CN108884463A - 恶性脑肿瘤的检测试剂盒或器件和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供恶性脑肿瘤的检测用试剂盒或器件、以及检测方法。本发明涉及包含能够与受检体的样品中的规定miRNA特异性地结合的核酸的恶性脑肿瘤检测用试剂盒或器件，以及包括体外(in vitro)测定该miRNA的步骤的恶性脑肿瘤的检测方法。

Description

恶性脑肿瘤的检测试剂盒或器件和检测方法
技术领域
本发明涉及用于检查受检体有无罹患恶性脑肿瘤的、包含能够与特定miRNA特异性地结合的核酸的恶性脑肿瘤的检测用试剂盒或器件，以及包括使用该核酸测定该miRNA的表达量的步骤的恶性脑肿瘤的检测方法。
背景技术
脑肿瘤分为由脑组织自身发生的原发性脑肿瘤、和由其他脏器的癌向脑转移而成的转移性脑肿瘤。原发性脑肿瘤分为良性与恶性，根据成为其起源的细胞型进行细分类。
原发性脑肿瘤主要分类为神经胶质瘤(恶性)、中枢神经***原发恶性淋巴瘤(恶性)、脑脊膜瘤(主要为良性)、下垂体腺瘤(良性)、神经鞘瘤(良性)、先天性肿瘤等，神经胶质瘤占全体的28％。神经胶质瘤根据构成肿瘤的细胞形态进一步分类为星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、室管膜瘤、神经节神经胶质瘤等。
根据由国立研究开发法人国立癌症研究中心癌症对策信息中心(日本)所报告的2014年日本国内按部位区分的癌症死亡率的统计，脑/中枢神经***的癌症的死亡数为2302人，2013年按部位区分的癌症死亡率为男性占2.0％、女性占1.5％。这样，脑肿瘤虽然在全部癌症中考虑癌症患者100人中为5人以下，发生率低，但如果仅考虑儿童癌患者，则脑肿瘤多得仅次于白血病，在幼年中多达儿童的癌患者每5人就有1人。
在UICC(国际抗癌联合会；Unio Internationalis Contra Cancrum)“TNM恶性肿瘤的分类”第6版中，没有规定脑肿瘤的病期分类(TNM)。脑肿瘤的恶性度根据2007年的WHO分类而分类为I～IV级。
不存在脑肿瘤中的有用血液标志物。通常，脑肿瘤通过患者自述头痛、呕吐、麻痹、失语/构音障害、意识障害等自觉症状，以及轻微的头部外伤的图像检查、脑健康检查(脳ドック)这样的健康诊断中的图像检查等被发现。图像诊断中利用CT、MRI、脑血管造影等。在通过图像诊断发现了脑肿瘤时，通过开颅手术摘出肿瘤，使用摘出的组织进行病理诊断。目前用于以血液中的标志物发现恶性脑肿瘤的肿瘤标志物在临床现场尚未普及。
另一方面，尚在研究阶段的使用以血液为代表的生物体样本中的miRNA的表达量来治疗/诊断脑肿瘤的方法如下所述，尚未实用化。
专利文献1中记载了使用在人的成胶质细胞瘤干细胞与正常神经干细胞之间表达量有差异的miRNA来治疗/诊断包含脑肿瘤的癌症的方法。但是，专利文献1停留于记载细胞中的miRNA表达量的变化数据。获得脑细胞作为样品带给患者的肉体负担重，因此不优选以脑细胞作为样品的检查方法。另外，关于专利文献1所记载的诊断方法，没有对于判别脑肿瘤的具体的准确度、灵敏度、特异度等判别性能、手段的记载，缺乏产业上的实用性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第US2014/0088170
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是提供新的恶性脑肿瘤标志物、和能有效地检测恶性脑肿瘤的方法。
用于解决课题的方法
如上所述，恶性脑肿瘤的检测中不存在现有的肿瘤标志物，另外对于研究阶段的标志物没有具体显示性能、检测的方法，因此在利用它们时，可能将健常体误诊为恶性脑肿瘤患者而造成实施无益的追加检查、漏检恶性脑肿瘤患者而造成丧失治疗机会。另外，用于测定肿瘤标志物的脑组织采集存在伴随开颅手术的风险，带给患者的侵袭性高而不优选，因此开发使用能够低侵袭地采集的血液的简便且准确度高的非侵袭的诊断标志物在临床上是重要的。特别是预后差的恶性脑肿瘤的早期发现、早期治疗可期待成为治疗成绩提高的突破点。
本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果从可低侵袭地采集的血液中找到了能够用于恶性脑肿瘤的检测标志物的多种基因(miRNA)，发现通过使用能够与这些基因特异性结合的核酸，能够有意义地检测恶性脑肿瘤，由此完成了本发明。
即，本发明具有以下特征。
(1)恶性脑肿瘤的检测用试剂盒，包含能够与恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述恶性脑肿瘤标志物是选自由miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p组成的组中的至少1种多核苷酸。
(2)根据(1)所述的试剂盒，其中，miR-1909-3p为hsa-miR-1909-3p，miR-6869-5p为hsa-miR-6869-5p，miR-3178为hsa-miR-3178，miR-4787-5p为hsa-miR-4787-5p，miR-6510-5p为hsa-miR-6510-5p，miR-4695-5p为hsa-miR-4695-5p，miR-4634为hsa-miR-4634，miR-4449为hsa-miR-4449，miR-3195为hsa-miR-3195，并且miR-6836-3p为hsa-miR-6836-3p。
(3)根据(1)或(2)所述的试剂盒，所述核酸是选自由下述(a)～(e)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(e)与所述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含能够与别的恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述别的恶性脑肿瘤标志物是miR-187-5p的多核苷酸。
(5)根据(4)所述的试剂盒，其中，miR-187-5p为hsa-miR-187-5p。
(6)根据(4)或(5)所述的试剂盒，其中，能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸是选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(j)与所述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
(7)恶性脑肿瘤的检测用器件，包含能够与恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述恶性脑肿瘤标志物是选自由miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p组成的组中的至少1种多核苷酸。
(8)根据(7)所述的器件，其中，miR-1909-3p为hsa-miR-1909-3p，miR-6869-5p为hsa-miR-6869-5p，miR-3178为hsa-miR-3178，miR-4787-5p为hsa-miR-4787-5p，miR-6510-5p为hsa-miR-6510-5p，miR-4695-5p为hsa-miR-4695-5p，miR-4634为hsa-miR-4634，miR-4449为hsa-miR-4449，miR-3195为hsa-miR-3195，并且miR-6836-3p为hsa-miR-6836-3p。
(9)根据(7)或(8)所述的器件，所述核酸是选自由下述(a)～(e)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(e)与所述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
(10)根据(7)～(9)的任一项所述的器件，所述器件还包含能够与别的恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述别的恶性脑肿瘤标志物是miR-187-5p的多核苷酸。
(11)根据(10)所述的器件，其中，miR-187-5p为hsa-miR-187-5p。
(12)根据(10)或(11)所述的器件，其中，能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸是选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(j)与所述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
(13)根据(7)～(12)的任一项所述的器件，所述器件是用于通过杂交技术进行测定的器件。
(14)根据(13)所述的器件，所述杂交技术是核酸阵列技术。
(15)恶性脑肿瘤的检测方法，包括：使用(1)～(6)的任一项所述的试剂盒或(7)～(14)的任一项所述的器件测定受检体的样品中的目标核酸的表达量，使用该测定的表达量、和同样测定的健常体或良性脑肿瘤患者的对照表达量，评价受检体是否罹患恶性脑肿瘤，检测受检体中有无恶性脑肿瘤。
(16)受检体中的恶性脑肿瘤的检测方法，包括：使用(1)～(6)的任一项所述的试剂盒或(7)～(14)的任一项所述的器件测定受检体的样品中的目标基因的表达量，在判别式中带入来源于上述受检体的样品中的目标基因的表达量，由此评价存在还是不存在恶性脑肿瘤，
所述判别式是将来源于已知具有恶性脑肿瘤的受检体的样品的基因表达量和来源于健常体或良性脑肿瘤患者的样品的基因表达量作为教师样本而制成的，并且能够区别地判别恶性脑肿瘤与健常或良性脑肿瘤。
(17)根据(15)或(16)所述的方法，所述受检体是人。
(18)根据(15)～(17)的任一项所述的方法，所述样品是血液、血清或血浆。
＜术语的定义＞
本说明书中使用的术语具有以下定义。
本说明书中“恶性脑肿瘤”是指在脑中形成的任意的恶性肿瘤。具体地，恶性脑肿瘤包括神经胶质瘤和中枢神经***原发恶性淋巴瘤等。
本说明书中“脑的良性肿瘤”是指在脑中形成的任意的良性的肿瘤。作为脑的良性肿瘤，不特别限定，作为典型例可列举良性的脑脊膜瘤。
核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA等利用缩略符号的表述是按照“塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン(制作包含碱基序列或氨基酸序列的说明书等的指南)”(日本特许厅编)和本技术领域中的惯用法表示的。
本说明书中所谓“多核苷酸”，对包含RNA、DNA和RNA/DNA(嵌合体)的任一者的核酸使用。另外，上述DNA中包含cDNA、基因组DNA、和合成DNA的任一种。此外，上述RNA中包含总RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、snRNA、非编码(non-coding)RNA和合成RNA的任一种。本说明书中“合成DNA”和“合成RNA”是指基于规定的碱基序列(可以为天然型序列或非天然型序列的任一种)，使用例如自动核酸合成仪，人工地制作的DNA和RNA。本说明书中“非天然型序列”是指以广义的含义使用，包含与天然型序列不同的、例如包含1个以上核苷酸的替换、缺失、***和/或添加的序列(即，突变序列)，包含1个以上修饰核苷酸的序列(即，修饰序列)等。此外，本说明书中，术语“多核苷酸”与“核酸”可互换使用。
本说明书中“片段”是具有多核苷酸的连续的一部分碱基序列的多核苷酸，期望具有15个碱基以上、优选为17个碱基以上、更优选为19个碱基以上的长度。
本说明书中“基因”以不仅包含RNA和双链DNA，而且包含构成它们的正链(或正义链)或互补链(或反义链)等各单链DNA的含义使用。此外对其长度不特别限制。
因此，本说明书中，“基因”只要没有特别说明，就包含：包含人基因组DNA的双链DNA、单链DNA(正链)、具有与该正链互补的序列的单链DNA(互补链)(例如cDNA)、微小RNA(miRNA)、和它们的片段、以及它们的转录产物的任一种。此外，该“基因”不仅包含用特定的碱基序列(或序列号)表示的“基因”，而且包含编码与由该基因编码的RNA生物学功能同等的RNA，例如编码同族体(即，同源物或直向同源物(ortholog))、基因多态性等突变体、以及衍生物的“核酸”。作为这样的编码同族体、突变体或衍生物的“核酸”，具体地，可举出具有在后面记载的严格条件下与序列号1～39的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列的互补序列杂交的碱基序列的“核酸”。另外，“基因”不考虑功能区的不同，可以包含例如表达控制区、编码区、外显子或内含子。此外，“基因”可以包含于细胞，也可以释放到细胞外而单独地存在，此外也可以处于内包于被称为外来体的小泡中的状态。
本说明书中，“外来体”(别名“Exosome”)是被由细胞分泌的脂双层包围的小泡。外来体来源于多泡内体，释放到细胞外环境时有时在内部包含RNA、DNA等“基因”、蛋白质等生物体物质。已知外来体包含于血液、血清、血浆、血清、淋巴液等体液中。
本说明书中，“转录产物”是指以基因的DNA序列作为模板而合成的RNA。RNA聚合酶与位于基因上游的被称为启动子的部位结合，以与DNA的碱基序列互补地使核糖核苷酸依次结合于3’末端的形式合成RNA。该RNA不仅包含基因本身，而且包含以表达控制区、编码区、外显子或内含子为代表的从转录起始点到多聚A序列的末端的全序列。本说明书中的“转录产物”除了上下文的连贯性不同的情况以外，还包含由以基因的DNA序列为模板合成的RNA(例如miRNA前体)生成的RNA(例如miRNA)。
此外，本说明书中，“微小RNA(miRNA)”只要没有特别说明，则主要是以作为发夹样结构的RNA前体被转录，被具有RNase III切割活性的dsRNA切割酶切割，被称为RISC的蛋白质复合体包入，参与mRNA的翻译抑制的15～25个碱基的非编码RNA(成熟miRNA)的含义来使用。另外本说明书中使用的“miRNA”除了从上下文的连贯性上仅指成熟miRNA的情况以外，不仅包含特定的碱基序列(或序列号)所示的“miRNA”，而且包含该“miRNA”的前体(pre-miRNA、pri-miRNA)、和与它们生物学功能同等的miRNA例如同族体(即，同源物或直向同源物)、基因多态性等突变体、和衍生物。作为这样的前体、同族体、突变体或衍生物，具体地，可举出能够通过miRBase版本21(http：//www.mirbase.org/)来鉴定，具有在后面记载的严格条件下与序列号1～39的任一项所示的特定碱基序列的互补序列杂交的碱基序列的“miRNA”。此外，本说明书中使用的“miRNA”可以为miR基因(编码miRNA前体的基因)的基因产物，这样的基因产物包含成熟miRNA(例如，上述那样的参与mRNA的翻译抑制的15～25个碱基、或19～25个碱基的非编码RNA)或miRNA前体(例如，上述那样的pre-miRNA或pri-miRNA)。
本说明书中，“探针”包含用于特异性地检测通过基因表达而产生的RNA或来源于该RNA的多核苷酸的多核苷酸和/或与其互补的多核苷酸。
本说明书中，“引物”包含特异性地识别、扩增通过基因表达而产生的RNA或来源于该RNA的多核苷酸的多核苷酸和/或与其互补的多核苷酸。
这里互补的多核苷酸(互补链、负链)，是指对由通过序列号1～39的任一项定义的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸的全长序列或其部分序列，基于A:T(U)、G:C这样的碱基对关系而处于碱基上互补的关系的多核苷酸。另外，由与序列号1～39的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列“互补的碱基序列组成的多核苷酸”这样的记载也基本可同样理解。
本说明书中，“严格条件”是指核酸探针、引物等多核苷酸以与针对其他序列相比更大的程度(例如背景测定值的平均+背景测定值的标准误差×2以上的测定值)对其目标序列杂交的条件。严格条件为序列依赖性的，根据杂交进行的环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，从而可以鉴定出对核酸探针等多核苷酸为100％互补的目标序列。“严格条件”的具体例见后述。
本说明书中，“Tm值”是指多核苷酸的双链部分变性成单链，双链与单链以1:1的比存在的温度。
本说明书中，“突变体”在核酸的情况下，是指由多态性、突变等引起的天然的突变体，或在序列号1～39的任一项的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列、或其部分序列中包含1个或2个以上(例如1～数个)碱基的缺失、替换、添加或***的突变体，或由与该碱基序列或其部分序列显示约90％以上、约95％以上、约97％以上、约98％以上、约99％以上的％同一性的碱基序列组成的多核苷酸突变体，或与包含该碱基序列的全长序列或其部分序列的多核苷酸或寡核苷酸在上述定义的严格条件下杂交的核酸。
本说明书中，“数个”是指约10、9、8、7、6、5、4、3或2个的整数。
本说明书中，多核苷酸的突变体可以使用定点诱变法、利用了PCR法的突变引入法等公知的技术来制作。
本说明书中，“％同一性”可以使用上述的利用BLAST、FASTA的蛋白质或基因的检索***，在导入间隙或不导入间隙的情况下确定(Zheng Zhang等，2000年，J.Comput.Biol.，7卷，p203-214；Altschul，S.F.等，1990年，Journal of MolecularBiology，第215卷，p403-410；Pearson，W.R.等，1988年，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第85卷，p2444-2448)。
本说明书中，“衍生物”是指修饰核酸，非限定地包含例如，利用荧光团等的标记化衍生物，包含修饰核苷酸(例如包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代基、羧甲基等基团的核苷酸和受到了碱基的重构、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等)的衍生物，包含PNA(peptide nucleic acid，肽核酸；Nielsen，P.E.等，1991年，Science，第254卷，p1497-500)、LNA(locked nucleic acid，锁核酸；Obika，S.等，1998年，Tetrahedron Lett.，第39卷，p5401-5404)等的核酸。
本说明书中，能够与选自上述作为恶性脑肿瘤标志物的miRNA组中的多核苷酸特异性地结合的“核酸”，是合成或制备的核酸，具体地，包含“核酸探针”或“引物”，为了检测受检体中有无恶性脑肿瘤存在，或诊断有无罹患恶性脑肿瘤、罹患的程度、恶性脑肿瘤有无改善、改善的程度、对恶性脑肿瘤的治疗的敏感性，或者为了筛选对恶性脑肿瘤的预防、改善或治疗有用的候选物质，而直接或间接利用。它们中包含能够与恶性脑肿瘤的罹患相关地在生物体内、特别是血液、尿等体液等样品中特异性地识别并结合序列号1～39的任一项所示的转录产物(多核苷酸)或其cDNA合成核酸的核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸。这些核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸基于上述性质可以作为用于检测在生物体内、组织、细胞内等表达的上述基因的探针有效地利用，此外可以作为用于扩增在生物体内表达的上述基因的引物有效地利用。
本说明书中使用的“检测”这样的术语可以用检查、测定、检测、判别、或判定支援这样的术语替换。此外，本说明书中“评价”这样的术语以包含基于检查结果或测定结果来支援诊断或评价的含义来使用。
本说明书中使用的“受检体”，是指包含人、黑猩猩的灵长类、犬、猫等宠物动物、牛、马、绵羊、山羊等家畜动物、小鼠、大鼠等啮齿类、动物园饲养的动物等哺乳动物。优选的受检体是人。有时将罹患了恶性脑肿瘤或良性脑肿瘤等疾病的“受检体”称为“患者”。另外，“健常体”也还是这样的哺乳动物，是指没有罹患要检测的癌的动物。优选的健常体是人。
本说明书中使用的“P”或“P值”，表示在统计学检验中，在原假设下实际观测到与由数据计算出的统计量相比极端的统计量的概率。因此“P”或“P值”越小，则越视为在比较对象间有显著性差异。
本说明书中，“灵敏度”是指(真阳性的数)/(真阳性的数+假阴性的数)的比例。如果灵敏度高，则能够早期发现恶性脑肿瘤，实现完全的癌症部的切除、复发率的降低。
本说明书中，“特异度”是指(真阴性的数)/(真阴性的数+假阳性的数)的比例。如果特异度高，则能够防止由将健常体误判为恶性脑肿瘤患者造成的无益的追加检查的实施，实现减轻患者的负担、减少医疗费。
本说明书中，“准确度”是指(真阳性的数+真阴性的数)/(总病例数)的比例。准确度表示对全部样品的判别结果正确的比例，成为评价判别性能(检测性能)的第一指标。
本说明书中成为判定、检测或诊断等的对象的“样品”，是指随着恶性脑肿瘤的发生、恶性脑肿瘤的进行、或对恶性脑肿瘤的治疗效果的发挥，本发明的基因的表达发生变化的组织和生物体材料。具体是指脑组织及其周围的血管、脑脊膜、怀疑转移的脏器、皮肤、以及血液、尿、脑脊液、唾液、汗、组织浸出液等体液、由血液制备的血清、血浆、以及其他粪便、毛发等。进而在使用由这些样品提取的生物体试样、具体为RNA、miRNA等的基因的情况，也包含在使用上述样品的判定、检测或诊断等中。
本说明书中使用的“hsa-miR-1909-3p基因”或“hsa-miR-1909-3p”这样的术语，包含序列号1所记载的hsa-miR-1909-3p基因(miRBase Accession No.MIMAT0007883)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-1909-3p基因可以通过Bar M等、2008年、Stem Cells、26卷、p2496-2505所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-1909-3p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-1909”(miRBase Accession No.MI0008330、序列号12)。
本说明书中使用的“hsa-miR-6869-5p基因”或“hsa-miR-6869-5p”这样的术语，包含序列号2所记载的hsa-miR-6869-5p基因(miRBase Accession No.MIMAT0027638)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-6869-5p基因可以通过Ladewig E等、2012年、Genome Res、22卷、p1634-1645所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-6869-5p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-6869”(miRBase Accession No.MI0022716、序列号13)。
本说明书中使用的“hsa-miR-3178基因”或“hsa-miR-3178”这样的术语，包含序列号3所记载的hsa-miR-3178基因(miRBase Accession No.MIMAT0015055)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-3178基因可以通过Stark MS等、2010年、PLoS One、5卷、e9685所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-3178”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-3178”(miRBase Accession No.MI0014212、序列号14)。
本说明书中使用的“hsa-miR-4787-5p基因”或“hsa-miR-4787-5p”这样的术语，包含序列号4所记载的hsa-miR-4787-5p基因(miRBase Accession No.MIMAT0019956)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-4787-5p基因可以通过Persson H等、2011年、Cancer Res、71卷、p78-86所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-4787-5p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-4787”(miRBase Accession No.MI0017434、序列号15)。
本说明书中使用的“hsa-miR-6510-5p基因”或“hsa-miR-6510-5p”这样的术语，包含序列号5所记载的hsa-miR-6510-5p基因(miRBase Accession No.MIMAT0025476)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-6510-5p基因可以通过Joyce CE等、2011年、Hum Mol Genet、20卷、p4025-4040所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-6510-5p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-6510”(miRBase Accession No.MI0022222、序列号16)。
本说明书中使用的“hsa-miR-4695-5p基因”或“hsa-miR-4695-5p”这样的术语，包含序列号6所记载的hsa-miR-4695-5p基因(miRBase Accession No.MIMAT0019788)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-4695-5p基因可以通过Persson H等、2011年、Cancer Res、71卷、p78-86所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-4695-5p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-4695”(miRBase Accession No.MI0017328、序列号17)。
本说明书中使用的“hsa-miR-4634基因”或“hsa-miR-4634”这样的术语，包含序列号7所记载的hsa-miR-4634基因(miRBase Accession No.MIMAT0019691)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-4634基因可以通过Persson H等、2011年、CancerRes、71卷、p78-86所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-4634”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-4634”(miRBase Accession No.MI0017261、序列号18)。
本说明书中使用的“hsa-miR-4449基因”或“hsa-miR-4449”这样的术语，包含序列号8所记载的hsa-miR-4449基因(miRBase Accession No.MIMAT0018968)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-4449基因可以通过Jima DD等、2010年、Blood、116卷、e118-127所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-4449”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-4449”(miRBase Accession No.MI0016792、序列号19)。
本说明书中使用的“hsa-miR-3195基因”或“hsa-miR-3195”这样的术语，包含序列号9所记载的hsa-miR-3195基因(miRBase Accession No.MIMAT0015079)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-3195基因可以通过Stark MS等、2010年、PLoS One、5卷、e9685所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-3195”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-3195”(miRBase Accession No.MI0014240、序列号20)。
本说明书中使用的“hsa-miR-6836-3p基因”或“hsa-miR-6836-3p”这样的术语，包含序列号10所记载的hsa-miR-6836-3p基因(miRBase Accession No.MIMAT0027575)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-6836-3p基因可以通过Ladewig E等、2012年、Genome Res、22卷、p1634-1645所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-6836-3p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-6836”(miRBase Accession No.MI0022682、序列号21)。
本说明书中使用的“hsa-miR-187-5p基因”或“hsa-miR-187-5p”这样的术语，包含序列号11所记载的hsa-miR-187-5p基因(miRBase Accession No.MIMAT0004561)、该基因的其他生物种同源物或直向同源物等。hsa-miR-187-5p基因可以通过Lim LP等、2003年、Science、299卷、p1540所记载的方法获得。另外，作为“hsa-miR-187-5p”的前体，已知采取发夹样结构的“hsa-mir-187”(miRBase Accession No.MI0000274、序列号22)。
另外，成熟型的miRNA从采取发夹样结构的RNA前体作为成熟型miRNA被切下时，有时以在序列的前后短1个～数个碱基或长1个～数个碱基的方式被切下、和/或发生碱基的置换而成为突变体，被称为isomiR(Morin RD.等、2008年、Genome Research、第18卷、p.610-621)。在miRBase版本21中，除了序列号1～9和11所示的碱基序列之外，还显示了大量被称为isomiR的序列号23～39所示的多核苷酸突变体和片段。这些突变体也还可以作为具有序列号1～9和11的任一项所示的碱基序列的miRNA的突变体或片段获得。
即，由本发明的序列号1～9和11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸的突变体中，作为例如登记在miRBase版本21的最长的突变体，分别可列举由序列号23～32所示的碱基序列组成的多核苷酸。另外，由本发明的序列号1、3、4、5、8、9、11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸的突变体中，作为例如登记在miRBase版本21的最短的突变体，分别可列举由序列号33～39所示的碱基序列组成的多核苷酸。另外，除了这些突变体和片段以外，还可列举登记在miRBase的作为针对序列号1、3、4、8、9、11的miRNA的多种isomiR的多核苷酸。进而，作为包含序列号1～11的任一项所示的碱基序列的多核苷酸的例子，分别可列举作为前体的序列号12～22的任一项所示的多核苷酸。
序列号1～39所示的基因(miRNA)的名称和miRBase Accession No.(登记号)记载于表1。
本说明书中“能够特异性地结合”是指本发明中使用的核酸、例如核酸探针或引物能够与特定的目标核酸结合，与其他核酸实质上不结合。
表1
序列号 基因名 miRBase登记号
1 hsa-miR-1909-3p MIMAT0007883
2 hsa-miR-6869-5p MIMAT0027638
3 hsa-miR-3178 MIMAT0015055
4 hsa-miR-4787-5p MIMAT0019956
5 hsa-miR-6510-5p MIMAT0025476
6 hsa-miR-4695-5p MIMAT0019788
7 hsa-miR-4634 MIMAT0019691
8 hsa-miR-4449 MIMAT0018968
9 hsa-miR-3195 MIMAT0015079
10 hsa-miR-6836-3p MIMAT0027575
11 hsa-miR-187-5p MIMAT0004561
12 hsa-mir-1909 MI0008330
13 hsa-mir-6869 MI0022716
14 hsa-mir-3178 MI0014212
15 hsa-mir-4787 MI0017434
16 hsa-mir-6510 MI0022222
17 hsa-mir-4695 MI0017328
18 hsa-mir-4634 MI0017261
19 hsa-mir-4449 MI0016792
20 hsa-mir-3195 MI0014240
21 hsa-mir-6836 MI0022682
22 hsa-mir-187 MI0000274
23 序列号1的isomiR例1 -
24 序列号2的isomiR例1 -
25 序列号3的isomiR例1 -
26 序列号4的isomiR例1 -
27 序列号5的isomiR例1 -
28 序列号6的isomiR例1 -
29 序列号7的isomiR例1 -
30 序列号8的isomiR例1 -
31 序列号9的isomiR例1 -
32 序列号11的isomiR例1 -
33 序列号1的isomiR例2 -
34 序列号3的isomiR例2 -
35 序列号4的isomiR例2 -
36 序列号5的isomiR例2 -
37 序列号8的isomiR例2 -
38 序列号9的isomiR例2 -
39 序列号11的isomiR例2 -
本说明书包含成为本申请的优先权的基础的日本专利申请2016-074717号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，能够容易并且高准确度地检测恶性脑肿瘤。
例如，以患者的可低侵袭性地采集的样品(血液、血清等)中的上述miRNA的测定值作为指标，能够容易地检测(判别)患者是否具有恶性脑肿瘤。
附图说明
图1显示由作为前体的序列号12所示的hsa-mir-1909生成的序列号1所示的hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-1909-5p的碱基序列的关系。
图2：左图是以作为学习样品组(training cohort)选择的恶性脑肿瘤患者(98人)、良性脑肿瘤患者(14人)、和健常体(100人)的hsa-miR-1909-3p(序列号1)的测定值作为纵轴而分别表示的图。右图是以作为验证样品组(validation cohort)选择的恶性脑肿瘤患者(49人)、良性脑肿瘤患者(7人)、和健常体(50人)的hsa-miR-1909-3p(序列号1)的测定值作为纵轴而分别表示的图。
图3：左图是由作为学习样品组选择的恶性脑肿瘤患者(98人)、健常体(100人)、和良性脑肿瘤患者(14人)的hsa-miR-1909-3p(序列号1)、hsa-miR-6869-5p(序列号2)的测定值使用Fisher判别分析制成判别式(z＝-1.952×(hsa-miR-1909-3p的表达量)-1.071×(hsa-miR-6869-5p的表达量)+30.884)，以由该判别式得到的判别得分作为纵轴、以样品组作为横轴而表示的图。图中的虚线表示判别得分为0的用于判别两组的判别边界。右图是对作为验证样品组选择的恶性脑肿瘤患者(49人)、健常体(50人)、和良性脑肿瘤患者(7人)的hsa-miR-1909-3p(序列号1)、hsa-miR-6869-5p(序列号2)的测定值，以由学习样品组中制成的判别式得到的判别得分作为纵轴、以样品组作为横轴而表示的图。图中的虚线表示判别得分为0的用于判别两组的判别边界。
图4：左图(与图3左图相同)：由作为学习样品组选择的恶性脑肿瘤患者(98人)、健常体(100人)、和良性脑肿瘤患者(14人)的hsa-miR-1909-3p(序列号1)、hsa-miR-6869-5p(序列号2)的测定值使用Fisher判别分析制成判别式(z＝-1.952×(hsa-miR-1909-3p的表达量)-1.071×(hsa-miR-6869-5p的表达量)+30.884)，以由该判别式得到的判别得分作为纵轴，以样品组作为横轴而表示的图。图中的虚线表示判别得分为0的用于判别两组的判别边界。右图是对作为验证样品组选择的中枢神经***原发恶性淋巴瘤患者37人、室管膜瘤患者6人、神经节神经胶质瘤患者5人、毛细胞型星形细胞瘤患者3人的hsa-miR-1909-3p(序列号1)、hsa-miR-6869-5p(序列号2)的测定值，以由学习样品组中制成的判别式得到的判别得分作为纵轴，以样品组作为横轴而表示的图。图中的虚线表示判别得分为0的用于判别两组的判别边界。
具体实施方式
以下更具体地说明本发明。
1.恶性脑肿瘤的目标核酸
作为用于使用本发明的上述定义的恶性脑肿瘤检测用的核酸/多核苷酸(例如核酸探针或引物)检测恶性脑肿瘤或恶性脑肿瘤细胞存在和/或不存在的恶性脑肿瘤标志物的主要目标核酸，可以使用选自由hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195和hsa-miR-6836-3p组成的组中的至少1种miRNA。进而作为能够与这些miRNA组合使用的其他恶性脑肿瘤标志物，hsa-miR-187-5p miRNA也可以作为目标核酸优选使用。作为目标核酸的上述miRNA包含例如，包含序列号1～11的任一项所示的碱基序列的人基因(例如，分别为hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195、hsa-miR-6836-3p和hsa-miR-187-5p)、其同族体、其转录产物、以及其突变体和衍生物。其中，基因、同族体、转录产物、突变体和衍生物如上述定义。
人样品中的优选的目标核酸是包含序列号1～39的任一项所示的碱基序列的人基因、或其转录产物，更优选为该转录产物，例如hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195、hsa-miR-6836-3p和hsa-miR-187-5p的miRNA，或作为其前体RNA的pri-miRNA或pre-miRNA。
第1目标基因是hsa-miR-1909-3p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第2目标基因是hsa-miR-6869-5p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第3目标基因是hsa-miR-3178基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第4目标基因是hsa-miR-4787-5p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第5目标基因是hsa-miR-6510-5p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第6目标基因是hsa-miR-4695-5p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第7目标基因是hsa-miR-4634基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第8目标基因是hsa-miR-4449基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第9目标基因是hsa-miR-3195基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第10目标基因是hsa-miR-6836-3p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。到目前为止未知本基因或其转录产物等的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
第11目标基因是hsa-miR-187-5p基因、其同族体、它们的转录产物、或者它们的突变体或衍生物。专利文献1中有hsa-miR-187-5p miRNA的表达的变化能够成为恶性脑肿瘤的标志物这样的报告。
2.恶性脑肿瘤的检测用的核酸
本发明中，可以使用能够与上述作为恶性脑肿瘤标志物的目标核酸特异性地结合的核酸作为用于检测(判别)或诊断恶性脑肿瘤的核酸、例如核酸探针或引物。
本发明中，能够用于检测恶性脑肿瘤、或者用于诊断恶性脑肿瘤的核酸、例如核酸探针或引物，能够定性和/或定量地测定上述作为恶性脑肿瘤标志物的目标核酸、即miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195、miR-6836-3p、或miR-187-5p基因、例如来源于人的hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195、hsa-miR-6836-3p或hsa-miR-187-5p基因、或它们的同族体、它们的转录产物、它们的突变体或衍生物、它们的前体、或者它们的任意组合的存在、表达量或存在量。
上述目标核酸与健常体或良性脑肿瘤患者相比，在罹患恶性脑肿瘤的受检体中，根据该目标核酸的种类而它们的表达量有的增加，也有的减少(以下也称为“增加/减少”)。因此，能与上述目标核酸特异性地结合的本发明的核酸，通过对于来源于怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体(例如人)的样品(例如血液等体液)和来源于健常体的样品测定上述目标核酸的表达量，将它们进行比较，能够有效地用于检测恶性脑肿瘤。另外，本发明的核酸通过对于来源于怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体(例如人)的样品(例如血液等体液)、和来源于良性的脑肿瘤患者的样品测定上述目标核酸的表达量，将它们进行比较，能够有效地用于从良性的脑肿瘤患者进行判别从而特异地检测恶性脑肿瘤。
本发明中能够使用的恶性脑肿瘤检测用的核酸探针或引物等核酸例如是，能够与由序列号1～10的至少1项所示的碱基序列组成的多核苷酸特异性地结合的核酸探针、或用于扩增由序列号1～10的至少1项所示的碱基序列组成的多核苷酸的引物。
作为本发明中能够使用的恶性脑肿瘤检测用的核酸探针或引物等核酸，进一步可以使用例如，能够与由序列号11所示的碱基序列组成的多核苷酸特异性地结合的核酸探针、或用于扩增由序列号11所示的碱基序列组成的多核苷酸的引物。
具体地，用于恶性脑肿瘤检测的上述核酸探针或引物等核酸包含：选自包含序列号1～39的任一项所示的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列的多核苷酸组及其互补多核苷酸组、与由与该碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸(例如，DNA)在严格条件(后述)下分别杂交的多核苷酸组及其互补多核苷酸组、以及包含这些多核苷酸组的碱基序列所含的15个以上、优选17个以上的连续碱基的多核苷酸组中的1个或数个多核苷酸的组合。这些多核苷酸可以作为用于检测目标核酸即上述恶性脑肿瘤标志物的核酸探针和引物使用。
更具体地，本发明中能够使用的恶性脑肿瘤检测用的核酸/多核苷酸、例如核酸探针或引物的例子是选自由以下多核苷酸(a)～(e)组成的组中的1种或多种多核苷酸。
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，以及
(e)与所述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
本发明中能够使用的恶性脑肿瘤检测用的核酸、例如核酸探针或引物除了包含选自由上述多核苷酸(a)～(e)组成的组中的至少1种多核苷酸之外，还可以包含选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组中的至少1种多核苷酸。
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，以及
(j)与所述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
上述多核苷酸的“该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段”可以包含各多核苷酸的碱基序列所含的例如从连续的15个到小于其序列的总碱基数、从17个到小于其序列的总碱基数、从19个到小于其序列的总碱基数等范围的碱基数的序列，但不限于这些。
本发明中使用的上述多核苷酸类或其片段类均既可以为DNA也可以为RNA。此外由规定的碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸是DNA。
本发明中能够使用的上述多核苷酸可以使用DNA重组技术、PCR法、利用DNA/RNA自动合成仪的方法等一般技术制作。
DNA重组技术和PCR法可以使用例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Willey&Sons，US(1993)；Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，US(1989)等所记载的技术。
序列号1～11所示的来源于人的hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195、hsa-miR-6836-3p和hsa-miR-187-5p是公知的，如前所述其获得方法也已知。因此，通过克隆该基因，能够制作作为本发明中能够使用的核酸探针或引物的多核苷酸。
这样的恶性脑肿瘤检测用的核酸探针或引物等核酸可以使用DNA自动合成装置化学合成。该合成一般使用亚磷酰胺(phosphoramidite)法，通过该方法可以自动合成直至约100个碱基的单链DNA。DNA自动合成装置由例如Polygen社、ABI社、Applied BioSystems社等市售。
或者，本发明的多核苷酸还可以通过cDNA克隆法来制作。cDNA克隆技术可以利用例如microRNA Cloning Kit Wako等。
其中，由与序列号1～11的任一项所示的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸不作为miRNA或其前体存在于生物体内。例如，序列号1所示的hsa-miR-1909-3p的碱基序列由序列号12所示的前体hsa-mir-1909生成，但该前体具有如图1所示的发夹样结构，hsa-miR-1909-3p(序列号1)和hsa-miR-1909-5p的碱基序列彼此具有错配序列。因此，由与序列号1所示的hsa-miR-1909-3p的碱基序列完全互补的碱基序列组成的多核苷酸不在生物体内自然地生成。同样地，由与序列号2～11的任一项所示的碱基序列完全互补的碱基序列组成的多核苷酸具有在生物体内不存在的人工的碱基序列。其中，由与目的碱基序列完全互补的碱基序列组成的多核苷酸是指仅由与目的碱基序列的全长序列互补的碱基序列组成的多核苷酸。
3.恶性脑肿瘤检测用试剂盒或器件
本发明还提供恶性脑肿瘤检测用的试剂盒或器件，包含用于测定作为恶性脑肿瘤标志物的目标核酸的、能够在本发明中作为核酸探针或引物使用的多核苷酸(其可以包含突变体、片段、或衍生物；以下有时称为检测用多核苷酸)的1种或多种。
作为本发明中的恶性脑肿瘤标志物的目标核酸优选为选自以下组1中的1种以上：miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p。与这些恶性脑肿瘤标志物组合，也可以进一步将miR-187-5p等别的恶性脑肿瘤标志物作为目标核酸使用。
本发明的试剂盒或器件包含能够与上述作为恶性脑肿瘤标志物的目标核酸特异性地结合的核酸、优选为选自上述“2.恶性脑肿瘤的检测用的核酸”中记载的恶性脑肿瘤检测用的核酸探针或引物等核酸、具体为上述2所记载的多核苷酸类中的1种或多种多核苷酸。
具体地，本发明的试剂盒或器件可以包含选自以下组中的至少1种多核苷酸：由包含序列号1～11的任一项所示的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列(或由序列号1～11的任一项所示的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列组成)的多核苷酸，包含与其互补的碱基序列(或由与其互补的碱基序列组成)的多核苷酸，这些多核苷酸的突变体或衍生物，这些多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，和与这些多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸组成的组。
本发明的试剂盒或器件可以包含的上述多核苷酸片段例如是选自下述(1)的组中的1种以上、优选为2种以上多核苷酸。
(1)包含序列号1～11的任一项所示的碱基序列中u为t的碱基序列或与其互补的碱基序列所含的15个以上连续碱基的多核苷酸。
在优选的实施方式中，上述多核苷酸是由序列号1～11的任一项所示的碱基序列、或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸，由其互补序列组成的多核苷酸，与这些多核苷酸与在严格条件下杂交的多核苷酸，或包含这些多核苷酸序列的15个以上、优选为17个以上、更优选为19个以上连续碱基的多核苷酸片段。
本发明中，多核苷酸的片段大小相对于各多核苷酸的碱基序列例如为连续的15个至小于其序列的总碱基数、17个至小于其序列的总碱基数、19个至小于其序列的总碱基数等范围的碱基数。
构成本发明的试剂盒或器件的上述多核苷酸的组合可以是例如，由后述表1所示的序列号(表1中的、与miRNA标志物对应的序列号1～11)所示的碱基序列或与其互补的碱基序列(互补序列)组成的上述多核苷酸的任意组合。例如，可列举能够与表6所记载的组合的序列号所示的多核苷酸分别特异性地结合的核酸的组合，但这些终究只是例示，其他各种可能的组合全部包含在本发明中。
例如，作为本发明中构成用于判别恶性脑肿瘤与健常体的试剂盒或器件的上述多核苷酸的组合，对于表1所示的序列号(目标核酸)的2个以上，期望将由各个序列号所示的碱基序列或与其互补的碱基序列或它们的片段等组成的上述多核苷酸组合。通常以表1所示的序列号的2个多核苷酸的组合能够获得充分的判别性能，但也可以将3个以上组合。
具体地，作为用于将恶性脑肿瘤患者与良性脑肿瘤患者和健常体判别的目标核酸使用的2个多核苷酸的组合，在选自由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸的2个多核苷酸的组合中，优选包含选自作为恶性脑肿瘤标志物新发现的序列号1～10中的1个以上的组合。可以将能够与这样的组合的目标核酸分别特异性地结合的核酸的组合在用于判别恶性脑肿瘤与健常体的试剂盒或器件中使用。
作为上述有癌症种类特异性的多核苷酸(目标核酸)的组合中的多核苷酸(目标核酸)的个数，可以为1个、2个、3个、4个、5个、或5个以上的个数的组合，更优选为4个以上的组合，通常4个多核苷酸的组合就能够获得充分的判别性能。
作为本发明中使用的目标核酸(恶性脑肿瘤标志物)的组合，非限定地，以下例示由序列号1所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸、和由选自上述癌症种类特异性多核苷酸组1所含的其他序列号(序列号2～10)和序列号11(miR-187-5p)的3个序列号所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸的组合。
(1)序列号1、3、4、6(标志物：miR-1909-3p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-4695-5p)的组合
(2)序列号1、3、5、6(标志物：miR-1909-3p、miR-3178、miR-6510-5p、miR-4695-5p)的组合
(3)序列号1、3、7、8(标志物：miR-1909-3p、miR-3178、miR-4634、miR-4449)的组合
(4)序列号1、3、7、10(标志物：miR-1909-3p、miR-3178、miR-4634、miR-6836-3p)的组合
(5)序列号1、3、7、11(标志物：miR-1909-3p、miR-3178、miR-4634、miR-187-5p)的组合
作为本发明中使用的目标核酸(恶性脑肿瘤标志物)的组合，非限定地，以下例示由序列号2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸、和由选自上述症种类特异性多核苷酸组1所含的其他序列号(序列号1、3～10)和序列号11(miR-187-5p)中的3个序列号所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸的组合。
(1)序列号2、3、5、7(标志物：miR-6869-5p、miR-3178、miR-6510-5p、miR-4634)的组合
(2)序列号2、4、5、11(标志物：miR-6869-5p、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-187-5p)的组合
(3)序列号2、5、6、11(标志物：miR-6869-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-187-5p)的组合
(4)序列号2、5、7、11(标志物：miR-6869-5p、miR-6510-5p、miR-4634、miR-187-5p)的组合
(5)序列号2、5、9、11(标志物：miR-6869-5p、miR-6510-5p、miR-3195、miR-187-5p)的组合
作为本发明中使用的目标核酸(恶性脑肿瘤标志物)的组合，非限定地，以下例示由序列号3所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸、和由选自上述癌症种类特异性多核苷酸组1所含的其他序列号(序列号1～2、4～10)和序列号11(miR-187-5p)的3个序列号所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸的组合。
(1)序列号3、4、5、9(标志物：miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-3195)的组合
(2)序列号3、4、5、10(标志物：miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-6836-3p)的组合
(3)序列号3、4、5、11(标志物：miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-187-5p)的组合
(4)序列号3、5、9、10(标志物：miR-3178、miR-6510-5p、miR-3195、miR-6836-3p)的组合
(5)序列号3、5、9、11(标志物：miR-3178、miR-6510-5p、miR-3195、miR-187-5p)的组合
适合将能够与上述例示的组合的目标核酸分别特异性地结合的核酸，在本发明的试剂盒或器件、或恶性脑肿瘤的检测(判别)方法中，作为恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸的集使用。
本发明的试剂盒或器件中除了上面说明的本发明中的恶性脑肿瘤的检测用的多核苷酸(其中可以包含由序列号1～10的至少1项所示的碱基序列或与其互补的碱基序列组成的多核苷酸、其突变体、片段或衍生物)之外，还可以包含能够进行恶性脑肿瘤检测的已知的多核苷酸或将来会发现的多核苷酸。
本发明的试剂盒所含的上述多核苷酸可以单独或任意地组合而包装于不同的容器。
本发明的试剂盒中，还可以包含用于从体液、细胞或组织提取核酸(例如总RNA)的试剂盒、标记用荧光物质、核酸扩增用酶和培养基、使用说明书等。
本发明的器件是以上所说明的本发明中的多核苷酸等核酸例如结合或附着于固相而得到的用于测定癌标志物的器件。固相的材质的例子为塑料、纸、玻璃、硅等，从加工的容易性方面考虑，优选的固相的材质为塑料。固相的形状是任意的，例如为方形、圆形、长条形、薄膜形等。本发明的器件包括例如用于通过杂交技术进行测定的器件，具体地，可以例示印迹器件、核酸阵列(例如微阵列、DNA芯片、RNA芯片等)等。
核酸阵列技术是通过使用下述方法，使上述核酸逐个结合或附着来制作芯片等阵列，使用该阵列并利用杂交来测定目标核酸的技术，所述方法是在根据需要实施了L赖氨酸涂布和/或氨基、羧基等官能团导入等表面处理的固相的表面上，使用被称为点样机(spotter)或点样仪(Arrayer)的高密度分注机来点样核酸的方法；使用由喷嘴通过压电元件等喷射微少的液滴的喷墨将核酸喷吹至固相的方法；在固相上依次进行核苷酸合成的方法等。
本发明的试剂盒或器件包含能够与上述组1的作为恶性脑肿瘤标志物的miRNA的至少1种、优选为至少2种、进一步优选为至少3种、最优选为至少5种至全部多核苷酸分别特异性地结合的核酸。本发明的试剂盒或器件进一步根据情况可以包含能够与作为已知的恶性脑肿瘤标志物的miR-187-5p特异性地结合的核酸。
本发明的试剂盒或器件可以用于下述“4.恶性脑肿瘤的检测方法”的恶性脑肿瘤的检测。
4.恶性脑肿瘤的检测方法
本发明还提供恶性脑肿瘤的检测方法，包括：使用上述“3.恶性脑肿瘤检测用试剂盒或器件”中说明的本发明的试剂盒或器件(包含本发明中能够使用的上述核酸)或恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸，测定(优选为体外(in vitro)测定)样品中的目标核酸的表达量、具体为选自以下组：miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p中的至少1种基因、和根据情况的miR-187-5p基因的表达量(典型地为miRNA或miRNA前体的量)。本方法中，对于从怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体采集的样品(例如，血液、血清、血浆等)测定样品中的目标核酸的表达量，然后进一步使用怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体的样品的上述目标核酸的表达量测定值、和使用从非恶性对照组(包含健常体或良性的脑肿瘤患者)采集的同样的样品(例如，血液、血清、血浆等)得到的相同的目标核酸的表达量(对照表达量)进行分析，例如将两表达量进行比较。本方法还可以包含在两者的该样品中的目标核酸的表达量在统计学上有显著性差异的情况下，评价怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体罹患了恶性脑肿瘤的步骤。本方法还可以包含使用对于来源于受检体的样品测定的上述目标核酸的表达量、和非恶性对照组的表达量(将它们进行比较)，评价受检体罹患了恶性脑肿瘤或者未罹患恶性脑肿瘤(是否罹患恶性脑肿瘤)，检测有无恶性脑肿瘤的步骤。受检体是否罹患恶性脑肿瘤的评价也可以是获得显示有无罹患恶性脑肿瘤的指标。在获得了显示罹患了恶性脑肿瘤的指标值的情况下，可以判断检测到受检体中存在恶性脑肿瘤，在获得了显示未罹患恶性脑肿瘤的指标值的情况下，可以判断未检测到受检体中的恶性脑肿瘤。
本发明的上述方法能够低侵袭地进行灵敏度和特异度高的癌症早期诊断，由此，带来早期的治疗和预后的改善，进一步能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放疗法和化疗法的治疗有效性。
在本发明的上述方法中，可以从本发明的血液、血清、血浆等样品提取可能包含来源于恶性脑肿瘤的目标核酸的核酸(典型地为RNA)，将其核酸提取物供于使用本发明的试剂盒或器件或恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸的目标核酸检测测定。作为从样品提取供于目标核酸检测测定的核酸的方法，特别优选加入3D-Gene(注册商标)RNA extractionreagent from liauid sample kit(东丽株式会社)中的RNA提取用试剂进行制备，但也可以使用一般的酸性苯酚法(酸胍酚氯仿(Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform；AGPC)法)，也可以使用Trizol(注册商标)(Life Technologies社)，也可以添加Trizol(lifetechnologies社)、Isogen(ニッポンジーン社)等的包含酸性苯酚的RNA提取用试剂进行制备。进一步可以利用miRNeasy(注册商标)Mini Kit(Qiagen社)等试剂盒，但不限定于这些方法。
本发明还提供本发明的试剂盒或器件、或能够用于它们的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸(能够与1个上述目标核酸miRNA与特异性地结合的多核苷酸、或能够与2个以上上述目标核酸miRNA分别特异性地结合的多核苷酸的组合)的应用，用于体外(in vitro)检测来源于受检体的样品中的来源于恶性脑肿瘤的miR基因的表达产物。本发明还提供本发明的试剂盒或器件、或恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸(能够与1个上述目标核酸miRNA与特异性地结合的多核苷酸、或能够与2个以上上述目标核酸miRNA分别特异性地结合的多核苷酸的组合)在受检体中的恶性脑肿瘤的检测中的应用。本发明还提供受检体中的恶性脑肿瘤的检测或诊断用的本发明的试剂盒或或器件、或上述多核苷酸(能够与1个上述目标核酸miRNA与特异性地结合的多核苷酸、或能够与2个以上上述目标核酸miRNA分别特异性地结合的多核苷酸的组合)。本发明还提供包含上述多核苷酸(能够与1个上述目标核酸miRNA与特异性地结合的多核苷酸、或能够与2个以上上述目标核酸miRNA分别特异性地结合的多核苷酸的组合)的针对恶性脑肿瘤的诊断药。本发明的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸、试剂盒和器件等对恶性脑肿瘤的诊断有用。
本发明的上述方法中，上述试剂盒或器件使用如以上所说明那样的以单一或所有可能组合包含本发明中能够使用的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸。
在本发明的恶性脑肿瘤的检测或(基因)诊断中，本发明的试剂盒或装置所包含的多核苷酸可以作为探针或引物使用。在作为引物使用的情况下，可以利用LifeTechnologies社的TaqMan(注册商标)MicroRNA Assays，Qiagen社的miScript PCR System等，但不限定于这些方法。
本发明的试剂盒或器件所包含的多核苷酸可以在RNA印迹法、DNA印迹法、原位杂交法、Northern杂交(RNA杂交)法、Southern杂交(DNA杂交)法等杂交技术、定量RT-PCR法等定量扩增技术等特异性地检测特定基因的公知的方法中，按照常规方法作为引物或探针来利用。作为测定对象样品，根据使用的检测方法的种类，采集受检体的血液、血清、血浆、尿等体液。或可以使用由这样的体液通过上述方法制备的总RNA，进一步可以使用以该RNA为基础制备的包含cDNA的各种多核苷酸。
本发明的试剂盒或器件对于恶性脑肿瘤的诊断或罹患有无的检测是有用的。具体地，使用了该试剂盒或器件的恶性脑肿瘤的检测可以如下进行：从怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体，使用血液、血清、血浆、尿等样品，体外检测用该试剂盒或器件所包含的核酸探针或引物检测到的基因的表达量。使用本发明的试剂盒或器件所含的由序列号1～11的至少1项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸或由与这些碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、它们的突变体或衍生物、或它们的包含15个以上连续碱基片段测定怀疑罹患恶性脑肿瘤的受检体的血液、血清、血浆、尿等样品中目标核酸(miRNA等恶性脑肿瘤标志物)的量，在其表达量与非恶性对照组(健常体或良性脑肿瘤患者)的血液、血清、或血浆、尿等样品中的它们的表达量相比在统计学上有显著性差异的情况下，例如可以使用判别式，评价该受检体罹患了恶性脑肿瘤。
本发明的方法可以与CT扫描、MRI(核磁共振装置)、脑血管造影法等图像诊断法组合。
利用了本发明的试剂盒或器件检测样品中不含来源于恶性脑肿瘤的上述miR基因的表达产物、或包含来源于恶性脑肿瘤的上述miR基因的表达产物的检测方法包括：采集受检体的血液、血清、血浆、尿等体液作为样品，使用选自本发明的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸组中的一种或多种多核苷酸(突变体、片段或衍生物)测定其中所含的目标基因(miR基因)的表达量，从而评价有无恶性脑肿瘤或检测恶性脑肿瘤。另外使用本发明的恶性脑肿瘤的检测方法，例如还可以在对恶性脑肿瘤患者为了改善该疾病而施与了治疗药的情况下评价或诊断该疾病有无改善或改善的程度。
本发明的方法例如可以包括以下的(a)、(b)和(c)的步骤：
(a)使来源于受检体的样品与本发明的试剂盒或器件中的多核苷酸、或本发明的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸体外(in vitro)接触的步骤，
(b)使用上述多核苷酸作为核酸探针或引物来测定样品中的目标核酸的表达量的步骤，
(c)基于(b)的结果，评价该受检体中存在或不存在恶性脑肿瘤(细胞)的步骤。
在上述步骤(a)中，作为优选的样品，可以使用血液、血清、或血浆。
在上述步骤(b)中，表达量的测定可以通过核酸阵列法等杂交技术、利用测序仪等确定多核苷酸的碱基序列的技术、定量RT-PCR法等定量扩增技术等技术来进行。
上述步骤(c)也可以是基于(b)的结果，评价受检体是否罹患恶性脑肿瘤，由此检测该受检体中存在或不存在恶性脑肿瘤(细胞)的步骤。在上述步骤(c)中，在来源于受检体的样品中的目标核酸的表达量与来源于健常体或良性脑肿瘤患者(非恶性对照组)的样品中的目标核酸的表达量(也称为“参照”(Reference)或“对照”(Control))相比在统计学上显著性差异的情况下，可以基于来源于受检体的样品中的目标核酸的表达量和由判别式得到的判别得分，评价(判别)该受检体是否罹患恶性脑肿瘤。
具体地，本发明提供恶性脑肿瘤的检测方法，包括以下步骤：使用能够与选自由miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p组成的组中的至少1种(1种或多种)、优选为至少2种、至少3种、至少4种、或至少5种、或5种以上目标核酸多核苷酸特异性地结合的核酸，测定受检体的样品中的目标核酸的表达量，使用该测定而得的表达量、和同样测定而得的健常体或良性脑肿瘤患者(非恶性对照组)的表达量(对照表达量)，体外(in vitro)评价受检体罹患了恶性脑肿瘤或者未罹患恶性脑肿瘤(是否罹患恶性脑肿瘤)，检测受检体中有无(存在或不存在)恶性脑肿瘤。
本说明书中，“评价”也可以不是由医师做出的判定，而是基于体外(in vitro)检查的结果的评价支援。
如上所述，在本发明的方法的优选实施方式中，具体地，miR-1909-3p为hsa-miR-1909-3p，miR-6869-5p为hsa-miR-6869-5p，miR-3178为hsa-miR-3178，miR-4787-5p为hsa-miR-4787-5p，miR-6510-5p为hsa-miR-6510-5p，miR-4695-5p为hsa-miR-4695-5p，miR-4634为hsa-miR-4634，miR-4449为hsa-miR-4449，miR-3195为hsa-miR-3195，miR-6836-3p为hsa-miR-6836-3p。
另外，在本发明的方法的优选实施方式中，具体地，能够与上述目标核酸特异性地结合的核酸(具体地，通常为探针或引物)选自由下述(a)～(e)所示的多核苷酸组成的组，
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(e)与上述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
在本发明的方法中，除了这些多核苷酸之外，还可以使用能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸。
在优选的实施方式中，对于能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸，具体地，miR-187-5p为hsa-miR-187-5p。
进而，在优选的实施方式中，具体地，能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组，
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(j)与上述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
作为本发明的方法中使用的样品，可列举受检体的生物体组织、血液、血清、血浆、尿、脑脊液等体液等，优选为血液、血清、或血浆。可以将该生物体组织或体液等样品直接用于表达量的测定，也可以将由这些样品制备的含RNA的核酸试样、由该核酸试样进一步制备的包含多核苷酸的试样用于测定。
本说明书中受检体是指哺乳动物，例如非限地指人、猴、小鼠、大鼠等，优选为人。
本发明的方法可以根据作为测定对象使用的样品的种类来变更步骤。
在作为测定对象物利用RNA的情况下，受检体中的恶性脑肿瘤(细胞)的检测可以包括例如下述步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受检体的样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸(cDNA)与本发明的试剂盒或器件中的多核苷酸结合的步骤，
(b)通过使用上述多核苷酸作为核酸探针的杂交技术、或者通过使用上述多核苷酸作为引物的定量RT-PCR、或者通过用测序仪确定多核苷酸(上述RNA或cDNA)的碱基序列，来定量或定性地测定与该多核苷酸结合的来源于样品的RNA或由该RNA合成的cDNA的步骤，
(c)基于上述(b)的测定结果，检测恶性脑肿瘤(或来源于恶性脑肿瘤的基因表达量的变化)存在或不存在的步骤。
步骤(c)中，也可以基于上述(b)的测定结果，与健常体或良性脑肿瘤患者(非恶性对照组)进行比较，评价受检体是否罹患恶性脑肿瘤，由此检测受检体中存在或不存在恶性脑肿瘤(或来源于恶性脑肿瘤的基因表达量的变化)。步骤(a)还优选进一步包括将结合了来源于样品的RNA或cDNA后的本发明的试剂盒或器件用缓冲液等洗涤液进行洗涤，由此除去未与本发明的试剂盒或器件中的多核苷酸结合的多核苷酸的操作。
为了通过本发明体外(in vitro)检测、检查、评价或诊断恶性脑肿瘤(或来源于恶性脑肿瘤的基因表达量的变化)，可以使用例如各种杂交法。在这样的杂交法中，可以使用例如RNA印迹法、DNA印迹法、RT-PCR法、DNA芯片分析法、原位杂交法、Northern杂交(RNA杂交)法、Southern杂交(DNA杂交)法、利用测序仪等确定多核苷酸的碱基序列的技术等。
在利用RNA印迹法的情况下，通过使用本发明中能够使用的上述核酸探针，可以检测、测定RNA中的各基因表达的有无、其表达量。具体地，可以例示下述方法：将核酸探针(互补链)用放射性同位素(32P、33P、35S等)、荧光物质等进行标记，使其与按照常规方法转印至尼龙膜等的来源于受检体的生物体组织或体液(血液、血清、血浆等)等的样品的RNA杂交后，用放射线检测器(可以例示BAS-1800II(富士写真フィルム株式会社)等)或荧光检测器(可以例示STORM 865(GEヘルスケア社)等)检测、测定来源于所形成的DNA/RNA双链的标记物(放射性同位素或荧光物质)的信号的方法。
在利用定量RT-PCR法的情况下，通过使用本发明中能够使用的上述引物，可以检测或测定RNA中的基因表达的有无、其表达量。具体地，可以例示下述方法：由来源于受检体的生物体组织或体液(血液、血清、血浆等)等样品的RNA按照常规方法制备cDNA，将其作为模板以使目标的各基因区能够扩增的方式，使本发明的1对引物(由与上述cDNA结合的正链引物和负链引物组成)与cDNA杂交，通过常规方法进行PCR法，检测所得的双链DNA的方法。另外，作为双链DNA的检测法，可以包括下述方法：使用预先用放射性同位素、荧光物质标记了的引物进行上述PCR的方法；将PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭等将双链DNA进行染色来检测的方法；使产生的双链DNA按照常规方法转印至尼龙膜等，使其与标记了的核酸探针杂交来检测的方法。
在利用测序仪的情况下，可以例示以下方法：通过使用本发明中能够使用的上述引物，由能够根据引导数检测或测定RNA中的基因表达的有无、其表达量的具体例如来源于受检体的生物体组织或体液(血液、血清、血浆等)等样品的RNA，按照常规方法制备cDNA，使以能够以其为模板扩增作为目标核酸的miR基因表达产物的至少一部分区域的方式设计的引物对(各引物分别包含与上述cDNA结合的正链序列和负链序列)与上述cDNA杂交，通过常规方法进行PCR等核酸扩增，用测序仪检测或测定扩增的DNA的方法。作为测序仪，例如，可以使用HiSea 2500(Illumina)或Ion Proton(注册商标)System(Thermo FisherScientific)。或者还可例示以下方法：将受检体的生物体组织或体液(血液、血清、血浆等)等样品不对样品中的RNA进行核酸扩增，直接用于PacBio RS II(Pacific Biosciences)等测序仪，检测或测定目标核酸。
在利用核酸阵列技术(核酸阵列分析)的情况下，使用将本发明的核酸探针(单链或双链)粘附于基板(固相)而成的RNA芯片或DNA芯片。将粘附有核酸探针的区域称为探针点(probe spot)，将未粘附核酸探针的区域称为空白点(blank spot)。将基因群固相化于基板而得的物质一般而言有核酸芯片、核酸阵列、微阵列等这样的名称，DNA或RNA阵列包含DNA或RNA宏阵列和DNA或RNA微阵列，在本说明书中提到芯片的情况下，包括它们全部。作为DNA芯片，可以使用3D-Gene(注册商标)Human miRNA Oligo chip(东丽株式会社)，但不限于此。
对DNA芯片的测定不限定，例如可以例示将来源于heusan探针的标记物的信号用图像检测器(可以例示Typhoon 9410(GEヘルスケア社)，3D-Gene(注册商标)扫描仪(东丽株式会社)等)进行检测、测定的方法。
本说明书中使用的“严格条件”，是如上述那样核酸探针以比针对其他序列更大的程度(例如背景测定值的平均+背景测定值的标准误差×2以上的测定值)，对其目标序列杂交的条件。
严格条件根据杂交和之后的洗涤条件来规定。对其杂交的条件不限定，例如在30℃～60℃，在包含SSC、表面活性剂、甲酰胺、右旋糖酐硫酸盐、封闭剂等的溶液中进行1～24小时的条件。这里，1×SSC是包含150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠的水溶液(pH7.0)，表面活性剂包含SDS(十二烷基硫酸钠)、Triton、或Tween等。作为杂交条件，更优选包含3～10×SSC、0.1～1％SDS。作为规定严格条件的另一条件的杂交后的洗涤条件，可举出例如，利用30℃的包含0.5×SSC和0.1％SDS的溶液、和30℃的包含0.2×SSC和0.1％SDS的溶液、以及30℃的0.05×SSC溶液的连续洗涤等条件。互补链优选是即使在这样的条件下洗涤也与作为对象的正链维持杂交状态的互补链。具体地，作为这样的互补链，可以例示由与对象的正链的碱基序列处于完全互补的关系的碱基序列组成的链，以及与该链具有至少80％、优选为至少85％、更优选为至少90％或至少95％、例如至少98％或至少99％的同一性的碱基序列组成的链。
关于这些杂交中的“严格条件”的其他例子，例如记载于Sambrook，J.&Russel，D.著，Molecular Cloning，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001年1月15日发行的第1卷7.42～7.45，第2卷8.9～8.17等，可以在本发明中利用。
作为将本发明的试剂盒中的恶性脑肿瘤检测用的多核苷酸片段作为引物来实施PCR时的条件的例子，可举出例如使用10mM Tris-HCL(pH8.3)、50mM KCL、1～2mM MgCl2等的组成的PCR缓冲液，在由该引物的序列计算得到的Tm值+5～10℃下进行15秒～1分钟左右处理等。作为这样的Tm值的计算方法，可举出Tm值＝2×(腺嘌呤残基数+胸腺嘧啶残基数)+4×(鸟嘌呤残基数+胞嘧啶残基数)等。
此外，在使用定量RT-PCR法的情况下，可以使用TaqMan(注册商标)MicroRNAAssays(Life Technologies社)、LNA(注册商标)-based MicroRNA PCR(Exiqon社)、Ncode(注册商标)miRNA qRT-PCT试剂盒(invitrogen社)等为了定量地测定miRNA而特别地设计的市售的测定用试剂盒。
对基因表达量(例如，miRNA或其前体的量)的计算不限定，在本发明中可以利用例如Statistical analysis of gene expression microarray data(Speed T.著，Chapmanand Hall/CRC)，和A beginner’s guide Microarray gene expression data analysis(Causton H.C.等著，Blackwell publishing)等所记载的统计学处理。例如可以在DNA芯片上的空白点的测定值的平均值上加上空白点的测定值的标准偏差的2倍、优选为3倍、更优选为6倍，将具有该值以上的信号值的探针点视为检测点。进一步，可以将空白点的测定值的平均值视为背景，从探针点的测定值减去，作为基因表达量。对于基因表达量的缺损值，可以从分析对象中除去，或者优选用各DNA芯片中的基因表达量的最小值替换，或者更优选用从基因表达量的最小值的对数值中减去0.1后的值替换。进而，为了除去低信号的基因，可以仅选择测定样品数的20％以上、优选为50％、更优选为80％以上中具有2的6次方、优选为2的8次方、更优选为2的10次方以上的基因表达量的基因作为分析对象。作为基因表达量的归一化(归一化，normalization)，不限定，可举出例如整体归一化(globalnormalization)、分位数归一化(quantile normalization)(Bolstad，B.M.等，2003年，Bioinformatics，19卷，p185-193)，以及通过在所有样品之间稳定表达的内源性对照miRNA的表达量测定值来校正的方法(A.Shimomura等、2016年、Cancer Sci、DOI：10.1111)等。
本发明还提供对受检体中的恶性脑肿瘤进行检测(或辅助检测)的方法，包括：使用本发明的恶性脑肿瘤检测用多核苷酸、试剂盒、器件(例如芯片)、或它们的组合，测定来源于受检体的样品中的目标基因的表达量，在判别式(判别函数)中带入上述来源于受检体的样品中的目标基因的表达量，由此评价恶性脑肿瘤存在还是不存在的步骤，所述判别式(判别函数)是将来源于已知具有恶性脑肿瘤的受检体(或患者)的样品的基因表达量与来源于健常体或良性脑肿瘤患者的样品的基因表达量作为教师样本制成的，并且能够区别地判别恶性脑肿瘤与健常或良性脑肿瘤。
即，本发明进一步提供包括下述步骤的方法：使用本发明的检测用多核苷酸、试剂盒、器件(例如芯片)、或它们的组合，对已知受检体包含恶性脑肿瘤和/或不包含恶性脑肿瘤的多个样品中的目标基因(目标核酸)的表达量进行体外(in vitro)测定的第1步骤；制成将由上述第1步骤获得的该目标基因的表达量的测定值作为教师样品的判别式的第2步骤；与第1步骤同样地体外(in vitro)测定来源于受检体的样品中的该目标基因的表达量的第3步骤；在由上述第2步骤获得的判别式中代入由第3步骤获得的该目标基因的表达量的测定值，基于由该判别式获得的结果，确定或评价受检体包含恶性脑肿瘤或者不包含恶性脑肿瘤的第4步骤，所述方法中，该目标基因是能够通过该多核苷酸、试剂盒或装置(例如芯片)所包含的检测用多核苷酸检测的基因。
本说明书中，判别式可以使用能够制成区别地判别恶性脑肿瘤与健常的判别式的任意判别分析法、例如Fisher的判别分析、利用马氏距离的非线性判别分析、神经网络、支持向量机(Support Vector Machine(SVM))等，但不限于这些具体例。
线性判别分析在分组的边界为直线或超平面的情况下是使用式1作为判别式来判别组的所属的方法。这里，x为说明变量，w为说明变量的系数，w0为常数项。
可以将由判别式获得的值称为判别得分，将新给予的数据集的测定值作为说明变量代入该判别式，以判别得分的符号判别分组。
作为线性判别分析的一种的Fisher的判别分析是用于选择适于进行类别判别(class discrimination)的维度的维度减少法，着眼于复合变量的方差(variance)，通过将具有相同标签的数据的方差最小化从而构成判别力高的复合变量(Venables，W.N.等著Modern Applied Statistics with S.Fourth edition.Springer.，2002年)。Fisher的判别分析中求出使式2为最大那样的投影方向w。这里，μ为输入的平均，ng为属于类别g的数据数，μg为属于类别g的数据的输入的平均。分子、分母分别为将数据投影到向量w的方向时的组间方差、组内方差，通过将该比最大化而求出判别式系数wi(金森敬文等著，“パターン認識”，共立出版(2009年)，Richard O.等著，Pattern Classification Second Edition.，Wiley-Interscience，2000年)。
其中，使满足
马氏距离由考虑了数据相关的式3算出，可以用作将各组的马氏距离近的组作为所属组进行判别的非线性判别分析。这里，μ为各组的中心向量，S-1为该组的方差协方差矩阵的逆矩阵。中心向量由说明变量x算出，可以使用均值向量、中心值向量等。
所谓SVM，是V.Vapnik考察了的判别分析法(The Nature of StatisticalLeaning Theory，Springer，1995年)。将要分类的分组已知的数据集的特定的数据项目作为说明变量，将要分类的分组作为目标变量，确定用于将该数据集正确地分类于已知的分组的被称为超平面的边界面，确定使用该边界面分类数据的判别式。而且该判别式通过将新给予的数据集的测定值作为说明变量代入该判别式，从而可以判别分组。此外，此时的判别结果可以为要分类的组，也可以为可分类于要分类的组的概率，也可以为距超平面的距离。对于SVM，作为用于应对非线性的问题的方法，已知将特征向量向高维度非线性变换，在该空间进行线性判别的方法。将非线性映射的空间中的二个要素的内积仅通过各自原来空间的输入来表现那样的算式称为核(kernel)，作为核的一例，可举出线性核、RBF(径向基函数，Radial Basis Function)核、高斯核。通过核来映射到高维度，并且实际上避开被映射的空间的特征的计算而仅通过核的计算来构成最佳的判别式，即判别式(例如，麻生英树等著，統計科学のフロンテイア6“パターン認識と学习の統計学新しい概念と手法”，岩波书店(2004年)，Nello Cristianini等著，SVM入门，共立出版(2008年))。
作为SVM法的一种的C-支持向量分类(C-support vector classification(C-SVC))是以2组的说明变量进行学***面，判别未知的数据集分类于哪个组(C.Cortes等，1995年，Machine Learning，20卷，p273-297)。
以下示出本发明的方法中能够使用的C-SVC的判别式的算出例。首先，将全部受检体分组成恶性脑肿瘤患者与健常体2组。为了判断受检体是恶性脑肿瘤患者还是健常体，可以使用例如脑的图像检查。
接下来，准备由分开的2组的血清来源的样品的全基因表达量组成的数据集(以下，学习样品组)，确定将在该2组之间基因表达量可见明确差异的基因设为说明变量、将该分组设为目标变量(例如-1和+1)的基于C-SVC的判别式。式4为最优化的目标函数，这里，e表示全部的输入向量，y表示目标变量，a表示Lagrange未定乘数向量，Q表示正定值矩阵，C表示调整限制条件的参数。
其中，使满足yTa＝0,0≤ai≤C,i＝1,...,l,
式5为最终获得的判别式，可以由通过判别式获得的值的符号确定所属的组。这里，x为支持向量，y为显示组的所属的标签，a为对应的系数，b为常数项，K为核函数。
作为核函数，可以使用例如由式6定义的RBF核。这里，x表示支持向量，γ表示调整超平面的复杂度的核参数。
K(xi,xj)＝exp(-r||xi-xj||2),r＜0 式6
除了这些以外，作为确定或评价受检体包含或不包含恶性脑肿瘤、或者将来源于受检体的样品中的来源于恶性脑肿瘤的目标基因的表达量与来源于健常体的对照进行比较来评价的方法，可以选择神经网络、k-近邻法、决策树、逻辑回归分析等方法。
本发明的方法可以包括例如下述步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使用本发明的检测用多核苷酸、试剂盒或器件(例如DNA芯片)测定已知来源于恶性脑肿瘤患者和来源于健常体或不包含恶性脑肿瘤的良性脑肿瘤患者的样品中的目标基因(目标核酸)的表达量的步骤，
(b)由通过(a)测得的表达量的测定值，制成上述式1～3、5和6的判别式的步骤，
(c)使用本发明的检测用多核苷酸、试剂盒或器件(例如DNA芯片)测定来源于受检体的样品中的该目标基因的表达量，在由(b)制成的判别式中代入测定值，基于所得的结果来确定或评价受检体包含还是不包含恶性脑肿瘤，或者将来源于恶性脑肿瘤的表达量与来源于健常体或良性脑肿瘤患者来源的对照表达量进行比较来评价的步骤。
其中，式1～3、5和6的式中的x为说明变量，包含通过测定选自上述2节所记载的多核苷酸类中的多核苷酸或其片段而得的值，具体地用于判别本发明的恶性脑肿瘤患者与健常体或良性脑肿瘤患者的说明变量是选自例如下述(1)～(2)的基因表达量。
(1)通过包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列或与其互补的碱基序列所含的15个以上连续碱基的DNA等多核苷酸的任一项测定的恶性脑肿瘤患者、健常体、和良性脑肿瘤患者的血清中的基因表达量。
(2)通过包含序列号11所示的碱基序列或与其互补的碱基序列所含的15个以上连续碱基的DNA等多核苷酸的任一项测定的恶性脑肿瘤患者、健常体、和良性脑肿瘤患者的血清中的基因表达量。
如以上所示，对于来源于受检体的样品，作为确定或评价该受检体是否具有恶性脑肿瘤的方法，判别式的制成需要由学习样品组制成的判别式，为了提高该判别式的判别准确度，需要将在学习样品组中的由恶性脑肿瘤患者组与健常体组2组之间、或者由恶性脑肿瘤患者组与良性脑肿瘤患者组2组之间的表达量存在明确差异的基因用于判别式。
此外，判别式的说明变量所使用的基因的确定优选如下进行。首先，将作为学习样品组的恶性脑肿瘤患者组的全基因表达量和键常体组的全基因表达量作为数据集，利用作为参数分析的t检验的P值、作为非参数分析的Mann-Whitney的U检验的P值、或Wilcoxon检验的P值等，求出该2组间的各基因的表达量的差的大小。
在通过检验获得的P值的危险度(显著性水平)为例如小于5％、1％或0.01％的情况下可以视为统计上显著。
为了校正起因于重复进行检验的第一类错误的概率的增大，可以通过公知的方法，例如Bonferroni、Holm等的方法进行校正(例如，永田靖等著，“統計的多重比較法の基礎”，サイエンティスト社(东京、日本)(2007年))。如果例示Bonferroni校正，则例如将通过检验而得的P值乘以检验的重复次数即分析所用的基因数，与所期望的显著性水平进行比较，从而可以抑制检验整体中的发生第一类错误的概率。
此外，不是检验，而是在恶性脑肿瘤患者组的基因表达量与键常体组的基因表达量之间，算出各自的基因表达量的中值的表达比的绝对值(Fold change)，可以选择判别式的说明变量所使用的基因。此外，可以使用恶性脑肿瘤患者组和键常体组的基因表达量来制成ROC曲线，将AUROC值作为基准选择判别式的说明变量所使用的基因。
接下来，使用这里所求出的基因表达量的差较大的任意个数的基因，制成可以通过上述各种方法算出的判别式。作为构建获得最大判别准确度的判别式的方法，例如有下述方法：以满足P值的显著性水平的基因的所有组合构建判别式的方法；一边将为了制成判别式而使用的基因以基因表达量的差大的顺序一个一个的增加，一边反复进行评价的方法等(Furey TS.等，2000年，Bioinformatics.，16卷，p906-14)。对该判别式，将别的独立的恶性脑肿瘤患者或健常体的基因表达量代入说明变量，对该独立的恶性脑肿瘤患者或健常体算出所属的组的判别结果。即，通过以独立的样品组对找到的诊断用基因集(gene set)和使用诊断用基因集构建的判别式进行评价，可以找到更普遍的能够检测恶性脑肿瘤的诊断用基因集和判别恶性脑肿瘤的方法。
此外，该判别式的判别性能(泛化性)的评价中优选使用分割样品(Split-sample)法。即，将数据集分成学习样品组和验证样品组，在学习样品组中通过统计学检验进行基因的选择和判别式制成，使用利用该判别式判别了验证样品组的结果和验证样品组所属的真的组算出准确度、灵敏度、特异度，评价判别性能。另一方面，还可以不分割数据集，使用全部样品通过统计学检验进行基因的选择和判别式制成，将新准备的样品用该判别式判别来算出准确度、灵敏度、特异度，评价判别性能。
例如，将包含上面记载的那样的基于序列号1～10的任一项所示的碱基序列或其互补序列的1种或2种以上的上述多核苷酸，以及根据情况进一步包含基于序列号11所示的碱基序列或其互补序列的1种或2种以上的上述多核苷酸的任意组合作为诊断用基因集。进而，使用来源于图像检查、组织诊断的诊断结果为恶性脑肿瘤的患者的样品、和来源于良性的脑肿瘤患者或健常体的样品中的该诊断用基因集的表达量构建判别式。其结果是通过测定未知的样品的该诊断用基因集的表达量，能够以高准确度和灵敏度区分未知的样品所来源的受检体包含恶性脑肿瘤还是不包含恶性脑肿瘤。
实施例
通过以下的实施例来进一步具体地说明本发明。然而，本发明的范围不受该实施例的限制。
[参考例1]
＜脑肿瘤患者与健常体的样品的采集＞
将从获得了知情同意的健常体100人、以及作为除了脑肿瘤以外未发现原发癌的恶性脑肿瘤患者的神经胶质瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)患者98人(II级23例、III级25例、IV级50例)和作为良性脑肿瘤患者的脑脊膜瘤患者14人使用Venoject II真空采血管VP-AS109K60(テルモ株式会社)分别采集的血清样品作为学习样品组。同样地，从获得了知情同意的健常体50人、以及作为除了脑以外未发现原发癌的恶性脑肿瘤患者的神经胶质瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)患者49人(II级7例、III级13例、IV级29例)和作为良性脑肿瘤患者的脑脊膜瘤患者7人使用Venoject II真空采血管VP-AS109K60(テルモ株式会社)分别采集的血清样品作为验证样品组。
＜总RNA的提取＞
作为样品，将上述学习样品组、验证样品组合并而从健常体150人以及恶性脑肿瘤患者147人、良性脑肿瘤患者21人的合计318人分别获得血清300μL，使用3D-Gene(注册商标)RNA extraction reagent from liauid sample kit(东丽株式会社)中的RNA提取用试剂，按照该社制定的方案(protocol)从上述各血清获得总RNA。
＜基因表达量的测定＞
作为样品，对将上述学习样品组、验证样品组合并从健常体150人、恶性脑肿瘤患者147人、良性脑肿瘤患者21人的合计318人的血清获得的总RNA，使用3D-Gene(注册商标)miRNA Labeling kit(东丽株式会社)，基于该社制定的方案(ver2.20)，将miRNA进行荧光标识。作为寡DNA芯片，使用搭载了具有与miRBase版本21所登记的miRNA中的2565种miRNA互补的序列的探针的3D-Gene(注册商标)Human miRNA Oligo chip(东丽株式会社)，基于该社制定的方案在严格条件下，进行总RNA中的miRNA与DNA芯片上的探针的杂交和杂交后的洗涤。使用3D-Gene(注册商标)扫描仪(东丽株式会社)来扫描DNA芯片，获得图像，利用3D-Gene(注册商标)Extraction(东丽株式会社)将荧光强度进行了数值化。将数值化了的荧光强度转换为以2为底的对数值而作为基因表达量，减去空白值，缺损值用从各DNA芯片中的基因表达量的最小值的对数值减去了0.1后的值替换。其结果是对健常体150人、恶性脑肿瘤患者147人、良性脑肿瘤患者21人的合计318人的血清获得了总miRNA的基因表达量。使用数值化了的miRNA的基因表达量进行的计算和统计分析，使用R语言3.0.2(RDevelopment Core Team(2013).R：A language and environment for statisticalcomputing.R Foundation for Statistical Computing，URL http：//www.R-project.org/.)和MASS包7.3-30(Venables，W.N.&Ripley，B.D.(2002)Modern AppliedStatistics with S.Fourth Edition.Springer，New York.ISBN 0-387-95457-0)来实施。
[参考例2]
＜其他恶性脑肿瘤样品的采集＞
从获得了知情同意的除了脑肿瘤以外未发现癌的中枢神经***原发恶性淋巴瘤患者37人、室管膜瘤患者6人、神经节神经胶质瘤患者5人、毛细胞型星形细胞瘤患者3人的共计51人使用Venoject II真空采血管VP-AS109K60(テルモ株式会社)分别采集血清，作为验证样品组。以后的总RNA的提取以及基因表达量的测定和分析与参考例1同样进行。
[实施例1]
＜使用学习样品组的样品的基因标志物的选定和使用验证样品组的样品的单独基因标志物的脑肿瘤判别性能的评价方法＞
本实施例中，从学习样品组选定用于将恶性脑肿瘤患者与良性脑肿瘤患者和健常体进行判别的基因标志物，在与学习样品组独立的验证样品组的样品中，研究选定的各基因标志物单独的恶性脑肿瘤判别性能的评价方法。
具体地，首先将参考例1中得到的学***均与基准值(Pre-setvalue)的比，使每个该样品的全部miRNA的检测数值反映其比。该方法记载于A.Shimomura等、2016年、Cancer Sci、DOI：10.1111。
接下来，使用学习样品组进行诊断用基因的选定。这里，为了获得可靠性更高的诊断标志物，仅选择在学习样品组的恶性脑肿瘤患者组、和将良性脑肿瘤患者和健常体合并而得的组的任一组中，50％以上的样品具有2的6次方以上的基因表达量的基因。进一步作为用于判别恶性脑肿瘤患者组、与良性脑肿瘤患者组和健常体组的具有统计显著性的基因，对于各个基因表达量将通过假设等方差的双侧t检验获得的P值进行Bonferroni校正，获得满足p＜0.01的基因作为判别式的说明变量所使用的基因标志物，记载于表2。
这样找出了序列号1～11所示的hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-6869-5p、hsa-miR-3178、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-6510-5p、hsa-miR-4695-5p、hsa-miR-4634、hsa-miR-4449、hsa-miR-3195、hsa-miR-6836-3p、hsa-miR-187-5p基因，作为与良性脑肿瘤患者和健常体进行比较的恶性脑肿瘤标志物。
进而，以这些基因的表达量作为指标，通过Fisher判别分析制成判别有无恶性脑肿瘤的判别式。即，将相当于学习样品组所选择的11种基因的由序列号1～11的任一项所示的碱基序列组成的多核苷酸的表达量测定值输入式2而制成判别式“z＝a×(基因的表达量)+b”，将计算出的准确度、灵敏度、特异度示于表3。此外将此时的判别式系数和常数项示于表4。例如，hsa-miR-1909-3p基因(序列号1)的判别式根据表4所记载的判别式系数a(3.058)和常数项b(26.421)，成为“z＝3.058×(hsa-miR-1909-3p的表达量)-26.421”。
接下来，使用由上述制成的判别式计算出验证样品组中的准确度、灵敏度、特异度，将选定的多核苷酸的判别性能用独立的样品进行了验证(表3)。例如，在将序列号1所示的碱基序列的表达量测定值在学习样品组的恶性脑肿瘤患者(98人)、与良性脑肿瘤患者(14人)和健常体(100人)之间进行比较的情况下，显示相对于良性脑肿瘤患者和健常体组，恶性脑肿瘤患者组的基因表达量测定值显著地低(参照图2左)，进而该结果在验证样品组的恶性脑肿瘤患者(49人)、与良性脑肿瘤患者(7人)和健常体(50人)之间也能够再现(参照图2右)。同样在序列号2～11所示的其他多核苷酸中，也得到了相对于良性脑肿瘤患者和健常体组，恶性脑肿瘤患者组的基因表达量测定值显著地低(-)或高(+)的结果(表2)，这些结果在验证样品组也能够验证。另外，例如关于该序列号1所示的碱基序列，为了在学习样品组中判别有无恶性脑肿瘤而使用表4所记载的判别式系数(3.058)和常数项(26.421)计算判别得分，接着使用将得分大于0的样品判定为恶性脑肿瘤、将得分小于0的样品判定为良性脑肿瘤患者或健常体的判别式，计算验证样品组中的恶性脑肿瘤检测的命中率，结果为真阳性41例、真阴性54例、假阳性3例、假阴性8例，由这些值，作为判别性能，得到准确度90％、灵敏度84％、特异度95％。这样计算出序列号1～11所示的全部多核苷酸的判别性能，记载于表3。
由序列号2～11所示的碱基序列组成的多核苷酸在验证样品组中分别显示灵敏度84％、84％、84％、80％、76％、84％、74％、76％、84％、71％(表3)。能够证明这些多核苷酸即使单独使用也能够以超过70％的高灵敏度判别恶性脑肿瘤。
表2
表3
表4
序列号 判别式系数a 常数项b
1 3.058 26.421
2 1.807 23.646
3 2.412 28.379
4 2.669 35.404
5 1.525 10.497
6 2.409 20.026
7 1.934 16.978
8 1.558 10.452
9 1.808 14.497
10 1.368 11.506
11 1.530 11.695
[实施例2]
＜使用验证样品组样品利用多种基因标志物的组合的脑肿瘤判别性能的评价方法＞
本实施例中，研究将实施例1中选定的基因标志物组合而评价恶性脑肿瘤判别性能的方法。
具体地，如实施例1所记载那样，将参考例1中得到的学习样品组和验证样品组的miRNA表达量进行归一化。接下来，对于相当于实施例1中选择的11种基因的由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的2个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合550组，利用学习样品组进行Fisher判别分析，构建用于判别恶性脑肿瘤的存在有无的判别式“z＝a1×(基因1的表达量)+a2×(基因2的表达量)+a3×(基因3的表达量)+a4×(基因4的表达量)+b”(表5)。将计算出的准确度、灵敏度和特异度示于表6。
接下来，使用制成的判别式计算验证样品组中的准确度、灵敏度和特异度，用独立的样品验证判别性能。
使用由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的2个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合判别参考例1的验证样品组有无脑肿瘤。例如，对于由序列号1和序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸的表达量测定值，基于用学习样品组为了判别有无恶性脑肿瘤而制成的判别式使用表5所记载的判别式系数(序列号1：-1.952、序列号2：-1.071)和常数项(-30.884)计算判别得分，将得分大于0的样品判定为恶性脑肿瘤、将小于0的样品判定为良性脑肿瘤患者或健常体，将如此得到的判别结果进行比较，结果在学习样品组中得到了在健常体组和良性脑肿瘤患者组与恶性脑肿瘤患者组之间表达量测定值显著地分离的散点图(参照图3左)，进而该结果在验证样品组也能够再现(参照图3右)。对于该序列号1和序列号2所示的碱基序列，使用利用学习样品组构建的判别式计算出恶性脑肿瘤检测的命中率，结果真阳性45例、真阴性55例、假阳性2例、假阴性4例，由这些值作为判别性能得到了准确度94％、灵敏度92％、特异度97％。
这样，对于由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的2个～4个多核苷酸的表达量测定值的全部组合计算出判别性能。在全部组合550组(表6)中，显示了超过利用单独的基因标志物的判别性能的灵敏度的组合有486组。此外表5和6中“序列号”将所使用的多个多核苷酸的组合用序列号表示(在本申请后述的表中也同样)。
例如在使用由序列号3与序列号5、序列号3与序列号5与序列号6、序列号3与序列号5与序列号7、序列号3与序列号5与序列号8、序列号3与序列号5与序列号10、序列号3与序列号5与序列号11、序列号3与序列号4与序列号5与序列号6、序列号3与序列号4与序列号5与序列号7、序列号3与序列号4与序列号5与序列号8、序列号3与序列号5与序列号6与序列号7、序列号3与序列号5与序列号6与序列号8、序列号3与序列号5与序列号6与序列号9、序列号3与序列号5与序列号6与序列号10、序列号3与序列号5与序列号6与序列号11、序列号3与序列号5与序列号7与序列号8、序列号3与序列号5与序列号7与序列号9、序列号3与序列号5与序列号7与序列号10、序列号3与序列号5与序列号7与序列号11、序列号3与序列号5与序列号8与序列号9、序列号3与序列号5与序列号8与序列号11、序列号3与序列号5与序列号10与序列号11、序列号4与序列号5与序列号6与序列号11、和序列号5与序列号6与序列号7与序列号8所示的碱基序列组成的多核苷酸的表达量测定值的组合的情况下，在验证样品组中，显示超过单独的基因标志物最高灵敏度84％的灵敏度98％。
这些组合中，实施例1中得到的表1所记载的序列号1～11的多核苷酸全部出现至少1次。即，验证样品组中，包含由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸的1种以上的2个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合，能够以超过灵敏度70％的高灵敏度判别恶性脑肿瘤。
这样，将由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸的表达量测定值的2个、3个、4个、5个或5个以上的个数组合，也能够得到以优异的灵敏度检测恶性脑肿瘤的标志物。例如，对于实施例1中选择的由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸，按照显示统计学显著性的P值的降序进行排序，使用从上位的miRNA开始逐个加起来而成的1种或数种miRNA的组合，计算出判别性能。其结果是，验证样品组中的灵敏度在1个miRNA时为84％、2个miRNA时为92％、3个miRNA时为94％、5个miRNA时为94％。由于多种miRNA的组合高于1个miRNA的灵敏度，因此显示将多种miRNA组合也能够获得检测恶性脑肿瘤的优异标志物。其中，多种miRNA的组合不限于如上述那样以统计上显著性差异的顺序相加的情况，无论怎样的多种miRNA的组合都能够用于恶性脑肿瘤的检测。
由这些结果可以说，由序列号1～11所示的碱基序列组成的全部多核苷酸都是恶性脑肿瘤的优异的诊断标志物。
表5
表6
[实施例3]
＜使用验证样品组利用多种基因标志物的组合的其他恶性脑肿瘤样品的判别性能的评价方法＞
本实施例中，与实施例1、2同样地利用学习组使用由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的1个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合构建阈值或判别式，以参考例2所记载的验证样品组作为对象，通过与实施例1、2所记载的方法同样的方法评价判别性能。
具体地，首先将参考例1中得到的学***均与基准值(Pre-set value)的比，使每个该样品的全部miRNA的检测数值反映其比。该方法记载于A.Shimomura等、2016年、Cancer Sci、DOI：10.1111。
接下来，对于参考例1中得到的学习样品组，对于实施例1中选择的11种基因的由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的1个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合进行Fisher判别分析，构建判别恶性脑肿瘤的存在有无的判别式。接下来，计算出中枢神经***原发恶性淋巴瘤患者37人、室管膜瘤患者6人、神经节神经胶质瘤患者5人、毛细胞型星形细胞瘤患者3人共计51人的验证样品组(参考例2)中的灵敏度(表7)、由此，用独立的样品验证选定的多核苷酸的判别性能。
使用由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的1个～4个多核苷酸的表达量测定值的组合判别参考例2的验证样品组有无恶性脑肿瘤。例如，对于由序列号1和序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸的表达量测定值，基于用学习样品组为了判别有无恶性脑肿瘤而制成的判别式使用表5所记载的判别式系数(序列号1：-1.952、序列号2：-1.071)和常数项(-30.884)计算判别得分，将得分大于0的样品判定为恶性脑肿瘤、将小于0的样品判定为良性脑肿瘤患者或健常体，将如此得到的学习样品组与验证样品组的判别结果进行比较，结果作为验证样品组的其他恶性脑肿瘤(中枢神经***原发恶性淋巴瘤、室管膜瘤、神经节神经胶质瘤、毛细胞型星形细胞瘤)也得到了与学习样品组的神经胶质瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)同样的散点图(参照图4右)。对于该序列号1和序列号2所示的碱基序列，使用利用学习样品组构建的判别式计算出恶性脑肿瘤检测的命中率，结果为真阳性43例、假阴性8例，由这些值，作为判别性能，得到灵敏度84％。此外，学习样品组的灵敏度为87％。
这样，对于由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸中的1个～4个多核苷酸的表达量测定值的全部组合计算出判别性能。全部组合561组中，514组(表7)高于实施例1、2中显示最小判别性能的序列号11的多核苷酸单独的灵敏度71％，由此显示不仅能够检测(判别)恶性脑肿瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)，还能够检测(判别)中枢神经***原发恶性淋巴瘤、室管膜瘤、神经节神经胶质瘤、毛细胞型星形细胞瘤。
作为也能够判别除了神经胶质瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)以外的上述恶性脑肿瘤的由序列号1～11所示的碱基序列组成的多核苷酸的任意组合中的多核苷酸个数，可列举1个、2个、3个、4个、5个、或5个以上的个数，但不限于这些。与单独显示最高的判别性能的序列号5的多核苷酸单独的灵敏度86％相比，2个以上的上述多核苷酸的组合中能够显示判别准确度90％以上。
如上，使用这些多核苷酸，对于验证样品组中除了神经胶质瘤(星形细胞瘤、少突胶质瘤、少突胶质星形细胞瘤)以外的上述恶性脑肿瘤的任一种，均能够正确地判别为恶性脑肿瘤。
表7
如以上的实施例所示，使用本发明的多核苷酸、试剂盒等和方法，能够高灵敏度地将恶性脑肿瘤患者、与健常体以及良性脑肿瘤患者进行判别。由此，能够实现涉及利用外科手术的癌症部位的切除实施等的早期临床判断，其结果能够提高5年生存率、降低复发率。
产业可利用性
根据本发明，能够通过简易且廉价的方法有效地检测恶性脑肿瘤，因此能够实现恶性脑肿瘤的早期发现、诊断和治疗。另外，通过本发明的方法，能够使用患者血液低侵袭地检测恶性脑肿瘤，因此能够简便且迅速地检测恶性脑肿瘤。
将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。

Claims (18)

1.恶性脑肿瘤的检测用试剂盒，包含能够与恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述恶性脑肿瘤标志物是选自由miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p组成的组中的至少1种多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，miR-1909-3p为hsa-miR-1909-3p，miR-6869-5p为hsa-miR-6869-5p，miR-3178为hsa-miR-3178，miR-4787-5p为hsa-miR-4787-5p，miR-6510-5p为hsa-miR-6510-5p，miR-4695-5p为hsa-miR-4695-5p，miR-4634为hsa-miR-4634，miR-4449为hsa-miR-4449，miR-3195为hsa-miR-3195，并且miR-6836-3p为hsa-miR-6836-3p。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，所述核酸是选自由下述(a)～(e)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(e)与所述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含能够与别的恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述别的恶性脑肿瘤标志物是miR-187-5p的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，miR-187-5p为hsa-miR-187-5p。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其中，能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸是选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(j)与所述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
7.恶性脑肿瘤的检测用器件，包含能够与恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述恶性脑肿瘤标志物是选自由miR-1909-3p、miR-6869-5p、miR-3178、miR-4787-5p、miR-6510-5p、miR-4695-5p、miR-4634、miR-4449、miR-3195和miR-6836-3p组成的组中的至少1种多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的器件，其中，miR-1909-3p为hsa-miR-1909-3p，miR-6869-5p为hsa-miR-6869-5p，miR-3178为hsa-miR-3178，miR-4787-5p为hsa-miR-4787-5p，miR-6510-5p为hsa-miR-6510-5p，miR-4695-5p为hsa-miR-4695-5p，miR-4634为hsa-miR-4634，miR-4449为hsa-miR-4449，miR-3195为hsa-miR-3195，并且miR-6836-3p为hsa-miR-6836-3p。
9.根据权利要求7或8所述的器件，所述核酸是选自由下述(a)～(e)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(a)由序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(b)包含序列号1～10的任一项所示的碱基序列的多核苷酸，
(c)由与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(d)包含与序列号1～10的任一项所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(e)与所述(a)～(d)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
10.根据权利要求7～9的任一项所述的器件，所述器件还包含能够与别的恶性脑肿瘤标志物特异性地结合的核酸，所述别的恶性脑肿瘤标志物是miR-187-5p的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的器件，其中，miR-187-5p为hsa-miR-187-5p。
12.根据权利要求10或11所述的器件，其中，能够与miR-187-5p的多核苷酸特异性地结合的核酸是选自由下述(f)～(j)所示的多核苷酸组成的组中的多核苷酸，
(f)由序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(g)包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸，
(h)由与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、该多核苷酸的突变体、该多核苷酸的衍生物、或该多核苷酸的包含15个以上连续碱基的片段，
(i)包含与序列号11所示的碱基序列或该碱基序列中u为t的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸，和
(j)与所述(f)～(i)的任一多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
13.根据权利要求7～12的任一项所述的器件，所述器件是用于通过杂交技术进行测定的器件。
14.根据权利要求13所述的器件，所述杂交技术是核酸阵列技术。
15.恶性脑肿瘤的检测方法，包括：使用权利要求1～6的任一项所述的试剂盒或权利要求7～14的任一项所述的器件测定受检体的样品中的目标核酸的表达量，使用该测定的表达量、和同样测定的健常体或良性脑肿瘤患者的对照表达量，评价受检体是否罹患恶性脑肿瘤，检测受检体中有无恶性脑肿瘤。
16.受检体中的恶性脑肿瘤的检测方法，包括：使用权利要求1～6的任一项所述的试剂盒或权利要求7～14的任一项所述的器件测定受检体的样品中的目标基因的表达量，在判别式中带入来源于上述受检体的样品中的目标基因的表达量，由此评价存在还是不存在恶性脑肿瘤，
所述判别式是将来源于已知具有恶性脑肿瘤的受检体的样品的基因表达量和来源于健常体或良性脑肿瘤患者的样品的基因表达量作为教师样本而制成的，并且能够区别地判别恶性脑肿瘤与健常或良性脑肿瘤。
17.根据权利要求15或16所述的方法，所述受检体是人。
18.根据权利要求15～17的任一项所述的方法，所述样品是血液、血清或血浆。
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