化试剂盒生物素化，以用于IP。ThermoScientific™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（链霉亲和素）用于进行单重或多重IP，用于靶富集。通过溶液内分解方法处理IP样品，其中将IP洗脱液在6M尿素，50mM TEAB，pH 8.5中重构，随后进行还原、烷基化以及在37℃下胰蛋白酶分解过夜。将分解的样品用TFA酸化，然后进行MS分析。
液体色谱和质谱
在MS分析之前，将胰蛋白酶分解的样品在线使用赛默科技™ Acclaim™ PepMap100 C18捕获柱脱盐。对于发现MS，通过nanoLC-MS/MS使用Thermo Scientific™ Dionex™UltiMate™ 3000 RSLCnano***和Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF组合型四极-轨道阱质谱仪，分析样品。对于靶向MS，使用UltiMate 3000 RSLCnano***和ThermoScientific™ TSQ™ Vantage™质谱仪（SRM模式）或Thermo Scientific™ Q Exactive™HF组合型四极-轨道阱质谱仪（PRM模式），分析样品。
MS数据分析
用Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™ 1.4分析发现MS数据，以分析序列覆盖百分数、独特的肽、MS1强度，谱计数和PTM。使用Uniprot人蛋白质数据库进行Proteome Discoverer软件搜索。具有最高MS1强度和相关磷酸化位点的胰蛋白酶肽选自发现数据，用于靶向试验开发。对于靶向MS数据分析，Thermo Scientific™ Pinpoint软件和Skyline软件（华盛顿大学）用于根据校准曲线和来自未知样品的靶分析物浓度来测量量化限（LOQ）。
结果
如图3中显示，将AKT-mTOR通路蛋白从未刺激的和IGF-刺激A549裂解物用ThermoScientific™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（蛋白质A/G或链霉亲和素）免疫沉淀，用于MS分析。筛选各种抗体，以确定对IP AKT-mTOR通路蛋白的能力的有效性，以及它们在与MS结合时的有用性。表1（上方）提供了验证用于IP-MS方法的抗体的列表。表2（上方）提供了经测试的但是发现较不成功的抗体的列表。
与净（非IP-富集的）裂解物相比，在IP富集的样品中鉴定了较大量的独特肽。见图3。鉴定了AKT、IGF1R和mTOR靶的蛋白质亚型和相互作用的蛋白质配偶体。检测了AKT1、AKT2、mTOR、IGF1R和PRAS40的相关磷酸化位点。为靶向MS试验开发选择了候选量化的肽。
分析了十二种AKT-mTOR通路蛋白，包括AKT2、AKT1、mTOR、IGF1R、IR、PRAS40、p70S6K、TSC2、PTEN、GSK3alpha、GSK3beta和IRS1，的检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）。结果呈现在图4中。表示定量下限至上限（LLOQ至ULOQ）之间的浓度范围的试验动态范围是其中蛋白质浓度在可接受的准确度和精度水平下的可测量范围。为了确保测量的线性，对于每个内部标准肽，从横跨500至0.08 fmol浓度的稀释系列实验中在柱上测定线性信号至丰度范围（LLOQ和ULOQ），掺入36fmol和200ng的等摩尔浓度的6种蛋白质分解的恒定轻肽。
实施例2 – AKT-mTOR通路蛋白的多重IP和多重MS
从未刺激的和IGF刺激的MCF7裂解物中，用生物素化的抗体和Thermo Scientific™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（链霉亲和素），同时富集十一种总的和十种磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白靶。使MCF7细胞在0.1%炭剥离的FBS中挨饿24小时，然后用100ng/ml的IGF刺激15分钟。对于11种总的和10种磷酸化的AKT-mTOR通路靶，根据说明书手册的建议，使用Thermo Scientific™ Pierce抗体生物素化试剂盒（PN：90407）将验证的IP-MS抗体生物素化，以用于IP。对于11种总的靶，将1μg的每种生物素化的抗体同时添加至1000μg的对照和IGF刺激的MCF7细胞裂解物中，一式两份。对于10种总的靶，将1μg的每种生物素化的抗体同时添加至1000μg的对照和IGF刺激MCF7细胞裂解物中，一式两份。根据ThermoScientific™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（链霉亲和素）（PN：90408）中的建议，结合下述改变，进行IP。对于每微克生物素化的抗体浓度，将5微克的链霉亲和素磁珠用于多重IP。
通过溶液内分解方法处理IP样品，其中IP洗脱液在6M尿素、50mM TEAB，pH 8.5中重构，随后还原（5mM TCEP，35℃下30分钟），烷基化（20mM碘乙酰胺，暗处，室温下，30分钟）并且在37℃下，进行胰蛋白酶分解过夜。将分解的样品用3.5µL的10% TFA酸化，然后进行发现MS分析。对于发现MS，通过nanoLC-MS/MS，使用Thermo Scientific™ Dionex™UltiMate™ 3000 RSLCnano***和Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF混合型四极-轨道阱质谱仪，分析样品。简言之，在线使用C18捕获柱（赛默飞世尔科技，PN：164564）清洗分解的样品，随后使用具有2至30%梯度的缓冲液B的分析C18柱（75 µm内径x 15 cm，nanoViper，3µm颗粒大小，赛默飞世尔科技，PN：ES800），使用缓冲液A（0.1%甲酸）和缓冲液B（0.1%甲酸/99.9%乙腈）以0.300 µL/min进行反相分离。
图5显示了IP-nanoLC-MS/MS分析能够鉴定多重磷光体-试验中的11种蛋白质，和多重总试验的12种蛋白质。多重总试验的MS分析鉴定了AKT-mTOR通路靶的相互作用的蛋白质（PIK3R1、PIK3R2、PIK3CB、PIK3CA、GSKIP和TSC1）。表8和9提供了在所述多重IP中使用的抗体的列表。
接下来，测试IP-MS经公开的IP-MS方法量化亚fmol浓度的AKT-mTOR通路蛋白的能力。如图6中显示，使用Thermo Scientific™ Pierce MS-兼容性磁性IP试剂盒（链霉亲和素），从未刺激的和IGF刺激的A549和HCT116裂解物，进行AKT（总&磷）、IR、p70S6K、mTOR和GSK3α的多重IP富集。使A549和HCT116细胞在0.1%炭剥离的FBS中挨饿24小时，然后用100ng/ml的IGF刺激15分钟。对于总AKT、磷AKT、IR、p70S6K、mTOR和GSK3α通路靶，根据说明书手册的建议，使用Thermo Scientific™ Pierce抗体生物素化试剂盒（PN：90407）将验证的IP-MS抗体生物素化，以用于IP。将1μg的每种生物素化的抗体同时添加至1000μg的对照和IGF刺激的A549和HCT116细胞裂解物中，一式两份。根据Thermo Scientific™ PierceMS-兼容性磁性IP试剂盒（链霉抗生物素）（PN：90408）中的建议，结合下述改变，进行IP。对于每微克的生物素化的抗体浓度，将5微克的链霉亲和素磁珠用于多重IP。通过溶液内分解方法处理IP样品，其中IP洗脱液在6M尿素，50mM TEAB，pH 8.5中重构，随后还原（5mM TCEP，35℃下，30分钟），烷基化（20mM碘乙酰胺，暗处，室温下，30分钟）并且在37℃下进行胰蛋白酶分解过夜。将分解的样品用3.5µL的10% TFA酸化，然后进行发现MS分析。将内部标准肽掺杂在分解的IP样品中，以制备6.66 fmol/ul的终体积。对于靶向MS，通过nanoLC-PRM/MS，使用Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 RSLCnano***和ThermoScientific™ Q Exactive™ HF混合型四极-轨道阱质谱仪，分析样品。简言之，将分解样品在线使用C18捕获柱（赛默飞世尔科技，PN：164564）清洗，随后使用具有2-30%梯度的缓冲液B的分析C18柱（75 µm 内径×15 cm，nanoViper，3µm颗粒大小，赛默飞世尔科技，PN：ES800），使用缓冲液A （0.1%甲酸）和缓冲液B （0.1%甲酸/99.9%乙腈），以0.300 µL/min进行反相分离。通过nanoLC-PRM/MS，将总靶以低至亚fmol浓度量化。在IGF刺激之后，在A549和HCT116细胞系中都看到了磷AKT的上调。对于总AKT、IR、mTOR、GSK3a和p70S6K靶，在A549和HCT116细胞中，在IGF刺激之后都观察到了浓度的稍微下降。
实施例3 –基准
接下来，进行mIP-tMS试验与目前的免疫试验技术的比较，以量化来自未刺激的和IGF刺激的A549、HCT116和MCF7裂解物的AKT-mTOR通路靶。如上述并且根据制造商的指导进行蛋白质印迹、ELISA和Luminex试验。如实施例2中进行mIP-tMS。
图7A-7D显示了总AKT的量化。图7E-7H显示了根据所有4种技术的磷酸化的IGF1R的量化。技术之间观察到了较低的相关性。较低的相关性可能是由于使用的不同的抗体或每个试验和抗体特异性。在4种技术的3个中，在IGF刺激之后，观察到了磷酸化的IGF1R的上调。磷光体IGF1R的蛋白质印迹显示在对照和IGF刺激的细胞裂解物之间没有显著区别。
使用本文所述的IP-MS方法鉴定和量化的AKT-mTOR通路蛋白的总结提供在图8中。大部分AKT-mTOR通路靶在发现MS中没有被鉴定到且被靶向MS （PRM或SRM）量化，而不需要通过免疫沉淀富集。
相比单独MS，使用特定选择的抗体的免疫沉淀产生更高产率的AKT-mTOR通路靶蛋白和更少的非特异性结合蛋白质。IP-MS试验也比其他商业上可得到的非MS试验更成功。此外，总的和磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的IP至MS分析使得鉴定了与蛋白质相互作用和磷酸化位点相关的多种亚型。总的和磷酸化的mIP-tMS试验允许在低至亚fmol范围内从未刺激的和IGF刺激的A549、HCT116和MCF7细胞裂解物中，同时量化12种总的和11种磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白。对于量化总的和磷酸化的靶相对丰度，与WB、ELISA和Luminex试验相比，mIP-tMS试验的基准显示了中等相关性。对于数个靶的低一致性可能是因为用于每个试验的抗体的特异性的差别。基于MS的试验的主要优势是靶身份的高置信度加上同时量化多个靶、相互作用的蛋白质和它们的磷酸化形式。
实施例4 –组织样品验证
为IP-MS应用优化组织裂解方案。简言之，用5mL 1×冷PBS冲洗50至100mg的人和鼠组织样品三次。将组织样品在5mL 1×冷PBS中使用剪刀切碎，随后在IP裂解缓冲液（赛默飞世尔科技PN：87788）和电子Polytron手持组织撕裂器中匀化。在IP之前，使匀化的组织样品通过组织粗滤器（赛默飞世尔科技PN：87791），以制备组织裂解物。为了在鼠和人组织裂解物中验证IP-MS方法，根据实施例2，从正常小鼠肺组织裂解物、正常小鼠肾组织裂解物和正常人肺组织裂解物同时富集十一种总的和十种磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白靶。A549细胞裂解物用作非组织对照。如表10中显示，本文所述的IP-MS方法能够验证鼠和人组织裂解物除了细胞裂解物中的AKT-mTOR通路蛋白。使用我们的IP-MS方法，在正常人肺组织中鉴定了十一种AKT-mTOR通路蛋白靶中的七种，并且对于正常小鼠肾组织，鉴定了十一种AKT-mTOR通路蛋白靶中的九种。
表10.11-重总的IP-MS试验验证组织裂解物。
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Claims (17)

1.一种用于检测AKT-mTOR通路蛋白的方法，其包括：
a.从生物样品分离AKT-mTOR通路蛋白；
b.分解所述分离的蛋白质；
c.经质谱分析所述分解的蛋白质，以确定存在用于AKT-mTOR通路蛋白的肽，其中所述用于AKT-mTOR通路蛋白的肽选自由SEQ ID No: 16, 37, 42, 73, 80, 91, 96, 98, 157,163, 195, 200, 204, 208和209组成的群组；以及
d.检测所述样品中的一种或多种AKT-mTOR通路蛋白，
其中步骤a的分离包括：
用选自表8和表9的一种以上的抗体处理所述生物样品，其中所述表8的抗体鉴定非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，所述表9的抗体检测磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，且所述抗体免疫沉淀来自生物样品的AKT-mTOR通路蛋白；
其中所述表8如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
所述表9如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
2.根据权利要求1所述的方法，其另外包括确定所述AKT-mTOR通路蛋白的数量。
3.根据前述权利要求1或2中任一项所述的方法，其中检测下限为在0.05至0.25 fmol的范围内，和/或其中定量下限为0.05至0.75 fmol的范围内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述AKT-mTOR通路蛋白为磷酸化的。
5.一种用于确定磷酸化的与非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的比率的方法，其包括
a.用选自表9的一种或多种能够免疫沉淀磷酸化的AKT-mTOR靶蛋白质的抗体处理生物样品，并用选自表8一种或多种能够免疫沉淀非磷酸化的AKT-mTOR靶蛋白质的抗体分别处理相同的所述生物样品；
b.分解所述免疫沉淀的AKT-mTOR通路蛋白；
c.将已知量的可检测地标记的第一和第二内部标准肽添加至所述分解的蛋白质中，其中所述第一内部标准肽具有与用于鉴定所述磷酸化的蛋白的磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列，并且所述第二内部标准肽具有与用于鉴定所述非磷酸化的蛋白的非磷酸化的AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列；
d.经质谱分析所述分解的蛋白质和所述内部标准品，以确定所述磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路肽的存在和数量，其中所述AKT-mTOR通路肽选自由SEQ ID No: 16, 37,42, 73, 80, 91, 96, 98, 157, 163, 195, 200, 204, 208和209组成的群组；以及
e.确定所述样品中所述磷酸化的和非磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白的数量，并且确定磷酸化的与非磷酸化的靶蛋白质的比率，
其中所述表8如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
所述表9如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述生物样品为人，为分离的细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织或肿瘤组织。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述肽被可检测的标记修饰，所述可检测的标记包括选自13C、15N、2H以及18O的同位素。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其中第一种所述抗体能够免疫沉淀磷酸化的AKT-mTOR通路蛋白，第二种所述抗体能够免疫沉淀通过第一种所述抗体沉淀的非磷酸化形式的AKT-mTOR通路蛋白。
9.根据权利要求1或5所述的方法，其中步骤a）包括用能够结合通路蛋白的标记的抗体处理所述样品，以提供标记的抗体-蛋白质缀合物；并且使所述标记的抗体-蛋白质缀合物结合能够结合标记的抗体的捕获试剂，以从所述样品分离靶蛋白质，所述标记是生物素并且所述捕获试剂是链霉亲和素。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述AKT-mTOR通路蛋白的数量通过如下确定：将已知量的内部标准肽添加至所述分解蛋白质然后进行质谱，其中所述内部标准肽具有与所述AKT-mTOR通路肽相同的氨基酸序列，并且被可检测地标记，以及通过与内部标准品比较而确定AKT-mTOR通路肽的数量，其中确定所述AKT-mTOR通路蛋白的数量是通过：比较所述样品中所述AKT-mTOR通路肽的数量与对照样品中相同AKT-mTOR通路肽的数量。
11.根据权利要求10中所述的方法，其中通过包括以下的方法确定所述AKT-mTOR通路蛋白的数量：比较AKT-mTOR通路肽的数量与已知量的内部标准肽，其中所述生物样品中的AKT-mTOR通路和内部标准肽二者都选自由SEQ ID No：16, 37, 42, 73, 80, 91, 96, 98,157, 163, 195, 200, 204, 208和209所组成的群组，其中所述标准肽被可检测地标记。
12.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述质谱是串联质谱或发现质谱，或所述质谱是靶向质谱，选自多反应监测（MRM）、选择反应监测（SRM）、平行反应监测（PRM）或其组合。
13.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述分解包括蛋白酶或化学分解。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白酶分解使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
15.一种用于权利要求1或5所述方法的试剂盒，其包括两种或多种能够免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的抗体，所述抗体选自表8或表9中的抗体；还包含用于进行质谱的试剂，以检测和量化AKT-mTOR通路蛋白，和包含选自由SEQ ID No：16, 37,42, 73, 80, 91, 96, 98,157, 163, 195, 200, 204, 208和209所组成的群组的一种肽,所述表8如下：
靶 销售商 IP抗体 AKT 密理博 07-416 IGF1R 赛信通 3027 IR 密理博 07-724 IRS1 赛信通 2382 mTOR 赛默飞世尔科技 PA1-518 P70S6K ABGENT AP3289g GSK3a 赛信通 4337 GSK3b 赛默飞世尔科技 MA1-15109 TSC2 赛默飞世尔科技 MA5-15004 PRAS40 赛默飞世尔科技 PA5-35143 PTEN 赛信通 9188
所述表9如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
。
16.一种用于权利要求1-14中任一项所述方法的试剂盒，其包括两种或多种能够免疫沉淀AKT-mTOR通路蛋白的抗体，所述抗体选自表8或表9中的抗体；还包含用于进行质谱的试剂，以检测和量化AKT-mTOR通路蛋白，还包括能够分解免疫沉淀的蛋白质样品的蛋白酶或化学试剂，其中所述蛋白酶试剂为胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶，或其中所述化学试剂为CNBr、邻亚碘酰苯甲酸盐或甲酸, 所述表8如下：
靶 销售商 IP抗体 AKT 密理博 07-416 IGF1R 赛信通 3027 IR 密理博 07-724 IRS1 赛信通 2382 mTOR 赛默飞世尔科技 PA1-518 P70S6K ABGENT AP3289g GSK3a 赛信通 4337 GSK3b 赛默飞世尔科技 MA1-15109 TSC2 赛默飞世尔科技 MA5-15004 PRAS40 赛默飞世尔科技 PA5-35143 PTEN 赛信通 9188
所述表9如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008AA
。
17. 根据权利要求16所述的试剂盒，还包括AKT-mTOR通路蛋白，选自由SEQ ID No：16,37, 42, 73, 80, 91, 96, 98, 157, 163, 195, 200, 204, 208和209所组成的群组。
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