CN108884458A - 丝心蛋白样蛋白质改造体及细胞培养方法 - Google Patents

丝心蛋白样蛋白质改造体及细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

提高一种高效地培养干细胞等细胞的技术。使用包被有***了含有RGD(Arg‑Gly‑Asp)的细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的细胞培养容器，来培养干细胞等细胞。

Description

丝心蛋白样蛋白质改造体及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及丝心蛋白样蛋白质改造体及使用其的细胞培养方法。
背景技术
干细胞、尤其是胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞可期待应用于再生医疗。在干细胞的培养中，通常使用饲养细胞。但是，由于临床应用中的制约等，正在进行代替饲养细胞的技术的开发。
例如，已知使用纤连蛋白、层粘连蛋白等细胞粘附性蛋白作为细胞培养用的支架材料培养干细胞的技术。另外，已知使用向蜘蛛、蚕的丝心蛋白中导入了细胞粘附序列而成的丝心蛋白改造体作为细胞培养用的支架材料培养干细胞的技术(专利文献1～2、非专利文献1)。作为细胞粘附序列，已知典型序列为含有RGD(Arg-Gly-Asp)的氨基酸序列。
但是，通过使用向丝心蛋白的重复结构中导入含有RGD的细胞粘附序列而成的丝心蛋白改造体作为细胞培养用的支架材料能够高效地培养干细胞的技术，尚属未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2015/036619
专利文献2:日本特表2013-523174
非专利文献
非专利文献1:Bini E,Foo CW,Huang J,Karageorgiou V,Kitchel B,KaplanDL.,Biomacromolecules.2006Nov；7(11):3139-45.,RGD-functionalized bioengineeredspider dragline silk biomaterial.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于，提供高效地培养干细胞等细胞的技术。
用于解决课题的方案
本申请的发明人进行了深入研究，结果发现：通过使用向丝心蛋白样蛋白质的重复结构中导入含有RGD的细胞粘附序列而成的丝心蛋白样蛋白质改造体作为细胞培养用的支架材料，由此能够高效地培养干细胞，并完成了本发明。
即，本发明可以例示如下。
[1]
一种蛋白质，其为含有重复结构和细胞粘附序列的蛋白质，
前述重复结构由重复单元的3次～15次重复构成，
各重复单元由富含Ala部位和非富含Ala部位连结而成，
各富含Ala部位由8个残基～54个残基的氨基酸序列构成，
各富含Ala部位中的Ala残基的比率为30％以上，
各富含Ala部位在该部位中的任一连续的4个氨基酸残基中含有至少1个Ala残基，
各非富含Ala部位由4个残基以上的氨基酸序列构成，
各非富含Ala部位中的Ala残基的比率为20％以下，
前述细胞粘附序列包含在选自构成前述重复结构的重复单元中的一个或一个以上的重复单元中，
各细胞粘附序列由含有Arg-Gly-Asp的3个残基～18个残基的氨基酸序列构成。
[2]
根据前述蛋白质，其中，
前述细胞粘附序列包含在选自构成前述重复结构的重复单元中的两个或两个以上的重复单元中。
[3]
根据前述蛋白质，其中，
前述蛋白质中所含的前述细胞粘附序列的总数为1个～50个。
[4]
根据前述蛋白质，其中，
各细胞粘附序列被***到非富含Ala部位中或者富含Ala部位与非富含Ala部位的连结部。
[5]
根据前述蛋白质，其中，
各细胞粘附序列由下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列构成：
(a)序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列；
(b)在序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列中，在除Arg-Gly-Asp以外的位置含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性且Arg-Gly-Asp保守的氨基酸序列。
[6]
根据前述蛋白质，其中，
各富含Ala部位由8个残基～15个残基的氨基酸序列构成。
[7]
根据前述蛋白质，其中，
各富含Ala部位由9个残基的氨基酸序列构成。
[8]
根据前述蛋白质，其中，各富含Ala部位分别含有1个以上的Gly残基及Ser残基。
[9]
根据前述蛋白质，其中，
各富含Ala部位中的Ala残基的比率为50％以上。
[10]
根据前述蛋白质，其中，
各富含Ala部位中的Ala残基、Gly残基及Ser残基的比率合计为90％以上。
[11]
根据前述蛋白质，其中，
各富含Ala部位由下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列构成：
(a)序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列；
(b)在序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列中含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
[12]
根据前述蛋白质，其中，
各非富含Ala部位由15个残基～100个残基的氨基酸序列构成。
[13]
根据前述蛋白质，其中，各非富含Ala部位中的Ala残基的比率为5％以下。
[14]
根据前述蛋白质，其中，
各非富含Ala部位中的Gly残基、Ser残基、Gln残基、Pro残基、Tyr残基的比率合计为90％以上。
[15]
根据前述蛋白质，其中，
各非富含Ala部位含有选自下述(a)、(b)及(c)中记载的氨基酸序列中的1种或1种以上的氨基酸序列：
(a)序列号11～21所示的氨基酸序列；
(b)在序列号11～21所示的氨基酸序列中含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号11～21所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
[16]
根据前述蛋白质，其中，
各非富含Ala部位含有下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列：
(a)序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列；
(b)在序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列中含有1～10个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[17]
一种组合物，其含有前述蛋白质。
[18]
根据前述组合物，其为细胞支架材料。
[19]
根据前述组合物，其中，
前述细胞支架材料用于干细胞的培养。
[20]
根据前述组合物，其中，
前述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
[21]
根据前述组合物，其为细胞培养容器的包被剂。
[22]
根据前述组合物，其中，
前述细胞培养容器用于干细胞的培养。
[23]
根据前述组合物，其中，
前述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
[24]
根据前述组合物，其中，
还含有其它蛋白质，前述其它蛋白质为除前述蛋白质以外的蛋白质。
[25]
根据前述组合物，其中，前述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中的任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
[26]
一种器具，其具备前述蛋白质。
[27]
根据前述器具，其为用于医疗或用于研究的器具。
[28]
根据前述器具，其为细胞培养容器。
[29]
根据前述器具，其为细胞支架材料。
[30]
根据前述器具，其中，
细胞培养面用前述蛋白质进行了包被。
[31]
根据前述器具，其用于干细胞的培养。
[32]
根据前述器具，其中，
前述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
[33]
根据前述器具，其还具备其它蛋白质，前述其它蛋白质为除前述蛋白质以外的蛋白质。
[34]
根据前述器具，其中，
前述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中的任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
[35]
一种制造培养细胞的方法，其包括：用前述器具培养细胞。
[36]
根据前述方法，其中，
前述被培养的细胞为干细胞。
[37]
根据前述方法，其中，
前述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
[38]
根据前述方法，其中，
组合使用其它蛋白质，前述其它蛋白质为除前述蛋白质以外的蛋白质。
[39]
根据前述方法，其中，
前述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
[40]
一种基因，其编码前述蛋白质。
[41]
一种载体，其搭载前述基因。
[42]
一种宿主，其具有前述基因。
附图说明
图1是示出使用包被有***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质、及现有的基底膜基质或其模拟物(mimic)的各种细胞培养容器评价iPS细胞支架功能的结果的图。
图2是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上后立即、或在4℃保存6天后评价iPS细胞支架功能的结果的图。
图3是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上并使用各种培养基评价iPS细胞支架功能的结果的图。
图4是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上、用3周评价iPS细胞支架功能的结果的图。横轴表示“周”。
图5是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上后立即、或在37℃保存6天后评价iPS细胞支架功能的结果的图。
图6是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上、用3周评价iPS细胞支架功能的结果的图。横轴表示“周”。
图7是示出将***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质和/或***肝素结合序列的丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上评价iPS细胞支架功能的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
＜1＞本发明的蛋白质
＜1-1＞本发明的蛋白质
本发明的蛋白质是含有重复结构和细胞粘附序列的蛋白质。
具体而言，本发明的蛋白质可以是***了细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质。即，将本发明的蛋白质也称为“***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质”。
在本发明中，“丝心蛋白样蛋白质”是丝心蛋白及具有准丝心蛋白结构的蛋白质的总称。
“丝心蛋白”是构成蜘蛛丝、蚕丝的纤维状蛋白质。即，作为丝心蛋白，可列举蜘蛛的丝心蛋白、蚕的丝心蛋白。对蜘蛛的种类、蚕的种类、丝的种类没有特别限定。作为蜘蛛，可列举十字园蛛(Araneus diadematus)、棒络新妇蛛(Nephila clavipes)。作为蜘蛛，此外还可列举：巨大地衣网蛛(Araneus bicentenarius)、悦目金蛛(Argiope amoena)、黑黄园蛛(Argiope aurantia)、三带金蛛(Argiope trifasciata)、皿云斑蛛(Cyrtophoramoluccensis)、黑狡蛛(Dolomedes tenebrosus)、非洲育儿网蛛(Euprosthenopsaustralis)、双点棘蛛(Gasteracantha mammosa)、几何寇蛛(Latrodectus geometricus)、黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)、赫尔斯特上户蛛(Macrothele holsti)、斑络新妇(Nephila pilipes)、马达加斯加络新妇蛛(Nephila madagascariensis)、塞内加尔络新妇蛛(Nephila senegalensis)、变异涡蛛(Octonoba varians)、中华褛网蛛(Psechrussinensis)、长爪绿色突光蝴蛛(Tetragnatha kauaiensis)、多色肖蛸(Tetragnathaversicolor)。作为蜘蛛的丝心蛋白，可列举：由大壶状腺产生的牵引丝、框丝、纵丝的蛋白质(大壶状腺蛋白)、由小壶状腺产生的骨架丝的蛋白质(小壶状腺蛋白)、由鞭状腺产生的横丝的蛋白质(鞭状腺蛋白)。作为蜘蛛的丝心蛋白，具体可列举例如：十字园蛛的大壶状腺蛋白质ADF3及ADF4、美国棒络新妇蛛的大壶状腺蛋白质MaSp1及MaSp2。作为蚕，可列举家蚕(Bombyx mori)、月神蛾(Samia cynthia)。这些丝心蛋白的氨基酸序列及编码这些丝心蛋白的基因(也称为“丝心蛋白基因”)的碱基序列可以从例如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等公用数据库取得。
“具有准丝心蛋白结构的蛋白质”是指具有与丝心蛋白所具有的重复序列同样的序列的蛋白质。“与丝心蛋白所具有的重复序列同样的序列”既可以实际为丝心蛋白所具有的序列，也可以为与其类似的序列。作为与丝心蛋白所具有的重复序列同样的序列，可列举本发明中规定的“重复结构”。作为具有准丝心蛋白结构的蛋白质，可列举WO2012/165476中记载的源自大吐丝管牵引丝蛋白的多肽、WO2006/008163中记载的重组蜘蛛丝蛋白。另外，作为具有准丝心蛋白结构的蛋白质，还可列举实施例中使用的ADF3蛋白。将实施例中使用的ADF3基因的碱基序列示于序列号1，将该基因所编码的ADF3蛋白的氨基酸序列示于序列号2。需要说明的是，序列号1的7位～1989位的碱基序列编码序列号2所示的氨基酸序列。具有准丝心蛋白结构的蛋白质可以是纤维状蛋白质也可以不是。
“纤维状蛋白质”是指在规定条件下取纤维状形态的蛋白质。即，纤维状蛋白质既可以是以纤维状形态表达的蛋白质，也可以是表达时并非纤维状形态但能够加工为纤维状形态的蛋白质。纤维状蛋白质例如还可以是以包涵体形式表达、然后能够通过适当方法加工成纤维状形态的蛋白质。作为将蛋白质加工成纤维状形态的方法，可列举例如WO2012/165476中记载的方法。
即，丝心蛋白样蛋白质例如可以是具有上述数据库、文献中公开的丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列或序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，丝心蛋白样蛋白质例如可以是具有那些的部分氨基酸序列的蛋白质。作为部分氨基酸序列，可列举具有与丝心蛋白所具有的重复序列同样的序列的部分。作为部分氨基酸序列，具体可列举例如序列号2的25位～610位的氨基酸序列、53位～536位的氨基酸序列。同样地，编码丝心蛋白样蛋白质的基因(也称为“丝心蛋白样蛋白质基因”)可以是例如具有上述数据库、文献中公开的丝心蛋白基因的碱基序列或序列号1的7位～1989位的碱基序列的基因。另外，丝心蛋白样蛋白质基因例如可以是具有那些的部分碱基序列的基因。作为部分碱基序列，可列举编码具有与丝心蛋白所具有的重复序列同样的序列的氨基酸序列的部分。需要说明的是，“具有(氨基酸或碱基)序列”这一表述包括该“含有(氨基酸或碱基)序列”的情况及该“由(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。
丝心蛋白样蛋白质只要维持了原功能则也可以为上述例示的丝心蛋白样蛋白质(即，上述例示的丝心蛋白或具有准丝心蛋白结构的蛋白质)的变异体。同样，丝心蛋白样蛋白质基因只要维持了原功能则也可以为上述例示的丝心蛋白样蛋白质基因(即，编码上述例示的丝心蛋白或具有准丝心蛋白结构的蛋白质的基因)的变异体。需要说明的是，有时将这样的维持了原功能的变异体称为“保守变异体”。作为保守变异体，可列举例如：上述例示的丝心蛋白样蛋白质、编码其的的基因的同源物、人工改造体。
“维持了原功能”是指：基因、蛋白质的变异体具有与原基因、原蛋白质的功能(活性、性质)对应的功能(活性、性质)。即，对于丝心蛋白样蛋白质，“维持了原功能”是指蛋白质的变异体通过细胞粘附序列的***而对于干细胞等细胞显示支架功能。另外，对于丝心蛋白样蛋白质基因而言，“维持了原功能”是指基因的变异体编码维持了原功能的蛋白质(即，通过细胞粘附序列的***而对于干细胞等细胞显示支架功能的蛋白质)。
作为丝心蛋白样蛋白质的同源物，可列举例如：使用上述丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列作为询问序列并通过BLAST检索、FASTA检索从公开数据库取得的蛋白质。另外，上述丝心蛋白样蛋白质基因的同源物例如可以以各种生物的染色体为模板、使用基于上述丝心蛋白样蛋白质基因的碱基序列制作的寡核苷酸作为引物通过PCR来取得。
以下例示出丝心蛋白样蛋白质及丝心蛋白样蛋白质基因的保守变异体。
丝心蛋白样蛋白质只要维持了原功能则可以为具有在上述丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列中、在1或数个位置取代、缺失、***和/或添加1或数个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。需要说明的是，上述“1或数个”也根据氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置、种类而异，具体是指例如1～50个、1～40个、1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。
上述取代、缺失、***和/或添加1或数个氨基酸为使蛋白质的功能维持正常的保守变异。保守变异的代表性变异为保守取代。就保守取代而言，当取代部位为芳香族氨基酸时，为在Phe、Trp、Tyr之间相互进行取代的变异，当取代部位为疏水性氨基酸时，为在Leu、Ile、Val之间相互进行取代的变异，当为极性氨基酸时，为在Gln、Asn之间相互进行取代的变异，当为碱基性氨基酸时，为在Lys、Arg、His之间相互进行取代的变异，当为酸性氨基酸时，为在Asp、Glu之间相互进行取代的变异，当为具有羟基的氨基酸时，为在Ser、Thr间之间相互进行取代的变异。作为可视为保守取代的取代，具体可列举：从Ala取代为Ser或Thr；从Arg取代为Gln、His或Lys；从Asn取代为Glu、Gln、Lys、His或Asp；从Asp取代为Asn、Glu或Gln；从Cys取代为Ser或Ala；从Gln取代为Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg；从Glu取代为Gly、Asn、Gln、Lys或Asp；从Gly取代为Pro；从His取代为Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr；从Ile取代为Leu、Met、Val或Phe；从Leu取代为Ile、Met、Val或Phe；从Lys取代为Asn、Glu、Gln、His或Arg；从Met取代为Ile、Leu、Val或Phe；从Phe取代为Trp、Tyr、Met、Ile或Leu；从Ser取代为Thr或Ala；从Thr取代为Ser或Ala；从Trp取代为Phe或Tyr；从Tyr取代为His、Phe或Trp；以及，从Val取代为Met、Ile或Leu。另外，在如上述那样的氨基酸的取代、缺失、***和/或添加中，也包括基于蛋白质所来源的生物的个体差异、种属的不同等而通过天然产生的变异(mutant或variant)所产生的氨基酸的取代、缺失、***和/或添加。
另外，丝心蛋白样蛋白质只要维持了原功能则也可以为具有如下氨基酸序列的蛋白质：所述氨基酸序列相对于上述丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同源性。需要说明的是，在本说明书中，“同源性”(homology)是指“同一性”(identity)。
另外，丝心蛋白样蛋白质只要维持了原功能则也可以为如下DNA所编码的蛋白质：所述DNA与由上述丝心蛋白样蛋白质基因的碱基序列制备得到的探针、例如对该碱基序列的整体或部分的互补序列在严谨条件下杂交。这样的探针例如可以以基于该碱基序列制作的寡核苷酸为引物、以含有该碱基序列的DNA片段为模板通过PCR来制作。“严谨条件”是指形成所谓的特异性的杂交体、不形成非特异性的杂交体的条件。若示出一例，可以列举如下条件：同源性高的DNA(例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA)彼此杂交、比其同源性低的DNA彼此不杂交的条件；或者，作为通常的Southern杂交的洗涤条件的与60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度及温度下洗涤1次、优选洗涤2～3次的条件。另外，例如在使用长度为300bp左右的DNA片段作为探针时，作为杂交的洗涤条件，可列举50℃、2×SSC、0.1％SDS。
另外，丝心蛋白样蛋白质基因可以是将任意的密码子置换为与其等价的密码子后的基因。即，丝心蛋白样蛋白质基因可以是基于密码子简并的上述例示的丝心蛋白样蛋白质基因的变异体。例如，可以对丝心蛋白样蛋白质基因进行改造，使其具有最适于所使用的宿主的密码子使用频度的密码子。
2个序列间的序列同一性的百分比例如可以使用数学算法来确定。作为这样的数学算法的非限定性例子，可列举：Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smithet al(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的检索类似性的方法、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中记载的改进的Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法。
可以利用基于这些数学算法的程序进行用于确定序列同一性的序列比较(比对)。程序可以适当地通过计算机来执行。作为这样的程序，没有特别限定，可列举PC/Gene程序的CLUSTAL(可以由Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得)、ALIGN程序(Version2.0)、以及Wisconsin Genetics软件包,Version 8(可以由Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。使用这些程序的比对例如可以使用初始参数来进行。关于CLUSTAL程序，详细记载于Higgins et al.(1988)Gene 73:237-244、Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153、Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90、Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331中。
为了得到与编码对象蛋白的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列，具体而言，例如可以通过BLASTN程序、评分＝100、字长＝12来进行BLAST核苷酸检索。为了得到与对象蛋白具有同源性的氨基酸序列，具体而言，例如可以通过BLASTX程序、评分＝50、字长＝3来进行BLAST蛋白质检索。关于BLAST核苷酸检索、BLAST蛋白质检索，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，以比较为目的，为了得到引入空位的比对，可以利用GappedBLAST(BLAST 2.0)。另外，为了进行对序列间的远离关系进行检测的反复检索，可以利用PSI-BLAST(BLAST 2.0)。关于Gapped BLAST及PSI-BLAST，请参照Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。在利用BLAST、Gapped BLAST或PSI-BLAST时，可使用例如各程序(例如，对于核苷酸序列而言为BLASTN，对于氨基酸序列而言为BLASTX)的初始参数。比对也可以手动进行。
算出将2个序列最大限度地排列一致时、在2个序列间一致的残基比率，作为2个序列间的序列同一性。
本发明的蛋白质还可以为如下蛋白质：所述蛋白质除了含有细胞粘附序列以外，与上述例示的丝心蛋白样蛋白质、其保守变异体具有同一氨基酸序列。另外，编码本发明的蛋白质的基因可以为如下基因：所述基因除了含有编码细胞粘附序列的碱基序列以外，具有与上述例示的丝心蛋白样蛋白质基因、其保守变异体具有同一碱基序列。
作为本发明的蛋白质，具体可列举实施例中使用的***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质。将编码实施例中使用的***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的基因的碱基序列示于序列号3、5、26、28、35、37、39、41、43、45、47、49、51及53，将该基因所编码的***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列示于序列号4、6、27及29、36、38、40、42、44、46、48、50、52及54。即，本发明的蛋白质可以是例如具有序列号4、6、27、29、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为本发明的蛋白质，具体可列举：具有细胞粘附序列的、实施例中使用的***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的保守变异体。关于***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的保守变异体，可以沿用关于丝心蛋白样蛋白质的保守变异体的记载。关于***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的“维持了原功能”，是指蛋白质的变异体对于干细胞等细胞显示支架功能。
需要说明的是，在本发明中，“基因”这一术语只要编码目标蛋白质则不限于DNA，可以包括任意的多核苷酸。即，“编码本发明的蛋白质的基因”可以是指编码本发明的蛋白质的任意的多核苷酸。编码本发明的蛋白质的基因既可以为DNA，也可以为RNA，还可以是其组合。编码本发明的蛋白质的基因既可以为单链，也可以为双链。编码本发明的蛋白质的基因既可以为单链DNA，也可以为单链RNA。编码本发明的蛋白质的基因既可以为双链DNA，也可以为双链RNA，还可以为由DNA链和RNA链构成的杂交体链。编码本发明的蛋白质的基因可以在单一多核苷酸链中含有DNA残基和RNA残基这两者。当编码本发明的蛋白质的基因含有RNA时，上述例示的碱基序列等关于DNA的记载也可以与RNA相对应地适当替换读取。编码本发明的蛋白质的基因形态可以根据其利用方式等各条件适当选择。
以下对本发明的蛋白质的结构进行具体说明。
本发明的蛋白质含有重复结构和细胞粘附序列。前述重复结构由重复单元的重复构成。各重复单元由富含Ala部位和非富含Ala部位连结而成。在各重复单元中，富含Ala部位为N末侧，非富含Ala部位为C末侧。即，具体而言，前述重复结构由富含Ala部位和非富含Ala部位从N末端向C末端交替地连结而成。
重复单元的重复数为3次～15次。重复单元的重复数可以为例如4次以上、5次以上、6次以上、7次以上、8次以上、9次以上或10次以上。重复单元的重复数可以为例如12次以下、10次以下、8次以下或6次以下。重复单元的重复数例如可以为与上述例示的范围不矛盾的组合范围。具体而言，重复单元的重复数可以为例如3次～12次、3次～10次、3次～8次、3次～6次、5次～15次、7次～15次或10次～15次。
重复单元的构成在各重复中既可以相同，也可以并非如此。即，富含Ala部位的构成在各重复中既可以相同，也可以并非如此。另外，非富含Ala部位的构成在各重复中既可以相同，也可以并非如此。即，重复单元的构成、富含Ala部位的构成及非富含Ala部位的构成可以在各重复中分别独立地进行设定。即，作为重复单元、富含Ala部位及非富含Ala部位各自既可以使用1种氨基酸序列，也可以将2种或2种以上的氨基酸序列组合使用。
＜富含Ala部位＞
“富含Ala部位”是指Ala残基的比率高的部位(以高比率含有Ala残基的部位)。
富含Ala部位的长度为8个残基～54个残基。即，富含Ala部位由8个残基～54个残基的氨基酸序列构成。富含Ala部位的长度可以为例如40个残基以下、30个残基以下、20个残基以下、15个残基以下或10个残基以下。富含Ala部位的长度可以为例如上述例示的范围的组合范围。具体而言，富含Ala部位的长度可以为例如8个残基～15个残基或8个残基～10个残基。更具体而言，富含Ala部位的长度可以为例如9个残基。
富含Ala部位既可以为由Ala残基构成的部位，也可以为由Ala残基和其它氨基酸残基(除Ala残基以外的氨基酸残基)的组合构成的部位。
富含Ala部位中的Ala残基的比率为30％以上。富含Ala部位中的Ala残基的比率可以为例如40％以上、50％以上、60％以上或70％以上。富含Ala部位中的Ala残基的比率可以为例如100％以下、95％以下、90％以下、85％以下或80％以下。富含Ala部位中的Ala残基的比率可以为例如上述例示的范围的组合范围。具体而言，富含Ala部位中的Ala残基的比率可以为例如30％～100％、50％～90％或60％～85％。“富含Ala部位中的Ala残基的比率”为相对于构成富含Ala部位的氨基酸残基的总数的、该富含Ala部位中所含的Ala残基的个数比率。富含Ala部位中的其它任意的氨基酸残基的比率也可以同样计算。
作为其它氨基酸残基(除Ala残基以外的氨基酸残基)，可列举Gly、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Pro、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr、Trp。作为其它氨基酸残基，具体可列举例如Gly残基及Ser残基。富含Ala部位既可以仅含有1种其它氨基酸残基，也可以含有2种或2种以上其它氨基酸残基。富含Ala部位例如可以含有1个以上Gly残基，也可以含有1个以上Ser残基，还可以分别含有1个以上的Gly残基及Ser残基。富含Ala部位的两端(N末端及C末端)可以分别为例如Ala残基、Gly残基或Ser残基。具体而言，例如富含Ala部位的N末端可以为Ala残基或Gly残基，富含Ala部位的C末端可以为Ala残基或Ser残基。富含Ala部位中的Ala残基、Gly残基及Ser残基的比率的合计可以为例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％。
富含Ala部位在该部位中的任一的连续4个氨基酸残基中也含有至少1个Ala残基。即，在富含Ala部位中，不存在不含有Ala残基的连续4个氨基酸残基。另外，富含Ala部位可以在该部位中的任一的连续7、6或5个氨基酸残基中也含有至少2个Ala残基。即可以是：在富含Ala部位中，不存在不含有Ala残基或仅含有1个Ala残基的连续的7、6或5个氨基酸残基。
作为富含Ala部位的氨基酸序列，可列举例如：丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列中的、满足上述那样的富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列。丝心蛋白样蛋白质如上所述。作为序列号2所示的氨基酸序列中的、满足上述那样的富含Ala部位的条件的部分，可列举氨基酸编号53～61、92～100、121～129、152～160、186～194、219～227、258～266、292～300、326～334、370～378、439～447、498～506的部分。作为满足那些富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列，具体可列举例如：GASAAAAAA(序列号7)、GSSAAAAAA(序列号8)、GASAASAAS(序列号9)、GASAAAGAA(序列号10)。即，富含Ala部位可以为例如：具有满足那些富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列(例如序列号7、8、9或10)的部位。
另外，富含Ala部位可以为满足那些富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列(例如序列号7、8、9或10)的变异体。关于满足那些富含Ala部位的条件的部分的变异体，可以沿用关于丝心蛋白样蛋白质的保守变异体的记载。富含Ala部位例如可以具有如下氨基酸序列：在满足那些富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列(例如序列号7、8、9或10)中、在1或数个位置取代、缺失、***和/或添加1或数个氨基酸。需要说明的是，上述“1或数个”也取决于满足那些富含Ala部位的条件的部分的长度等，但可以为例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个。另外，富含Ala部位例如可以具有如下氨基酸序列：相对于满足那些富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列(例如序列号7、8、9或10)整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同一性。关于满足那些富含Ala部位的条件的部分的变异体，只要改造后的氨基酸序列满足上述那样的富含Ala部位的条件则没有特别限定。
＜非富含Ala部位＞
“非富含Ala部位”是指Ala残基的比率低的部位。
非富含Ala部位的长度为4个残基以上。即，非富含Ala部位由4个残基以上的氨基酸序列构成。非富含Ala部位的长度可以为例如10个残基以上、15个残基以上、20个残基以上、30个残基以上、40个残基以上或50个残基以上。非富含Ala部位的长度可以为例如200个残基以下、150个残基以下、100个残基以下、80个残基以下、60个残基以下或40个残基以下。非富含Ala部位的长度可以为它们的不矛盾的组合范围。具体而言，非富含Ala部位的长度可以为例如4个残基～200个残基、10个残基～150个残基或15个残基～100个残基。
非富含Ala部位既可以含有Ala残基也可以不含有。非富含Ala部位中的Ala残基的比率为20％以下。非富含Ala部位中的Ala残基的比率可以为例如16％以下、14％以下、10％以下、5％以下或0％。
具体而言，非富含Ala部位可以含有例如选自Gly、Ser、Gln、Pro、Tyr中的1种或1种以上、例如上述全部的氨基酸残基。非富含Ala部位中的Gly、Ser、Gln、Pro、Tyr的比率的合计可以为例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％。非富含Ala部位可以含有不含Ala残基的连续4个氨基酸残基。非富含Ala部位例如可以在两端(N末端及C末端)含有不含Ala残基的连续4个氨基酸残基。
作为非富含Ala部位的氨基酸序列，可列举例如：丝心蛋白样蛋白质的氨基酸序列中的、满足上述那样的非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列。丝心蛋白样蛋白质如上所述。作为序列号2所示的氨基酸序列中的、满足上述那样的非富含Ala部位的条件的部分，可列举氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497、507～536的部分。即，非富含Ala部位例如可以具有满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列。另外，非富含Ala部位例如可以具有上述例示的非富含Ala部位的氨基酸序列(例如满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列)的部分序列。部分序列只要满足上述那样的非富含Ala部位的条件则没有特别限定。作为部分序列，可列举例如：满足上述那样的非富含Ala部位的长度的、上述例示的非富含Ala部位的氨基酸序列的部分序列。另外，作为部分序列，可列举例如：作为上述例示的非富含Ala部位的氨基酸序列的部分序列且具有那些非富含Ala部位的氨基酸序列的30％以上、50％以上、70％以上或90％以上的长度的序列。另外，作为满足那些非富含Ala部位的条件的部分中所含的基序，具体可列举例如：GGYGPGSGQQG(序列号11)、GGNGPGSGQQG(序列号12)、GGYGPGYGQQG(序列号13)、GGYGPGSGQG(序列号14)、PGQQG(序列号15)、AGQQG(序列号16)、SGQQG(序列号17)、PSQQG(序列号18)、PGGQG(序列号19)、PYGP(序列号20)、AYGP(序列号21)。将序列号11～14所示的基序总称为“基序A”，将序列号15～19所示的基序总称为“基序B”，将序列号20～21所示的基序总称为“基序C”。即，更一般而言，非富含Ala部位可以具有例如选自这些基序中的1种或1种以上。具体而言，非富含Ala部位例如可以具有基序A及B，进一步可以具有基序C。当非富含Ala部位具有选自这些基序中的2种或2种以上基序时，对它们的顺序没有特别限定。非富含Ala部位例如可以从N末端向C末端具有基序A及B，也可以具有基序A、B及C。非富含Ala部位可以仅具有这些基序中的任意1个，也可以具有2个或2个以上。当非富含Ala部位具有2个或2个以上任意基序时，该基序在非富含Ala部位中既可以随机排列，也可以并非如此。非富含Ala部位例如既可以仅具有1个基序B，也可以具有2个或2个以上。1个非富含Ala部位中所含的基序B的数可以为例如1个以上、2个以上、3个以上、5个以上或7个以上，可以为15个以下、10个以下、7个以下或5个以下，可以为它们的不矛盾的组合。
另外，非富含Ala部位可以为满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列的变异体、它们的部分序列的变异体或它们中所含的基序的变异体。关于满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列的变异体、它们的部分序列的变异体或它们中所含的基序的变异体，可以沿用关于丝心蛋白样蛋白质的保守变异体的记载。非富含Ala部位例如可以具有如下氨基酸序列：在满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列、它们的部分序列或它们中所含的基序中、在1或数个位置取代、缺失、***和/或添加1或数个氨基酸。需要说明的是，上述“1或数个”也取决于满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列、它们的部分序列或它们中所含的基序的长度等，可以为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。另外，非富含Ala部位例如可以具有如下氨基酸序列：相对于满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列整体、它们的部分序列整体或它们中所含的基序整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同一性。关于满足那些非富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列的变异体、它们的部分序列的变异体或它们中所含的基序的变异体，只要改造后的氨基酸序列满足上述那样的非富含Ala部位的条件则没有特别限定。
＜细胞粘附序列＞
“细胞粘附序列”是指：能够对丝心蛋白样蛋白质等蛋白质赋予对于干细胞等细胞的支架功能的氨基酸序列。具体而言，“细胞粘附序列”是指：通过***到丝心蛋白样蛋白质等蛋白质中，从而能够对该蛋白质赋予对于干细胞等细胞的支架功能的氨基酸序列。也将这样的性质(即，能够对丝心蛋白样蛋白质等蛋白质赋予对于干细胞等细胞的支架功能的性质)称为“作为细胞粘附序列的性质”。
细胞粘附序列由含有RGD(Arg-Gly-Asp)的3个残基～18个残基的氨基酸序列构成。即，细胞粘附序列的长度为3个残基～18个残基。细胞粘附序列既可以是由RGD构成的序列，也可以并非如此。作为细胞粘附序列，可列举作为细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列(细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列)的、含有RGD的序列(细胞粘附性蛋白的RGD序列)。另外，作为细胞粘附序列，也可列举作为细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列的组合的、含有RGD的序列。作为细胞粘附性蛋白，具体可列举例如：纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、骨桥蛋白、层粘连蛋白。作为细胞粘附序列的RGD序列，具体可列举例如：GRGDSP(序列号22)、VTGRGDSPAS(序列号23)、PQVTRGDVFTM(序列号24)、VTRGDVF(序列号25)、GRGDNP(序列号30)、GAAGRGDSPAAGY(序列号31)。即，细胞粘附序列可以为例如具有那些氨基酸序列(例如序列号22、23、24、25、30或31)的序列。
另外，细胞粘附序列只要保有RGD则也可以为那些氨基酸序列(例如序列号22、23、24、25、30及31等细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列)的变异体。关于那些氨基酸序列的变异体，可以沿用关于丝心蛋白样蛋白质的保守变异体的记载。细胞粘附序列例如可以具有如下氨基酸序列：在那些氨基酸序列(例如序列号22、23、24、25、30及31等细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列)中、在RGD以外的1或数个位置取代、缺失、***和/或添加1或数个氨基酸。需要说明的是，上述“1或数个”也取决于满足那些细胞粘附序列的条件的部分的长度等，可以为例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。另外，细胞粘附序列例如可以具有如下氨基酸序列：相对于满足那些细胞粘附序列的条件的部分氨基酸序列(例如序列号22、23、24、25、30及31等细胞粘附性蛋白的部分氨基酸序列)整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同一性且RGD是保守的。关于那些氨基酸序列的变异体，只要RGD是保守的且该变异体具有作为细胞粘附序列的性质(该变异体能够对丝心蛋白样蛋白质等蛋白质赋予对于干细胞等细胞的支架功能)则没有特别限定。
关于某些氨基酸序列是否具有作为细胞粘附序列的性质这一点，例如可以通过确认***有该氨基酸序列的丝心蛋白样蛋白质是否对于干细胞等细胞显示支架功能来进行确认。关于该蛋白质是否对于干细胞等细胞显示支架功能这一点，例如，可以通过使用用该蛋白质包被了细胞培养面的培养容器培养干细胞等细胞来确认。即，当用该蛋白质包被细胞培养面而干细胞等细胞的增殖得到改善的情况下，可以判断该蛋白质对于干细胞等细胞显示支架功能。
本发明的蛋白质在重复结构中含有细胞粘附序列。即，细胞粘附序列被***到重复结构中。换言之，本发明的蛋白质所具有的重复结构是***有细胞粘附序列的重复结构。具体而言，细胞粘附序列被***到(包含于)选自构成重复结构的重复单元中的一个或一个以上的重复单元中。细胞粘附序列例如可以被***到(包含于)选自构成重复结构的重复单元中的2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上或7个以上的重复单元中。细胞粘附序列例如可以被***到(包含于)构成重复结构的全部重复单元中。1个重复单元中既可以仅具有1个细胞粘附序列，也可以具有2个或2个以上。当1个重复单元具有2个或2个以上细胞粘附序列时，该细胞粘附序列在重复单元中既可以随机排列，也可以并非如此。1个重复单元中所含的细胞粘附序列的数可以为例如1个以上、2个以上或3个以上，可以为5个以下、3个以下或2个以下，可以为它们它们的不矛盾的组合。1个重复单元中所含的细胞粘附序列的数具体可以为例如1个～3个。本发明的蛋白质中所含的细胞粘附序列的总数例如可以为1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上或7个以上，可以为50个以下、40个以下、30个以下、25个以下、20个以下、15个以下或10个以下，可以为它们的组合。重复结构中所含的细胞粘附序列的总数具体可以为例如1个～50个、3个～30个或5个～15个。当本发明的蛋白质含有2个以上细胞粘附序列时，细胞粘附序列的构成可以分别独立地设定。即，作为细胞粘附序列，可以使用1种细胞粘附序列，也可以将2种或2种以上细胞粘附序列组合使用。
对重复单元中的细胞粘附序列的位置没有特别限定。各细胞粘附序列例如可以被***到非富含Ala部位中或者富含Ala部位与前述非富含Ala部位的连结部。作为***细胞粘附序列的非富含Ala部位，可列举例如序列号2所示的氨基酸序列中的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497、507～536的部分。作为***细胞粘附序列的非富含Ala部位，更具体而言，可列举例如序列号2所示的氨基酸序列中的氨基酸编号109和110、170和171、203和204、276和277、310和311、403和404、472和473之间。作为***细胞粘附序列的富含Ala部位与非富含Ala部位的连结部，可列举例如序列号2所示的氨基酸序列中的氨基酸编号61和62、91和92、100和101、120和121、129和130、151和152、160和161、185和186、194和195、218和219、227和228、257和258、266和267、291和292、300和301、325和326、334和335、369和370、378和379、438和439、447和448、497和498、506和507之间。细胞粘附序列除了可以***非富含Ala部位中和/或富含Ala部位与非富含Ala部位的连结部以外，还可以进一步***其它部位。作为其它部位，可列举富含Ala部位和后述的N末端区域及C末端区域。
＜其它部位＞
本发明的蛋白质可以在首个重复单元之前、即在重复结构之前进一步含有N末端区域。对N末端区域的氨基酸序列没有特别限定。N末端区域的长度可以为例如1个残基以上、3个残基以上、5个残基以上、10个残基以上、30个残基以上、50个残基以上或100个残基以上，可以为200个残基以下、150个残基以下、100个残基以下、80个残基以下、60个残基以下或40个残基以下，可以为它们的不矛盾的组合。具体而言，N末端区域可以为例如1个残基～200个残基。N末端区域例如可以含有满足非富含Ala部位的条件的氨基酸序列。
本发明的蛋白质可以在最后一个重复单元之后、即重复结构之后进一步含有C末端区域。对C末端区域的氨基酸序列没有特别限定。C末端区域的长度可以为例如1个残基以上、3个残基以上、5个残基以上、10个残基以上、30个残基以上、50个残基以上或100个残基以上，可以为200个残基以下、150个残基以下、100个残基以下、80个残基以下、60个残基以下或40个残基以下，可以为它们的不矛盾的组合。具体而言，C末端区域可以为例如1个残基～200个残基。C末端区域例如可以含有满足富含Ala部位的条件的氨基酸序列。另外，C末端区域例如可以含有与蜘蛛的丝心蛋白的C末端附近的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。作为蜘蛛的丝心蛋白的C末端附近的氨基酸序列，可列举例如：蜘蛛的丝心蛋白的C末端的50个残基的氨基酸序列、从C末端的50个残基中除去C末端的20个残基而得的氨基酸序列、从C末端的50个残基中除去C末端的29个残基而得的氨基酸序列。作为蜘蛛的丝心蛋白的C末端附近的氨基酸序列，具体可列举例如十字园蛛的ADF3(partial；NCBIAAC47010.1GI:1263287)的587位～636位(C末端的50个残基)的氨基酸序列、587位～616位的氨基酸序列、587位～607位的氨基酸序列。作为在C末端具有十字园蛛的ADF3(partial；NCBI AAC47010.1GI:1263287)的587位～636位的氨基酸序列的本发明的蛋白质，具体可列举例如具有序列号4、6、27、29、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示的氨基酸序列的蛋白质。
另外，N末端区域及C末端区域均可以含有例如肽标签、蛋白酶识别序列等功能性序列。作为功能性序列，可以使用1种功能性序列，也可以将2种或2种以上功能性序列组合使用。作为肽标签，具体可列举His标签、FLAG标签、GST标签、Myc标签、MBP(maltosebinding protein，麦芽糖结合蛋白)、CBP(cellulose binding protein，纤维素结合蛋白)、TRX(thioredoxin，硫氧还蛋白)、GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)、HRP(horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)、ALP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)、抗体的Fc区。肽标签例如可以用于表达出的蛋白质的检测、纯化。作为蛋白酶识别序列，具体可列举HRV3C蛋白酶识别序列、Factor Xa蛋白酶识别序列、proTEV蛋白酶识别序列。蛋白酶识别序列例如可以用于表达出的蛋白质的切割。作为在N末端具有His标签和HRV3C蛋白酶识别序列的本发明的蛋白质，具体可列举例如具有序列号4、6、36、42、48或50所示的氨基酸序列的蛋白质。
＜1-2＞本发明的蛋白质的制造
本发明的蛋白质可以通过使具有编码本发明的蛋白质的基因的宿主表达编码本发明的蛋白质的基因来制造。需要说明的是，也将“具有编码本发明的蛋白质的基因”这一点称为“具有本发明的蛋白质”。即，例如也将具有编码本发明的蛋白质的基因的宿主称为“具有本发明的蛋白质的宿主”。另外，也将编码本发明的蛋白质的基因的表达称为“本发明的蛋白质的表达”。另外，本发明的蛋白质也可以通过用无细胞蛋白质合成***使编码本发明的蛋白质的基因表达来制造。
具有编码本发明的蛋白质的基因的宿主可以通过向适当的宿主中导入编码本发明的蛋白质的基因来得到。
导入编码本发明的蛋白质的基因的宿主只要能够表达本发明的蛋白质则没有特别限定。作为宿主，可列举例如：细菌、放线菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞及动物细胞。作为优选的宿主，可列举细菌、酵母等微生物。作为更优选的宿主，可列举细菌。作为细菌，可列举革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌。作为革兰氏阴性菌，可列举例如：埃希氏菌(Escherichia)属细菌、肠杆菌(Enterobacter)属细菌、泛菌(Pantoea)属细菌等属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌。作为革兰氏阳性菌，可列举：芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌等杆状细菌。作为埃希氏菌属细菌，可列举例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。作为杆状细菌，可列举例如：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(驻地棒状杆菌)(Corynebacteriumammoniagenes(Corynebacterium stationis))。作为宿主，可以优选使用其中的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。作为大肠埃希氏菌，具体可列举例如：W3110株(ATCC 27325)、MG1655株(ATCC 47076)等大肠埃希氏菌K-12株；大肠埃希氏菌K5株(ATCC 23506)；BL21(DE3)株、作为其recA-株的BLR(DE3)株等大肠埃希氏菌B株；及它们的衍生菌株。
这些菌株例如可以从美国典型培养物保藏中心(地址12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States ofAmerica)获得。即，各菌株已被赋予对应的注册编号，利用该注册编号可获得(参照http://www.atcc.org/)。各菌株的对应注册编号记载在美国典型培养物保藏中心的产品目录中。另外，BL21(DE3)株例如可以由Life Technology Inc.获得(产品编号C6000-03)。另外，BLR(DE3)株例如可以由merckmillipore公司获得(产品编号69053)。
编码本发明的蛋白质的基因例如可以通过向丝心蛋白样蛋白质基因中***编码细胞粘附序列的碱基序列来取得。丝心蛋白样蛋白质基因可以通过从蜘蛛、蚕等具有丝心蛋白样蛋白质基因的生物中克隆而取得。克隆时，可以利用含有该基因的基因组DNA、cDNA等核酸。所取得的丝心蛋白样蛋白质基因可以直接或适当改造后作为编码本发明的蛋白质的基因的基础来利用。编码细胞粘附序列的碱基序列的***等基因改造可以通过公知方法进行。例如，可以通过位点特异性突变法向DNA的目标部位导入目标变异。即，例如，可以通过位点特异性突变法对基因的编码区域进行改造，从而使所编码的蛋白质的特定部位的氨基酸残基含有取代、缺失、***和/或添加。作为位点特异性突变法，可列举使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。另外，编码本发明的蛋白质的基因例如也可以通过化学合成来取得(Gene,60(1),115-127(1987))。
对将编码本发明的蛋白质的基因导入到宿主中的方法没有特别限定。在宿主中，编码本发明的蛋白质的基因按照在于该宿主中起作用的启动子的控制下能够进行表达的方式保持即可。在宿主中，编码本发明的蛋白质的基因既可以存在于质粒之类的在染色体外自主复制的载体上，也可以导入到染色体上。宿主既可以仅具有1拷贝的编码本发明的蛋白质的基因，也可以具有2拷贝或2拷贝以上的编码本发明的蛋白质的基因。宿主既可以仅具有1种编码本发明的蛋白质的基因，也可以具有2种或2种以上的编码本发明的蛋白质的基因。
用于使编码本发明的蛋白质的基因表达的启动子只要是在宿主中起作用的启动子则没有特别限定。“在宿主中起作用的启动子”是指在宿主中具有启动子活性的启动子。启动子既可以是来自宿主的启动子，也可以是异源启动子。启动子既可以是编码本发明的蛋白质的基因的固有启动子，也可以是其它基因的启动子。启动子可以是比编码本发明的蛋白质的基因的固有启动子强的启动子。作为在大肠埃希氏菌等肠杆菌科的细菌中起作用的强启动子，可列举例如：T7启动子、trp启动子、trc启动子、lac启动子、tac启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、PR启动子及PL启动子。另外，作为在杆状细菌中起作用的强启动子，可列举：人工设计改变后的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnolo.,53,674-679(2000))；能够在杆状细菌内由乙酸、乙醇、丙酮酸等诱导的pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子；在杆状细菌内表达量多的强启动子cspB、SOD、tuf(EF-Tu)启动子(Journal ofBiotechnology 104(2003)311-323,Appl Environ Microbiol.2005Dec；71(12):8587-96.)、lac启动子、tac启动子、trc启动子。另外，作为启动子，还可以使用各种报道基因来取得原有启动子的高活性型并利用。例如，通过使启动子区域内的-35、-10区域靠近共有序列，可以提高启动子的活性(国际公开第00/18935号)。作为高活性型启动子，可列举各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application2006134574)、pnlp8启动子(WO2010/027045)。作为启动子强度的评价法及强启动子的例子，记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters inbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。
另外，可以在编码本发明的蛋白质的基因的下游配置用于终止转录的终止子。终止子只要是在宿主中起作用的终止子则没有特别限定。终止子既可以是来自宿主的终止子，也可以是异源终止子。终止子既可以是编码本发明的蛋白质的基因的固有终止子，也可以是其它基因的终止子。作为终止子，具体可列举例如T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子及trpA终止子。
编码本发明的蛋白质的基因例如可以使用含有该基因的载体导入到宿主中。也将含有编码本发明的蛋白质的基因的载体称为编码本发明的蛋白质的基因的表达载体或重组载体。编码本发明的蛋白质的基因的表达载体例如可以通过将含有编码本发明的蛋白质的基因的DNA片段与在宿主中起作用的载体连结来构建。通过用编码本发明的蛋白质的基因的表达载体转化宿主，由此可以得到导入有该载体的转化体，即，可以将该基因导入到宿主中。作为载体，可以使用能够在宿主细胞中自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。另外，为了选择转化体，载体优选具有抗生素抗性基因等标记。另外，载体可以具备用于使所***的基因表达的启动子、终止子。载体可以为例如来自细菌质粒的载体、来自酵母质粒的载体、来自噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为能够在大肠埃希氏菌等肠杆菌科的细菌中自主复制的载体，具体可列举例如：pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(均可由宝生物公司获得)；pACYC184、pMW219(NIPPON GENE CO.,LTD.)、pTrc99A(Pharmacia公司)、pPROK系载体(Clontech公司)、pKK233‐2(Clontech公司制)、pET系载体(Novagen公司)、pQE系载体(Qiagen公司)、pACYC、泛宿主性载体RSF1010。作为能够在杆状细菌中自主复制的载体，具体可列举例如：pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；对这些进行了改良的具有抗药基因的质粒；日本特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30；日本特开平2-72876号公报及美国专利5,185,262号说明书公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及pCRY3KX；日本特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2及pCRY3；日本特开昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611及pAJ1844；日本特开昭57-134500号公报中记载的pCG1；日本特开昭58-35197号公报中记载的pCG2；日本特开昭57-183799号公报中记载的pCG4及pCG11。在构建表达载体时，例如既可以将含有固有启动子区域的编码本发明的蛋白质的基因直接重组到载体中，也可以使本发明的蛋白质的编码区域结合在上述那样的启动子下游后再重组到载体中，还可以在载体上原本具备的启动子的下游组入本发明的蛋白质的编码区域。
关于各种微生物中能够利用的载体、启动子、终止子，例如在“微生物学基础讲座8基因工学、共立出版、1987年”中有详细记载，可以利用这些载体、启动子、终止子。
另外，编码本发明的蛋白质的基因例如可以对宿主的染色体进行导入。基因对染色体的导入例如可以利用同源重组来进行(Miller,J.H.Experiments in MolecularGenetics,1972,Cold Spring Harbor Laboratory)。作为利用同源重组的基因导入法，可列举例如：Red-driven integration法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用能够接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内起作用的复制起点的***载体的方法、使用噬菌体的转导法。基因既可以仅导入1拷贝，也可以导入2拷贝或2拷贝以上。例如，通过以在染色体上存在多个拷贝的序列为靶进行同源重组，可以对染色体导入基因的多个拷贝。作为在染色体上存在多个拷贝的序列，可列举重复DNA序列(repetitive DNA)、存在于转座子两端的反向重复序列。另外，也可以以本发明的实施中不需要的基因等染色体上的适当序列为靶进行同源重组。另外，基因还可以使用转座子、Mini-Mu随机地导入到染色体上(日本特开平2-109985号公报、US5,882,888、EP805867B1)。在对染色体导入基因时，例如，既可以将含有固有启动子区域的编码本发明的蛋白质的基因直接重组到染色体中，也可以将本发明的蛋白质的编码区域结合到上述那样的启动子的下游后重组到染色体中，还可以在染色体上原本存在的启动子的下游重组本发明的蛋白质的编码区域。
关于基因已被导入到染色体上这一点，例如，可以通过使用具有与该基因的全部或部分互补的碱基序列的探针的DNA印迹确认，或者使用基于该基因的碱基序列制作的引物通过PCR来确认。
对转化法没有特而被限定，可以使用以往已知的方法。作为转化法，可列举例如：已报道的关于大肠埃希氏菌K-12的用氯化钙处理接受菌细胞而增加DNA通透性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.1970,53,159-162)；已报道的关于枯草芽孢杆菌的、由增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.E..,1997.Gene 1:153-167)等。另外，作为转化法，还可以应用以下方法：关于枯草芽孢杆菌、放线菌类及酵母的已知的、将DNA接受菌的细胞制成容易引入重组DNA的原生质体或原生质球状态，将重组DNA导入到DNA接受菌中(Chang,S.and Choen,S.N.,1979.Mol.Gen.Genet.168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.1978.Nature274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933)。另外，作为转化法，还可以利用已报道的关于杆状细菌的电脉冲法(日本特开平2-207791号公报)。
通过培养具有编码本发明的蛋白质的基因的宿主，可以使其表达本发明的蛋白质。此时，可以根据需要进行基因的表达诱导。宿主的培养条件、基因表达诱导的条件可以根据标记的种类、启动子的种类及宿主的种类等各条件适当选择。培养中所使用的培养基只要宿主能够增殖且能够表达本发明的蛋白质则没有特别限定。作为培养基，可以使用例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子及根据需要使用的其它有机成分的常规培养基。
作为碳源，可列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解物等糖类；甘油、乙醇等醇类；富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。
作为氮源，可列举：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐；大豆水解物等有机氮；氨气、氨水。
作为硫源，可列举：硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、次硫酸盐、硫代硫酸盐等无机硫化合物。
作为无机离子，可列举钙离子、镁离子、锰离子、钾离子、铁离子、磷酸根离子。
作为其它有机成分，可列举有机微量营养源。作为有机微量营养源，可列举：维生素B1等需求物质、含有它们的酵母提取物等。
培养温度可以为例如20℃～45℃，优选为24℃～45℃，更优选为30℃～37℃。培养优选为通气培养。此时的氧浓度例如可以相对于饱和浓度调节为5～50％、优选20～40％。培养中的pH优选为5～9。需要说明的是，为了调整pH，可使用无机或有机的酸性或碱性的物质，例如碳酸钙、氨气、氨水等。培养时间可以为例如10小时～120小时。
尤其是使用大肠埃希氏菌作为宿主时，通过降低诱导本发明的蛋白质表达时的有机酸蓄积(WO2015/178465)、减少诱导本发明的蛋白质表达后的菌体增殖(WO2015/178466)，可期待能够高效地制造本发明的蛋白质。
通过如上所述地培养具有编码本发明的蛋白质的基因的宿主，由此本发明的蛋白质蓄积在培养基中和/或菌体内。本发明的蛋白质例如能够以包涵体形式蓄积在菌体内。
本发明的蛋白质的回收及定量例如可以参照对异源表达的蛋白质进行回收及定量的已知方法(例如“新生化学实验讲座蛋白质VI合成及表达”日本生化学会编、东京化学同人(1992)pp183-184)来进行。
以下例示出本发明的蛋白质以包涵体形式蓄积在菌体内时的回收及定量的步骤。首先，通过离心操作从培养液中收集菌体，然后用缓冲液悬浮。将菌体悬浮液供于超声波处理、弗氏压碎器等处理来破碎菌体。在破碎菌体之前，可以以终浓度0-200mg/l向菌体悬浮液中添加溶菌酶并在冰中放置30分钟至20小时。然后，通过低速离心分离(6000-15000rpm、5-10分钟、4℃)以沉淀形式从破碎物中得到不溶性级分。不溶性级分在必要时适当地用缓冲液洗涤。对洗涤次数没有特别限定，可以为例如1次、2次或3次以上。通过用缓冲液悬浮不溶性级分，由此可得到本发明的蛋白质的悬浮液。作为用于悬浮菌体、本发明的蛋白质的缓冲液，可以优选使用本发明的蛋白质的溶解性低的缓冲液。作为这样的缓冲液，可列举例如含有NaCl的Tris-HCl缓冲液。缓冲液的pH例如通常可以为4～12，优选为6～9。另外，通过将不溶性级分用SDS溶液、尿素溶液溶解，得到本发明的蛋白质的溶液。回收的本发明的蛋白质除了本发明的蛋白质以外还可以含有细菌菌体、培养基成分及细菌的代谢副产物等成分。本发明的蛋白质可以纯化为期望的程度。本发明的蛋白质的纯化可以通过用于蛋白质纯化的公知方法来进行。作为这样的方法，可列举例如：硫铵分级、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、等电点沉淀、透析。这些方法既可以单独使用1种，也可以将2种或2种以上适当组合使用。本发明的蛋白质的量例如可以将悬浮液、溶液等含有本发明的蛋白质的样品供于SDS-PAGE并染色、然后基于与本发明的目标蛋白质的分子量相当的位置的条带的强度来确定。染色可以通过CBB染色、荧光染色、银染色等进行。定量时，可以使用已知浓度的蛋白质作为标准。作为这样的蛋白质，可列举例如：白蛋白、另行确定了浓度的本发明的蛋白质。
对本发明的蛋白质的用途没有特别限定。本发明的蛋白质例如可以用于医疗用途、研究用途。本发明的蛋白质对于干细胞等细胞显示支架功能。因此，本发明的蛋白质可以用于例如干细胞等细胞的培养。具体而言，本发明的蛋白质例如可以作为用于细胞培养的支架蛋白质使用。另外，本发明的蛋白质例如可以作为细胞培养用器具等器具的构成要素使用。具体而言，本发明的蛋白质例如可以包被于细胞培养容器等器具的表面来使用。关于器具、细胞培养，可以沿用后述的关于本发明的器具、本发明的方法的说明。
本发明的蛋白质例如可以与其它蛋白质(除本发明的蛋白质以外的蛋白质)组合使用。即，本发明的蛋白质例如可以与其它蛋白质组合使用来用于上述那样的用途。
其它蛋白质只要不损害本发明的蛋白质的效果则没有特别限定。其它蛋白质可以为例如：通过与本发明的蛋白质组合使用，从而与单独利用本发明的蛋白质时相比，干细胞等细胞的培养得到改善的蛋白质。作为细胞的培养的改善，可列举例如细胞增殖增加。
作为其它蛋白质，可列举例如以下的(1)～(8)中记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质(细胞粘附性蛋白)；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与上述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
作为上述(1)的蛋白质，可列举例如肝素。已知肝素使培养基中的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor；bFGF)稳定。即，作为培养基中的成分，可列举例如bFGF。作为上述(3)或(5)的蛋白质，可列举例如：纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、骨桥蛋白、层粘连蛋白等具有细胞支架功能的蛋白质。作为上述(8)的蛋白质，可列举例如玻连蛋白。已知玻连蛋白具有肝素结合序列。
作为上述(2)、(4)、(6)或(8)的蛋白质分别为例如：作为丝心蛋白样蛋白质、具有细胞支架功能的蛋白质且***有上述(2)、(4)、(6)或(8)中言及的氨基酸序列的蛋白质。关于这样的氨基酸序列的***，可以沿用关于本发明的蛋白质中的细胞粘附序列的***的记载。作为上述(2)、(4)、(6)或(8)中言及的氨基酸序列，分别为例如：作为上述(1)、(3)、(5)或(7)的蛋白质的部分序列且具有相应功能的氨基酸序列。作为上述(8)中言及的氨基酸序列，具体可列举例如GKKQRFRHRNRKG(序列号34)。序列号34的氨基酸序列是在玻连蛋白的肝素结合序列的两端添加G而成的氨基酸序列。作为具有细胞支架功能的蛋白质，具体可列举例如纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、骨桥蛋白、层粘连蛋白等作为上述(3)或(5)的蛋白质而例示的蛋白质。即，具有细胞支架功能的蛋白质典型地可以为其自体、上述(3)或(5)的蛋白质。
作为其它蛋白质，具体可列举例如具有序列号50所示的氨基酸序列的蛋白质。
其它蛋白质、其构成要素只要可得到期望的效果则也可以为具有上述例示的氨基酸序列、其它公知的氨基酸序列的蛋白质的变异体。关于其它蛋白质、其构成要素的变异体，可以沿用关于丝心蛋白样蛋白质的保守变异体的记载。
＜2＞本发明的组合物
本发明的组合物为含有本发明的蛋白质的组合物。对本发明的组合物的用途没有特别限定。本发明的组合物可以用于例如医疗用途、研究用途。即，本发明的组合物可以为例如用于医疗或用于研究的组合物。本发明的组合物具体可以用于例如干细胞等细胞的培养。即，本发明的组合物具体可以为例如用于细胞培养的组合物。更具体而言，本发明的组合物可以为例如细胞支架材料。“细胞支架材料”是指作为细胞的支架起作用的结构物，具体是指在细胞培养时作为细胞的支架起作用的结构物。细胞支架材料可以用于例如细胞培养。即，可以将细胞支架材料作为支架来进行细胞培养。利用细胞支架材料得到的细胞培养的产物(培养细胞、细胞片、组织、脏器等)例如可以从细胞支架材料回收后或连通细胞支架材料一起用于治疗等期望用途。另外，细胞支架材料可以植入生物体内而用于在生物体内培养细胞(介由细胞的粘附及增殖进行的组织形成等)。另外，更具体而言，本发明的组合物可以为例如细胞培养容器等器具的包被剂。关于器具、细胞培养，可以沿用后述的关于本发明的器具、本发明的方法的说明。
本发明的组合物既可以由本发明的蛋白质构成，也可以并非如此。本发明的组合物可以由本发明的蛋白质与其它成分的组合构成。即，本发明的蛋白质可以单独或组合其它成分后作为本发明的组合物来使用。其它成分只要具有与本发明的组合物的利用方式相应的可接受的性质则没有特别限定。作为其它成分，可列举例如配合在药品、试剂中利用的成分。作为这样的成分，具体可列举例如：赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、矫臭剂、香料、稀释剂、表面活性剂等添加剂。另外，作为其它成分，可列举例如其它蛋白质(除本发明的蛋白质以外的蛋白质)。关于其它蛋白质，如上所述。
对本发明的组合物中的本发明的蛋白质的浓度(含量)没有特别限定。本发明的组合物中的本发明的蛋白质的浓度可根据本发明的组合物的利用方式等各条件适当设定。本发明的组合物中的本发明的蛋白质的浓度可以为例如0.01％(w/w)以上、0.1％(w/w)以上、1％(w/w)以上、5％(w/w)以上或10％(w/w)以上，可以为100％(w/w)以下、99.9％(w/w)以下、70％(w/w)以下、50％(w/w)以下、30％(w/w)以下、10％(w/w)以下或5％(w/w)以下或1％(w/w)以下，可以为它们的不矛盾的组合。
对本发明的组合物的形状没有特别限定。本发明的组合物的形状可以根据本发明的组合物的利用方式等各条件适当设定。本发明的组合物可以以期望的形状来制剂化。作为本发明的组合物的形状，具体可列举例如：液体(溶液、悬浮液等)、糊、粉末、颗粒、球体、板状、泡沫、海绵、纤维、薄膜、片、膜片、网、管。
本发明的组合物例如可以直接地或适当用水、水性缓冲液等介质稀释、分散或溶解等来用于期望的用途(例如器具的包被)。如此进行了稀释、分散或溶解等的情况当然也包含在本发明的组合物的范围内。
＜3＞本发明的器具
本发明的器具为具备本发明的蛋白质的器具。对本发明的器具的用途没有特别限定。本发明的器具可以用于例如医疗用途、研究用途。即，本发明的器具可以为例如用于医疗或用于研究的器具。本发明的器具具体可以用于例如干细胞等细胞的培养。即，本发明的器具具体可以为例如细胞培养用器具。作为细胞培养用器具，可列举细胞培养容器、细胞支架材料。也将作为细胞培养容器的本发明的器具特别地称为“本发明的培养容器”。另外，也将作为细胞支架材料的本发明的器具特别地称为“本发明的细胞支架材料”。本发明的器具以可发挥本发明的蛋白质的功能的方式来具备本发明的蛋白质即可。本发明的器具例如可以在表面具备本发明的蛋白质。即，本发明的器具具体可以为例如表面包被有本发明的蛋白质的器具。另外，当本发明的蛋白质、本发明的组合物构成为能够直接作为器具使用的方式时，也可以将本发明的蛋白质、本发明的组合物直接作为本发明的器具来使用。具体而言，例如当本发明的组合物构成为细胞支架材料时，可以将本发明的组合物直接作为本发明的细胞支架材料来使用。关于细胞培养，可以沿用后述的关于本发明的方法的说明。
本发明的器具可以还具备其它蛋白质(除本发明的蛋白质以外的蛋白质)。关于其它蛋白质，如上所述。关于本发明的器具中的其它蛋白质的利用方式，可以沿用关于本发明的器具中的本发明的蛋白质的利用方式的记载。例如，本发明的器具可以是除了本发明的蛋白质以外表面还包被有其它蛋白质的器具。
以下，主要参照培养容器来说明本发明的器具，该说明也可以沿用于其它器具。即，以下的说明可以直接地或根据器具形态、用途等各条件适当变更后用于其它器具。
培养容器只要具有能够培养细胞的材质和形状则没有特别限定。培养容器例如可以具有能够保持细胞和培养基的材质和形状。作为培养容器的形状，具体可列举例如盘、多孔板、烧瓶、Cell insert、膜片。作为培养容器的材质，具体可列举例如：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、三乙酰基纤维素(TAC)、聚酰亚胺(PI)、尼龙(Ny)、低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)、氯乙烯、偏氯乙烯、聚苯硫醚、聚醚砜、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、氨基甲酸酯丙烯酸酯等塑料类；聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、它们的共聚物等生物降解性聚合物类；玻璃、改性玻璃等玻璃类；陶瓷类、金属类、纤维素、其它各种高分子化合物。
本发明的培养容器至少在其细胞培养面具备本发明的蛋白质。即，本发明的培养容器例如其细胞培养面可以被本发明的蛋白质包被。“细胞培养面”是指实施细胞培养的表面，具体而言，是指培养细胞时可与细胞接触的部位。本发明的蛋白质只要能够使用本发明的培养容器培养干细胞等细胞则既可以包被培养容器的整个细胞培养面，也可以并非如此。被本发明的蛋白质包被的部分的面积相对于培养容器的细胞培养面的总面积的比率可以为例如50％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。本发明的蛋白质通常优选包被培养容器的整个细胞培养面。例如，如果培养容器为盘形状，则优选用本发明的蛋白质包被整个底面。
对用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面的方法没有特别限定。用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面例如可以使用用功能性材料包被培养容器表面的公知方法来实施。例如，通过将含有本发明的蛋白质的溶液施涂于培养容器的细胞培养面，从而可以用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面。具体而言，例如通过将含有本发明的蛋白质的溶液施涂于培养容器的细胞培养面并干燥(使溶剂挥发)，从而可以用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面。另外，具体而言，例如将含有本发明的蛋白质的溶液施涂于培养容器的细胞培养面并经过时间(以下也称为“包被时间”)，由此可以用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面。包被时间只要能够用本发明的蛋白质以期望的程度包被培养容器的细胞培养面，则没有特别限定。包被时间可以为例如30分钟以上、1小时以上、6小时以上、12小时以上或18小时以上，可以为72小时以下、48小时以下或30小时以下，可以为它们的组合。在经过包被时间之后，可以适当除去残存的溶液，另外可以进行干燥。培养容器可以适当进行灭菌。培养容器例如可以在用本发明的蛋白质包被培养容器的细胞培养面后进行灭菌。灭菌例如可以使用乙醇、2-丙醇等醇。醇例如可以以70％乙醇等含水醇形式来使用。灭菌例如可以通过在细胞培养面施涂醇、将培养容器在醇中浸渍来实施。由此，细胞培养前的灭菌可以使用醇来实施，为了以防万一，可以将含有本发明的蛋白质的溶液用过滤器灭菌等进行灭菌后施涂于培养容器的细胞培养面，在无菌条件下进行以后的操作。过滤器灭菌例如可以使用merckmillipore公司制Millex等过滤器。可以适当地进行无菌操作。在用本发明的蛋白质和其它蛋白质包被培养容器时，本发明的蛋白质的包被和其它蛋白质的包被既可以同时实施也可以分别实施。在分别实施本发明的蛋白质的包被和其它蛋白质的包被时，对其顺序没有特别限定。本发明的培养容器既可以在制造后(包被本发明的蛋白质后)立即使用，也可以在适当保存后使用。在制造后不立即使用本发明的培养容器时，对于干细胞等细胞的培养也是有效的。保存温度可以为例如0℃～50℃、0℃～40℃、0℃～25℃或0℃～10℃。保存期可以为例如1年以下、6个月以下或1个月以下。本发明的培养容器既可以以干燥状态保存，也可以以湿润状态保存。例如，可以以用PBS等缓冲液润湿细胞培养面的状态来保存。
培养容器表面上的本发明的蛋白质的包被量只要能够使用本发明的培养容器培养干细胞等细胞则没有特别限定。培养容器表面上的本发明的蛋白质的包被量可以为例如0.1μg/cm2以上、0.2μg/cm2以上、0.4μg/cm2以上、1μg/cm2以上或5μg/cm2以上，也可以为500μg/cm2以下、250μg/cm2以下、100μg/cm2以下或50μg/cm2以下，也可以为它们的组合。培养容器表面上的本发明的蛋白质的包被量具体可以为例如0.1μg/cm2～500μg/cm2，优选为0.2μg/cm2～250μg/cm2，更优选为0.4μg/cm2～100μg/cm2。
同样，也可以适当取得本发明的细胞支架材料。细胞支架材料只要具有能够培养细胞的材质和形状则没有特别限定。细胞支架材料例如可以具有与作为目标的细胞培养产物(细胞片、组织、脏器等)的形状相应的形状。细胞支架材料例如可以构成为多孔等具有空隙的形态，从而在细胞支架材料的内部填充细胞。作为细胞支架材料的材质，例如从适合于植入生物体内等观点出发，可优选列举生物体吸收性高分子。作为生物体吸收性高分子，具体可列举例如：聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸与乙醇酸的共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、糖胺聚糖、几丁质、脱乙酰壳多糖、透明质酸、多肽。本发明的细胞支架材料例如通过用本发明的蛋白质包被细胞支架材料的表面(具体为细胞培养面)而得到。需要说明的是，当“细胞支架材料的表面”构成为细胞支架材料具有空隙的方式时，也包括空隙内部的表面。另外，例如如上所述，也可以将以细胞支架材料形式构成的本发明的组合物直接作为本发明的细胞支架材料使用。
＜4＞本发明的方法
利用本发明的蛋白质，可以高效地培养干细胞等细胞。具体而言，可以利用具备本发明的蛋白质的器具(本发明的器具)高效地培养干细胞等细胞。更具体而言，可以利用本发明的培养容器、本发明的细胞支架材料等具备本发明的蛋白质的培养器具高效地培养干细胞等细胞。即，本发明提供一种培养细胞的方法，其含有：用本发明的培养容器、本发明的细胞支架材料等本发明的器具培养细胞。也将该方法称为“本发明的方法”。本发明的蛋白质尤其对iPS细胞等干细胞的增殖显示高的效果。即，本发明的蛋白质及具备其的细胞培养容器、细胞支架材料等细胞培养用器具例如能够用于使iPS细胞等干细胞增殖。另外，本发明的蛋白质及具备其的细胞培养容器、细胞支架材料等细胞培养用器具不限于用于iPS细胞等干细胞的增殖，还能够用于例如作为其的前一阶段的iPS细胞等干细胞的建立、以及作为其后一阶段的iPS细胞等干细胞的分化。即，在本发明中，“细胞的培养”不限于细胞增殖，还包括例如：干细胞、前体细胞等具有分化能力细胞的建立；由干细胞、前体细胞等具有分化能力的细胞向其它细胞的分化。具体而言，“干细胞的培养”不限于干细胞的增殖，还包括例如：干细胞的建立(例如iPS细胞、ES细胞等全能干细胞或多能干细胞的建立)、干细胞的分化(例如由iPS细胞、ES细胞等干细胞向其它干细胞、前体细胞或成熟细胞的分化)。根据本发明的方法，可得到培养后的细胞(培养细胞)。即，本发明的方法的一方式为制造培养细胞的方法，其含有：用本发明的培养容器、本发明的细胞支架材料等本发明的器具培养细胞。通过本发明的方法得到的培养细胞既可以已经分化，也可以未分化。即，通过本发明的方法得到的培养细胞例如既可以维持未分化状态，也可以获得未分化状态。通过本发明的方法得到的培养细胞例如既可以是干细胞、前体细胞等具有分化能力的细胞，也可以是前体细胞、成熟细胞等已分化的细胞。通过本发明的方法得到的培养细胞例如既可以是游离的细胞(每一个都独立的细胞)，也可以是细胞片、组织、脏器等组织化的细胞。
对所培养的细胞的种类没有特别限定。本发明的方法尤其可以优选用于干细胞的培养。作为干细胞，具体可列举例如：胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、多能性生殖干细胞(mGS细胞)、神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞。作为干细胞，更具体而言，可列举例如：胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)。细胞可以来自任意生物组织。作为生物组织，可列举皮肤、角膜、肝脏、消化器官、乳腺、***、毛根、气管、口腔粘膜。对作为细胞来源的生物没有特别限定，可以根据使用目的等适当选择。就作为细胞来源的生物而言，可列举例如哺乳类。作为哺乳类，具体可列举例如：人、大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、犬、猫、绵羊、猪、黑猩猩。哺乳类可以为免疫缺陷动物。在将培养出的细胞用于人的治疗时，就作为细胞来源的生物而言，优选例如选自人、猪、黑猩猩中的哺乳类。本发明的方法中，既可以仅培养1种细胞，也可以对2种或2种以上的细胞进行共培养。
培养条件只要是可得到期望的培养结果(细胞增殖、干细胞的建立、细胞的分化等)的条件则没有特别限定。就培养条件而言，除了使用本发明的培养容器、本发明的细胞支架材料等本发明的器具以外，例如可以与ES细胞、iPS细胞等细胞的培养中所使用的常规条件相同。培养条件可以根据本发明的器具形态、细胞种类、作为细胞来源的生物种属等各条件适当设定。
培养基的组成可以根据所培养的细胞的性质等各条件适当设定。作为培养基成分，可列举例如：葡萄糖等碳源、氨基酸、维生素、磷酸盐、缓冲剂、生长因子、血清、血清白蛋白。作为细胞培养中所使用的常规培养基，具体看列举例如α-MEM、DMEM、KCM。另外，作为胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)的培养中所使用的常规培养基，具体可列举例如Essential 8培养基(Invitrogen公司制)、StemFit(R)培养基(味之素公司制)、其它的实施例中所使用的培养基。
根据本发明的方法，不使用饲养细胞、其它细胞粘附蛋白(除本发明的蛋白质以外的细胞粘附蛋白)也能够高效地培养干细胞等细胞。但是，这并不妨碍使用饲养细胞、其它细胞粘附蛋白。即，在本发明的方法中，可以使用饲养细胞、其它细胞粘附蛋白(除本发明的蛋白质以外的细胞粘附蛋白)，也可以不使用。在本发明的方法中，优选与细胞的培养中使用的常规量相比降低饲养细胞、其它细胞粘附蛋白的使用量。在本发明的方法中，更优选不使用饲养细胞、其它细胞粘附蛋白。
培养开始时所接种的细胞数可以为例如1×103cells/cm2以上、1×104cells/cm2以上或2×104cells/cm2以上，可以为1×106cells/cm2以下、1×105cells/cm2以下或5×104cells/cm2以下，可以为它们的组合。培养温度可以为例如36℃～38℃，优选为约37℃。培养pH可以为例如pH6.8～7.2。培养时的气相可以为例如空气与二氧化碳的混合气体。具体而言，例如可以在5％二氧化碳和95％空气的气氛下进行培养。培养期可以为例如5～30天，优选为7～16天。培养中，可以实施培养基更换。
在本发明的方法中，可以将本发明的蛋白质与其它蛋白质(除本发明的蛋白质以外的蛋白质)组合使用。关于其它蛋白质，如上所述。例如，通过使用还具备其它蛋白质的、具备本发明的蛋白质的器具(本发明的器具)，可以将本发明的蛋白质与其它蛋白质组合使用。另外，例如，通过使用含有其它蛋白质的培养基，可以将本发明的蛋白质与其它蛋白质组合使用。
通过如此实施细胞培养，可得到培养细胞。
实施例
以下基于实施例对本发明进行更具体的说明。
实施例1：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的制作(1)
＜1＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质表达株的构建
如下构建了表达编码丝心蛋白样蛋白质ADF3的基因的质粒pET22b-ADF3：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3基因的碱基序列示于序列号1，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3的氨基酸序列示于序列号2。需要说明的是，序列号2所示的ADF3蛋白在N末端具有His标签和HRV3C蛋白酶识别序列。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#2的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#2：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#2用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#2基因的碱基序列示于序列号3，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#2的氨基酸序列示于序列号4。需要说明的是，序列号3的8位～2200位的碱基序列编码序列号4所示的氨基酸序列。ADF3RGDS#2在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)细胞粘附序列“GRGDSP”(序列号22)。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#3的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#3：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#3用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#3基因的碱基序列示于序列号5，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#3的氨基酸序列示于序列号6。需要说明的是，序列号5的8位～2116位的碱基序列编码序列号6所示的氨基酸序列。ADF3RGDS#3在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)。
通过用上述pET22b-ADF3、pET22b-ADF3RGDS#2及pET22b-ADF3RGDS#3分别转化大肠埃希氏菌BLR(DE3)株(F-ompT hsdSB(rB -mB -)gal dcm(DE3)Δ(srl-recA)306::Tn10(TetR))，从而得到丝心蛋白样蛋白质生产菌BLR(DE3)/pET22b-ADF3、BLR(DE3)/pET22b-ADF3RGDS#2及BLR(DE3)/pET22b-ADF3RGDS#3。
＜2＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的表达
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BLR(DE3)/pET22b-ADF3、BLR(DE3)/pET22b-ADF3RGDS#2及BLR(DE3)/pET22b-ADF3RGDS#3用(1)所示的种子培养基在1vvm、37℃、1500rpm、pH6.7的条件下培养至葡萄糖完全耗尽，得到种培养液。然后，将种培养液45mL添加到(2)所示的生产培养基255mL中，在1vvm、37℃、700rpm、pH6.9的条件下实施主培养。培养30分钟后，以2.6mL/h的流速添加(3)所示的饲养培养基，培养至培养液在620nm下的OD值达到50。然后，将培养温度降低到30℃，添加异丙基-β-硫代半乳糖苷1mM来诱导蛋白质表达。在添加IPTG 24小时后结束培养，得到培养液。制备菌体破碎液并供于SDS-PAGE，结果观测到目标尺寸的条带，确认菌体内表达了丝心蛋白样蛋白质。
(1)种子培养基
葡萄糖40g/L、硫酸镁七水合物1.0g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸铁七水合物10mg/L、硫酸锰七水合物10mg/L、异亮氨酸1.0g/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(2)生产培养基
葡萄糖2.5g/L、硫酸镁七水合物2.4g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾9.0g/L、硫酸铁七水合物40mg/L、硫酸锰七水合物40mg/L、氯化钙二水合物40mg/L、异亮氨酸3.0g/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(3)饲养培养基
葡萄糖700g/L、氨苄青霉素100mg/L
＜3＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的纯化
将上述中得到的培养液按照OD值达到30的方式用(1)所示的Lysis缓冲液稀释，进行超声波处理。将处理液离心，仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的3％SDS溶液，用均化器悬浮30分钟。将悬浮液离心，再次仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的(2)所示的可溶化缓冲液，用均化器悬浮3小时。将悬浮液离心，仅回收上清。
将得到的上清与cOmplete His-Tag Purification Resin(Roche)混合并搅拌1小时而使其与蛋白质结合。回收穿透流，使用柱容量的20倍量的(3)所示的洗涤缓冲液洗去杂蛋白，使用柱容量的10倍量的(4)所示的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质。用SDS-PAGE对洗脱级分进行确认，用10K的平膜进行浓缩。
准备100ml将浓缩液按照达到0.04-0.05mg/ml的方式用(2)所示的可溶化缓冲液稀释而成的溶液。用15K的透析膜并将外液设为5L超纯水来实施透析，得到丝心蛋白样蛋白质ADF3、ADF3RGDS#2及ADF3RGDS#3的水溶液。
(1)Lysis缓冲液
30mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH7.5
(2)可溶化缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、pH8.0
(3)洗涤缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑、pH8.0
(4)洗脱缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、500mM咪唑、pH8.0
实施例2：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的制作(2)
＜1＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质表达株的构建
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#53的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#53：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#53用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#53基因的碱基序列示于序列号26，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#53的氨基酸序列示于序列号27。ADF3RGDS#53中除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，在12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)细胞粘附序列“PQVTRGDVFTM”(序列号24)。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#54的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#54：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#54用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#54基因的碱基序列示于序列号28，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#54的氨基酸序列示于序列号29。ADF3RGDS#54中除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，在12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)细胞粘附序列“VTRGDVF”(序列号25)。
用上述pET22b-ADF3RGDS#53及pET22b-ADF3RGDS#54分别转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)ΔrecA株，从而得到丝心蛋白样蛋白质生产菌BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#53及BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#54。BL21(DE3)ΔrecA株是通过利用λRed法使BL21(DE3)株中recA基因缺失而得到的。
＜2＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的表达
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#53及BL21ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#54用(1)所示的种子培养基在1vvm、37℃、1500rpm、pH6.7的条件下培养至葡萄糖完全耗尽，得到种培养液。然后，将种培养液45mL添加到(2)所示的生产培养基255mL中，在1vvm、37℃、700rpm、pH6.9的条件下实施主培养。培养30分钟后，以2.6mL/h的流速添加(3)所示的饲养培养基，培养至培养液在620nm下的OD值达到50。然后，将培养温度降低到30℃，添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM来诱导蛋白质表达。在添加IPTG 24小时后结束培养，得到培养液。制备菌体破碎液并供于SDS-PAGE，结果观测到目标尺寸的条带，确认菌体内表达了丝心蛋白样蛋白质。
(1)种子培养基
葡萄糖40g/L、硫酸镁七水合物1.0g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸铁七水合物10mg/L、硫酸锰七水合物10mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(2)生产培养基
葡萄糖2.5g/L、硫酸镁七水合物2.4g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾5.4g/L、硫酸铁七水合物40mg/L、硫酸锰七水合物40mg/L、氯化钙二水合物40mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(3)饲养培养基
葡萄糖700g/L、氨苄青霉素100mg/L
＜3＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的纯化
将上述中得到的培养液按照OD值达到30的方式用(1)所示的Lysis缓冲液稀释，进行超声波处理。将处理液离心，仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的3％SDS溶液，用均化器悬浮30分钟。将悬浮液离心，再次仅回收沉淀。向沉淀中添加(2)所示的可溶化缓冲液，从而使目标蛋白质浓度达到5mg/ml，用涡旋混合器悬浮。将悬浮液离心，仅回收上清。
对于所得到的上清，用500-1000Da的透析膜并将外液设为100mL的NaOH水溶液(pH10)来实施透析，得到丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#53及ADF3RGDS#54的水溶液。
(1)Lysis缓冲液
30mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH7.5
(2)可溶化缓冲液
50mM NaOH
实施例3：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的制作(3)
＜1＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质表达株的构建
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#60的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#60：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#60用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#60基因的碱基序列示于序列号35，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#60的氨基酸序列示于序列号36。ADF3RGDS#60在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)细胞粘附序列“GRGDNP”(序列号30)。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#65的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#65：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#65用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#65基因的碱基序列示于序列号37，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#65的氨基酸序列示于序列号38。ADF3RGDS#65中除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，12个非富含Ala部位中的7个中的部分序列被置换为细胞粘附序列“GAAGRGDSPAAGY”(序列号31)。换言之，在ADF3RGDS#65中、在比序列号2所示的ADF3蛋白的序列短的非富含Ala部位***有细胞粘附序列。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#68的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#68：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#68用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#68基因的碱基序列示于序列号39，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#68的氨基酸序列示于序列号40。ADF3RGDS#68中除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，在12个非富含Ala部位中的5个中各***有1个(共5个)含有细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)的氨基酸序列“GPGQQGPGQQGPGQQVTGRGDSPAS”(序列号32)，在12个非富含Ala部位中的2个中各***有1个(共2个)细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)。换言之，在ADF3RGDS#68中，对于前者的共5个细胞粘附序列而言，细胞粘附序列被***到比序列号2所示的ADF3蛋白的序列长的非富含Ala部位中。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#72的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#72：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#72用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#72基因的碱基序列示于序列号41，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#72的氨基酸序列示于序列号42。ADF3RGDS#72在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位中各***有1个(共12个)细胞粘附序列“GRGDSP”(序列号22)。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#73的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#73：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#73用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#73基因的碱基序列示于序列号43，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#73的氨基酸序列示于序列号44。ADF3RGDS#73除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，在12个非富含Ala部位中的2个中各***有1个(共2个)细胞粘附序列“GRGDSP”(序列号22)。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#76的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#76：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#76用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#76基因的碱基序列示于序列号45，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#76的氨基酸序列示于序列号46。ADF3RGDS#76除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，在12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)将2个细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)连结而成的氨基酸序列“VTGRGDSPASVTGRGDSPAS”(序列号33)。换言之，ADF3RGDS#76中共***有14个细胞粘附序列。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#77的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#77：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#77用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#77基因的碱基序列示于序列号47，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#77的氨基酸序列示于序列号48。ADF3RGDS#77在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位各***有1个(共12个)细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)。
如下构建了表达编码***肝素结合序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#141的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#141：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#141用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#141基因的碱基序列示于序列号49，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#141的氨基酸序列示于序列号50。ADF3RGDS#141在序列号2所示的ADF3蛋白的12个非富含Ala部位中的7个中各***有1个(共7个)肝素结合序列“GKKQRFRHRNRKG”(序列号34)。该肝素结合序列为在玻连蛋白的肝素结合序列(Wrighton PJ,Klim JR,HernandezBA,Koonce CH,Kamp TJ,Kiessling LL,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 2014 Dec；111(51):18126-18131.,Signals from the surface modulate differentiation of human pluripotent stemcells through glycosaminoglycans and integrins.)的两端添加G而成的氨基酸序列。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#66的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#66：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#66用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#66基因的碱基序列示于序列号51，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#66的氨基酸序列示于序列号52。ADF3RGDS#66除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，12个非富含Ala部位中的5个的部分序列被置换为细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)，10个非富含Ala部位中的2个中各***有1个(共2个)细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)。换言之，在ADF3RGDS#66中，对于前者的共5个细胞粘附序列而言，可看成细胞粘附序列被***到比序列号2所示的ADF3蛋白的序列短的非富含Ala部位。
如下构建了表达编码***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#78的基因的质粒pET22b-ADF3RGDS#78：将pET22b(+)载体(Novagen)用限制酶NdeI和EcoRI切割之后，将全合成的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#78用DNA连接试剂盒(TaKaRa)***，从而构建。将ADF3RGDS#78基因的碱基序列示于序列号53，将该基因所编码的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#78的氨基酸序列示于序列号54。ADF3RGDS#78除去了序列号2所示的ADF3蛋白的HRV3C蛋白酶识别序列，10个非富含Ala部位中的2个中各***有1个(共2个)细胞粘附序列“VTGRGDSPAS”(序列号23)。
用上述pET22b-ADF3RGDS#60、pET22b-ADF3RGDS#65、pET22b-ADF3RGDS#68、pET22b-ADF3RGDS#72、pET22b-ADF3RGDS#73、pET22b-ADF3RGDS#76、pET22b-ADF3RGDS#77、pET22b-ADF3RGDS#141、pET22b-ADF3RGDS#66、pET22b-ADF3RGDS#78分别转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)ΔrecA株，由此得到丝心蛋白样蛋白质生产菌BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#60、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#65、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#68、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#72、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#73、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#76、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#77、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#141、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#66、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#78。
＜2＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的表达
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#60、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#65、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#72、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#73及BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#141用(1)所示的种子培养基在1vvm、37℃、1500rpm、pH6.7的条件下培养至葡萄糖完全耗尽，得到种培养液。然后，将种培养液45mL添加到(2)所示的生产培养基255mL中，在1vvm、37℃、700rpm、pH6.9的条件下实施主培养。培养30分钟后，以2.6mL/h的流速添加(3)所示的饲养培养基，培养至培养液在620nm下的OD值达到50。然后，将培养温度降低到30℃，添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM来诱导蛋白质表达。添加IPTG 24小时后结束培养，得到培养液。制备菌体破碎液并供于SDS-PAGE，结果观测到目标尺寸的条带，确认菌体内表达了丝心蛋白样蛋白质。
(1)种子培养基
葡萄糖40g/L、硫酸镁七水合物1.0g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸铁七水合物10mg/L、硫酸锰七水合物10mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(2)生产培养基
葡萄糖2.5g/L、硫酸镁七水合物2.4g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾5.4g/L、硫酸铁七水合物40mg/L、硫酸锰七水合物40mg/L、氯化钙二水合物40mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(3)饲养培养基
葡萄糖700g/L、氨苄青霉素100mg/L
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#68、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#76、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#77、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#66及BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#78用(1)所示的种子培养基在1vvm、37℃、1500rpm、pH6.7的条件下培养至葡萄糖完全耗尽，得到种培养液。然后，将种培养液45mL添加到(2)所示的生产培养基255mL中，在1vvm、37℃、700rpm、pH6.9的条件下实施主培养。培养30分钟后，以2.6mL/h的流速添加(3)所示的饲养培养基，培养至培养液在620nm下的OD值达到50。然后，将培养温度降低到30℃，添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM来诱导蛋白质表达。添加IPTG 24小时后结束培养，得到培养液。然后制备菌体破碎液并供于SDS-PAGE，从而确认目标丝心蛋白样蛋白质的表达。
(1)种子培养基
葡萄糖40g/L、硫酸镁七水合物1.0g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸铁七水合物10mg/L、硫酸锰七水合物10mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(2)生产培养基
葡萄糖2.5g/L、硫酸镁七水合物2.4g/L、玉米浆1.0g/L(以氮重量换算)、磷酸二氢钾5.4g/L、硫酸铁七水合物40mg/L、硫酸锰七水合物40mg/L、氯化钙二水合物40mg/L、GD-113(消泡剂)0.1ml/L、氨苄青霉素100mg/L
(3)饲养培养基
葡萄糖700g/L、氨苄青霉素100mg/L
＜3＞***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质的纯化
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#60、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#65、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#72及BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#141的培养液按照OD值达到30的方式用(1)所示的Lysis缓冲液稀释，进行超声波处理。将处理液离心，仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的3％SDS溶液，用均化器悬浮5分钟以上。将悬浮液离心，再次仅回收沉淀。向沉淀中添加(2)所示的可溶化缓冲液使目标蛋白质浓度达到1-5mg/ml，用涡旋混合器悬浮。将悬浮液离心，仅回收上清。
对于得到的上清1ml，用500-1000Da的透析膜并将外液设为100mL的NaOH水溶液(pH10)来实施透析，得到丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#60、ADF3RGDS#65、ADF3RGDS#72及ADF3RGDS#141的水溶液。
(1)Lysis缓冲液
30mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH7.5
(2)可溶化缓冲液
50mM NaOH
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#73的培养液按照OD值达到30的方式用(1)所示的Lysis缓冲液稀释，进行超声波处理。将处理液离心，仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的3％SDS溶液，用均化器悬浮5分钟以上。将悬浮液离心，再次仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的(2)所示的可溶化缓冲液，用均化器悬浮1小时。将悬浮液离心，仅回收上清。
将得到的上清与cOmplete His-Tag Purification Resin(Roche)混合并搅拌1小时30分钟，使其与蛋白质结合。回收穿透流，使用柱容量的20倍量的(3)所示的洗涤缓冲液洗去杂蛋白，使用柱容量的10倍量的(4)所示的洗脱缓冲液洗脱目标丝心蛋白样蛋白质。用SDS-PAGE对洗脱级分进行确认，用30KDa的膜进行浓缩。
用30KDa的膜，以(5)所示的溶液对浓缩液进行缓冲液交换，从而调整为0.1mg/ml的液量。用500-1000Da的透析膜并将外液设为100mL的NaOH水溶液(pH10)，对缓冲液交换后的溶液1ml实施透析，得到丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#73的水溶液。
(1)Lysis缓冲液
30mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH7.5
(2)可溶化缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、pH8.0
(3)洗涤缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑、pH8.0
(4)洗脱缓冲液
8M尿素、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、500mM咪唑、pH8.0
(5)缓冲液交换液
50mM NaOH
将上述中得到的丝心蛋白样蛋白质表达株BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#68、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#76、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#77、BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#66及BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-ADF3RGDS#78的培养液按照OD值达到30的方式用(1)所示的Lysis缓冲液稀释，进行超声波处理。将处理液离心，仅回收沉淀。向沉淀中添加与离心前的处理液等量的3％SDS溶液，用均化器悬浮5分钟以上。将悬浮液离心，再次仅回收沉淀。向沉淀中添加(2)所示的可溶化缓冲液，使目标蛋白质浓度达到1-5mg/ml，用涡旋混合器进行悬浮。将悬浮液离心，仅回收上清。
对于所得到的上清1ml，用500-1000Da的透析膜并将外液设为100mL的NaOH水溶液(pH10)来实施透析，得到丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#68、ADF3RGDS#76ADF3RGDS#77、ADF3RGDS#66及ADF3RGDS#78的水溶液。
(1)Lysis缓冲液
30mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH7.5
(2)可溶化缓冲液
50mM NaOH
实施例4：丝心蛋白样蛋白质的细胞支架功能的评价
＜1＞对细胞培养板的包被
＜1-1＞对细胞培养板的包被(1)
将上述实施例1＜3＞及实施例3＜3＞中得到的透析后的丝心蛋白样蛋白质的水溶液以1～4ml/孔加入到6孔细胞培养板(康宁公司Falcon培养板)，在室温下放置一昼夜或两昼夜使水挥发。将细胞培养板在70％乙醇水溶液中浸渍后，用磷酸缓冲生理盐水(Nacalai tesque公司)洗涤。
＜1-2＞对细胞培养板的包被(2)
将上述实施例2＜3＞及实施例3＜3＞中得到的透析后的丝心蛋白样蛋白质的水溶液以1～4ml/孔加入到6孔细胞培养板(康宁公司Falcon培养板)，在4℃静置一昼夜后，除去水溶液。将细胞培养板在70％乙醇水溶液中浸渍后，用磷酸缓冲生理盐水(Nacalaitesque公司)洗涤。
＜2＞包被的确认
使用岛津制作所公司制IR Prestige-21以及作为ATR测定仪器的Smiths公司制Dura Sampl IR II，进行包被表面的FT-IR全反射测定(FT-IR-ATR)。在得到的谱图中，来自蛋白质主链酰胺基(α酰胺键)的峰出现在1620～1700cm-1的范围，由此确认丝心蛋白样蛋白质已包被在细胞培养板上。需要说明的是，可认为，在用上述＜1-1＞的方法进行包被时，丝心蛋白样蛋白质的包被量为10μg/cm2左右。
＜3＞用iPS细胞增殖***的评价
对包被有丝心蛋白样蛋白质的表面处的人工多能干细胞(iPS细胞)的粘附增殖效果进行了评价。iPS细胞使用由iPS PORTAL,Inc.购入的201B7株。细胞培养使用在作为iPS细胞用培养基的Essential 8培养基(Invitrogen公司制)中添加有人血清白蛋白(最终浓度2.6mg/ml、Sigma-Aldrich公司制)的培养基或StemFit(R)培养基(味之素公司制)在5％CO2/37℃的条件下进行。将丝心蛋白样蛋白质包被在细胞培养板上，立即或在4℃下保存6天后用于培养，从而研究其效果。对每1孔单细胞接种2万～10万个活细胞。接种时，向使用的培养基中添加Y-27632(最终浓度10μM、Nacalai tesque公司制)，第二天以后用不添加Y-27632的培养基培养。每1～3天进行培养基更换，培养6～7天后，用细胞数测定装置(Beckman Coultar Inc.ViCell)测定通过细胞解离酶(Life Technology Inc.TrypLESelect)处理而剥离的细胞的个数。需要说明的是，作为比较对照，将作为人工的细胞粘附性肽的Pronectin(三洋化成公司制)按照制品说明中的方法包被在细胞培养板上，用同样的培养方法进行评价。另外，将包被有基底膜基质或其模拟物(mimic)的各种细胞培养容器(康宁公司的BioCoat Matrigel、该公司的BioCoat Fibronectin及该公司的PureCoatFibronectin peptide)也作为比较对照，通过同样的培养方法进行评价。这些中，对于康宁公司的BioCoat Matrigel，基于制品说明的内容在接种48小时后进行首次培养基更换(从接种时的含Y-27632的培养基切换为不含Y-27632的培养基)。
将结果示于图1～图7及表1。
如图1所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#2及ADF3RGDS#3均用上述＜1-1＞的方法进行包被并接种10万个活细胞，结果6天后活细胞数超过了作为多能干细胞用培养容器销售的BioCoat Matrigel，可知具有良好的iPS细胞支架功能。ADF3RGDS#2及ADF3RGDS#3均***有纤连蛋白的细胞粘附序列，而包被有纤连蛋白本身的BioCoat Fibronectin以及包被有纤连蛋白mimic肽的PureCoat Fibronectin peptide均在接种6天后完全不存在活细胞数。
另外，通过同样的方法对未***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3进行了评价，所接种的细胞几乎不粘附，接种6天后完全不存在活细胞数(未图示)。这表明，通过***细胞粘附序列而表现出iPS细胞支架功能。
另外，通过同样的方法对***有与ADF3RGDS#3相同的细胞粘附序列的蚕丝心蛋白即Pronectin(三洋化成工业)进行了评价，结果，与ADF3同样地在接种6天后完全不存在活细胞数(未图示)。这表明，本发明是难以预期的。
如图2所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#2及ADF3RGDS#3均用上述＜1-1＞的方法包被在细胞培养板上、并在4℃下保存6天后供于细胞培养，接种10万个活细胞，6天后的活细胞数与在包被后立即供于细胞培养时为同等。关于以iMatrix(NIPPI公司制)为首的多能干细胞的无饲养细胞培养中所使用的基底膜基质(蛋白质)，在其制品说明中建议：包被在细胞培养板上后立即供于细胞培养。另一方面，即使包被在细胞培养板也不要求立即供于细胞培养的本发明品能够简便地进行多能干细胞的培养。
如图3所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#2(图中的#2)及ADF3RGDS#3(图中的#3)均用上述＜1-1＞的方法进行包被并接种10万个活细胞，结果，除了StemFit(R)培养基(味之素公司制)及在Essential 8培养基(Invitrogen公司制)中添加有人血清白蛋白的培养基(图中的E8+HSA)以外，在用Essential 8培养基单独(图中的E8)、mTeSR1培养基(Stem Cell Technologies公司制)及pluriSTEM培养基(merckmillipore公司制)进行细胞培养时也都显示良好的iPS细胞支架功能。这表明，本发明品不限于在特定培养基中使用，通用性高。
如图4所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#2及ADF3RGDS#3在均用上述＜1-1＞的方法进行包被并接种10万个活细胞的条件下，通过中途传代2次能够进行3周培养。期间，活细胞增加率不变，表明能够进行稳定的培养。在进行3周的培养后，用碱性磷酸酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司：86-R)进行染色，结果确认细胞的未分化状态得到维持。这表明，通过利用本发明品，在长期培养中能够以维持iPS细胞的未分化状态的状态进行增殖。
如图5所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#53及ADF3RGDS#54均用上述＜1-2＞的方法包被在细胞培养板上并在37℃保存6天后供于细胞培养，接种2万个活细胞，6日后的活细胞数与在包被后立即供于细胞培养的情况时为同等。即，表明能够用与上述＜1-1＞的方法相比时间短且污染风险小的方法进行包被、本发明品能够在常温下保存及通过利用本发明品能够进行多能干细胞的培养而无需大量的细胞。这表明，本发明品作为iPS细胞培养用支架材料不仅功能优异，而且在操作性、稳定性等多个方面优异。
如图6所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#53及ADF3RGDS#54在均用上述＜1-1＞的方法进行包被且接种2万个或2.5万个活细胞的条件下，通过中途传代2次能够进行3周培养。期间，活细胞增加率不变，还表明不需要大量的细胞也能够进行稳定的培养。在进行3周的培养后，用碱性磷酸酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司：86-R)进行染色，结果确认，细胞的未分化状态得到维持。这表明，通过利用本发明品，在长期培养中能够以维持iPS细胞的未分化状态的状态进行增殖。
如表1所示，***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#60、ADF3RGDS#65、ADF3RGDS#66、ADF3RGDS#68、ADF3RGDS#72、ADF3RGDS#73、ADF3RGDS#76、ADF3RGDS#77及ADF3RGDS#78均用上述＜1-1＞或＜1-2＞的方法进行包被并接种1.3万个、2万个、5万个或10万个活细胞，结果6天后或7天后的活细胞增加率与ADF3RGDS#2或ADF3RGDS#3为同等或为同等以上。其中，ADF3RGDS#76的活细胞增加率高，接种7天后进行传代并进一步培养1周，也显示40～77倍的活细胞增加率。
[表1]
如图7所示，在***有细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#54中混合***有肝素结合序列的丝心蛋白样蛋白质即ADF3RGDS#141，用上述＜1-2＞的方法包被在细胞培养板上并接种1.3万个或2万个活细胞，结果，与单独包被有ADF3RGDS#54并供于细胞培养时相比，6天后的活细胞数增加了31％或24％。单独包被有ADF3RGDS#141并供于细胞培养时，未确认到细胞的粘附增殖。这表明，通过将本发明品与除本发明品以外的蛋白质组合，本发明品的iPS细胞支架功能增强。
＜序列表说明＞
序列号1：丝心蛋白样蛋白质基因ADF3的碱基序列
序列号2：丝心蛋白样蛋白质ADF3的氨基酸序列
序列号3：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#2的碱基序列
序列号4：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#2的氨基酸序列
序列号5：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#3的碱基序列
序列号6：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#3的氨基酸序列
序列号7～10：满足富含Ala部位的条件的部分的氨基酸序列
序列号11～21：满足非富含Ala部位的条件的部分中所含的基序的氨基酸序列
序列号22～25：含有RGD的细胞粘附序列
序列号26：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#53的碱基序列
序列号27：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#53的氨基酸序列
序列号28：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#54的碱基序列
序列号29：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#54的氨基酸序列
序列号30、31：含有RGD的细胞粘附序列
序列号32：包含含有RGD的细胞粘附序列的氨基酸序列
序列号33：2个含有RGD的细胞粘附序列连结而成的氨基酸序列
序列号34：肝素结合序列
序列号35：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#60的碱基序列
序列号36：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#60的氨基酸序列
序列号37：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#65的碱基序列
序列号38：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#65的氨基酸序列
序列号39：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#68的碱基序列
序列号40：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#68的氨基酸序列
序列号41：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#72的碱基序列
序列号42：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#72的氨基酸序列
序列号43：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#73的碱基序列
序列号44：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#73的氨基酸序列
序列号45：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#76的碱基序列
序列号46：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#76的氨基酸序列
序列号47：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#77的碱基序列
序列号48：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#77的氨基酸序列
序列号49：***肝素结合序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#141的碱基序列
序列号50：***肝素结合序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#141的氨基酸序列
序列号51：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#66的碱基序列
序列号52：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#66的氨基酸序列
序列号53：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质基因ADF3RGDS#78的碱基序列
序列号54：***细胞粘附序列的丝心蛋白样蛋白质ADF3RGDS#78的氨基酸序列
产业上的可利用性
根据本发明，能够高效地培养干细胞等细胞。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 丝心蛋白样蛋白质改造体及细胞培养方法
<130> D860-17052
<150> JP2016-071530
<151> 2016-03-31
<150> JP2016-207359
<151> 2016-10-21
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1998
<212> DNA
<213> 十字园蛛
<400> 1
gcgcatatgc atcatcatca ccatcaccac catcatcata gcagcggtag cagcctggaa 60
gttctgtttc agggtccggc acgtgcaggt agcggtcagc agggtccggg tcagcaaggt 120
cctggccagc agggaccagg tcaacagggt ccgtatggtc cgggtgcaag cgcagctgca 180
gcagcagccg gtggttatgg tcctggttca ggtcagcagg gaccgtccca gcagggtcct 240
ggacaacaag gaccgggtgg tcagggtcct tatggccctg gtgccagtgc cgcagcagct 300
gccgcaggcg gttatggtcc aggtagtggc caacagggtc ctggtggtca gggaccatac 360
ggtccgggta gcagtgcagc agccgcagcg gctgggggta atggtccggg aagtggacag 420
cagggtgcag ggcagcaagg cccaggacag caaggtccgg gtgcctcagc agcggcagcc 480
gcagctggcg gatatggacc gggttcaggc caacaaggtc cgggacaaca gggtccaggc 540
ggacaaggtc cgtatggccc aggcgcatca gccgctgctg ccgcagcggg tggctatgga 600
ccaggcagtg gtcaaggtcc aggtcaacaa ggccctggtg gccaaggtcc gtacggtcct 660
ggtgcgtcag ccgcagcagc agctgcgggt ggatacggtc caggctcagg ccagcaaggc 720
cctgggcaac aagggcctgg tcaacaggga cctgggggac aaggccctta cggaccgggt 780
gcatctgcgg cagcggctgc agcgggtggt tacggaccgg gatatggcca gcaaggacct 840
ggtcagcaag gtccaggcgg tcagggaccg tatggaccgg gtgcgtcagc agcaagcgca 900
gccagtggtg gttatggccc aggatctggg cagcagggtc caggccaaca gggacctggc 960
ggacagggtc cttatgggcc aggggcatct gcagcggctg ctgctgccgg tggatatggg 1020
ccaggtagcg gacaacaagg gccaggccag cagggtcctg ggcagcaggg tcctggtcag 1080
caaggcccag gtggacaagg cccttatggt ccaggtgcga gtgcagccgc agcggcagcg 1140
ggtggatatg gccctggaag cggtcagcaa ggaccgggac aacaaggccc aggtcagcaa 1200
ggaccagggc aacagggacc gggacagcag ggacctggcc aacaaggccc tggacagcag 1260
ggaccgggac agcaagggcc aggacaacag ggtccaggtg gccagggtgc ctatggtcct 1320
ggcgcttcag cagcagcggg tgcagcaggg ggatatggtc ctggctctgg gcaacaaggc 1380
ccaggccaac aaggtccagg ccagcaaggg ccaggacagc agggacctgg tcaacaggga 1440
ccgggtcaac aaggtccggg acagcaaggg cctgggcagc aaggacctta tggacctggc 1500
gcaagcgctg cagctgccgc agcaggcggt tacggtccgg gatccggtca acaaggacct 1560
ggccaacagg gtcctggcca gcaaggtccg ggtggccaag gaccgtatgg gccaggtgca 1620
gccagcgcag ccgttagcgt tggtggctat ggtccgcaga gcagcagcgt tccggttgcc 1680
agcgcagttg caagccgtct gagcagtccg gcagcaagca gtcgtgttag cagcgcagtt 1740
agcagcctgg ttagcagcgg tccgaccaaa catgcagcac tgagcaatac cattagcagc 1800
gttgttagcc aggttagcgc aagcaatccg ggtctgagcg gttgtgatgt tctggttcag 1860
gcactgctgg aagttgttag cgcactggtg agcattctgg gtagcagcag cattggtcag 1920
attaactatg gtgccagcgc acagtatacc cagatggttg gtcagagcgt tgcacaggca 1980
ctggcataag aattcgcg 1998
<210> 2
<211> 660
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 2
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln
20 25 30
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
35 40 45
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr
50 55 60
Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln
65 70 75 80
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
100 105 110
Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln
195 200 205
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
225 230 235 240
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
245 250 255
Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
260 265 270
Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
275 280 285
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly
290 295 300
Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln
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Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly
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Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
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Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
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Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly
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Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly
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Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser
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660
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cccaggcgga cagggaccat acgggcctgg tgcgtcagcc gcagccgctg ctgccggtgg 900
ttacggaccg ggttatggtc aacaggtgac cggacgcggt gatagccctg ccagcggtcc 960
aggccaacaa gggcctgggg gtcaaggccc ttacggtcct ggtgcatcag cggcaagcgc 1020
agcaagtggt ggctatggtc cgggatctgg acagcaggtt acgggtcggg gagatagccc 1080
tgcgtcaggt ccaggacagc aaggcccagg tggccaaggc ccttatggac cgggtgcgtc 1140
tgcagccgca gctgcagcgg gtggatacgg tccgggaagc ggacaacagg gtcctgggca 1200
acagggtcca ggccagcagg gaccgggaca gcagggacca ggtggccagg gtccttacgg 1260
tccaggcgca tctgctgccg ctgcagccgc agggggttac ggtccgggat caggccagca 1320
agggccaggc caacaaggtc caggacaaca gggtccgggt caacaagtta ccggtcgcgg 1380
tgactcacca gccagtggcc ctggacagca agggcctggt caacagggac ctggacagca 1440
gggtcctggt cagcagggtc cgggacaaca gggacctggc ggacagggtg cgtatgggcc 1500
aggcgctagt gcagcagcgg gtgcagctgg cggttacggt cctggctctg gccaacaagg 1560
acctggtcag caaggcccag ggcagcaggg tccagggcag caagttacgg gtcgtggcga 1620
cagcccagca agtggccctg gccaacaggg tcctggccaa caaggtcctg gacagcaagg 1680
accgggtcag cagggtcctt acggaccggg tgcttcggca gcagctgcag cagccggtgg 1740
ctacggacct ggcagtggac agcaaggtcc agggcaacaa ggccctggcc agcaaggtcc 1800
aggtgggcag ggaccgtacg gacctggtgc agcctcagca gcagttagcg ttggtggtta 1860
tggaccgcag agcagcagcg ttccggttgc cagcgcagtt gcaagccgtc tgagcagtcc 1920
ggcagcaagc agccgtgtta gcagcgcagt tagcagcctg gtgagcagcg gtccgaccaa 1980
acatgcagca ctgagcaata ccattagcag cgttgttagc caggttagcg caagcaatcc 2040
gggtctgagc ggttgtgatg ttctggttca ggcactgctg gaagttgtta gcgcactggt 2100
tagcattctg ggtagcagca gcattggtca gattaactat ggtgccagcg cacagtatac 2160
ccagatggtt ggtcagagcg ttgcacaggc actggcataa tcccacagcc gccagttccg 2220
ctggcggcat tttaactttc tttaatgaag ccggaaaaat cctaaattca tttaatattt 2280
atctttttac cgtttcgctt accccggtcg aacgtcaact tacgtcattt ttccgcccaa 2340
cagtaatata atcaaacaaa ttaatcccgc aacataacac cagtaaaatc aataattttc 2400
tctaagtcac ttattcctca ggtaattgtt aatatatcca gaatgttcct caaaatatat 2460
tttccctcta tcttctcgtt gcgcttaatt tgactaattc tcattagcga ctaattttaa 2520
tgagtgtcga cgaattcgcg c 2541
<210> 6
<211> 730
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 6
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln
20 25 30
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
35 40 45
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr
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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln
65 70 75 80
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Val Thr Gly
100 105 110
Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr
115 120 125
Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro
130 135 140
Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
165 170 175
Ser Gly Gln Gln Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro
180 185 190
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
195 200 205
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Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
275 280 285
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly
290 295 300
Gln Gln Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln
305 310 315 320
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
325 330 335
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Val Thr
340 345 350
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
355 360 365
Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
385 390 395 400
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
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Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
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Gly Pro Gly Gln Gln Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly
450 455 460
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
465 470 475 480
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr
485 490 495
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro
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Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
580 585 590
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
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Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Gly Gly Tyr Gly Pro Gln Ser Ser Ser
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Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro
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Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala Leu Ala
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 7
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 8
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 9
Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 10
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 11
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 12
Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 13
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly
1 5 10
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<213> 十字园蛛
<400> 14
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly
1 5 10
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Pro Gly Gln Gln Gly
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Ser Gly Gln Gln Gly
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Pro Ser Gln Gln Gly
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<212> PRT
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Pro Gly Gly Gln Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 20
Pro Tyr Gly Pro
1
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 21
Ala Tyr Gly Pro
1
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
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Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
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Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
1 5
<210> 26
<211> 2190
<212> DNA
<213> 十字园蛛
<400> 26
atgcatcatc accaccatca ccatcatcat cacagcagcg gtagcagcgc acgtgcaggt 60
agcggtcagc agggtccggg tcagcaaggc cctggtcaac agggacctgg ccagcaggga 120
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tacggtcctg gtagtagcgc tgctgccgca gcagcgggtg gtaacggtcc gggtagcgga 420
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tacggaccag gtgccagtgc ggctgctgca gccgccggtg gctacggacc tggaagcggc 780
caacaaggcc caggacagca ggggcctgga caacagggtc ccggtggaca gggcccatac 840
ggcccgggtg cgagcgcagc ggccgctgcc gctggcggtt acggacccgg ttatggccag 900
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ggtcctggcc aacaagggcc tggacaacaa ccgcaggtta cacgcggtga cgtattcaca 1620
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ggatctgggc aacaaggacc cggccaacag gggccaggcc agcaaggacc tggaggacaa 1800
ggtccttatg gaccgggtgc agcaagcgca gcagttagcg ttggtggcta tggtccgcag 1860
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Gln Val
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Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser
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Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr
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Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala
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<212> DNA
<213> 十字园蛛
<400> 28
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gcgggtggtt atggacccgg aagcgggcaa cagggccccg gacaacaggg tcccggccag 1500
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gcataa 2106
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<213> 十字园蛛
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Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
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Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
165 170 175
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
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Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly
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Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
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Arg Gly Asp Val Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
485 490 495
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565 570 575
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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20
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<212> PRT
<213> 智人
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<210> 35
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<212> DNA
<213> 十字园蛛
<400> 35
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<213> 十字园蛛
<400> 36
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Gly Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Gly Gly Tyr Gly Pro
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<213> 十字园蛛
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<213> 十字园蛛
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<400> 40
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
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ccaggccaac aagggcctta tggtccaggc gctagcgcag cagcggcagc tgctggcggt 1920
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<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 46
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ggccagcaag gtccgagcca acagggtcca ggacaacaag gaccgggtgg tcagggtcct 240
tatggccctg gtgcatcagc tgcggcagca gcggcagtta ccggtcgtgg tgatagtccg 300
gcaagccagg gtcctggtgg ccaaggtccg tacggtcctg gtagttctgc tgccgctgcc 360
gcagcaggcg gtaacggtcc aggcagtgga cagcagggtg ctgggcaaca gggcccaggt 420
cagcaaggtc caggtgcatc agcagcagcg gctgcagccg tgaccggtcg cggagattca 480
ccggcaagcg gaccggggca acaaggtcct ggcggacaag gcccttatgg tccaggagcg 540
agcgctgctg ctgcagctgc ggtgacaggt cgtggcgact ctccggcatc aggacccggc 600
caacaagggc ccggaggtca aggaccttac ggaccaggtg ccagtgccgc tgcagcggcg 660
gcaggcggtt atggaccggg aagcgggcag caagggccag ggcagcaggg gcctggacaa 720
cagggtcccg gtggacaggg cccatacgga cctggtgcaa gcgcagccgc cgcagcagca 780
gtaacaggcc gtggcgatag ccctgcaagc ggtcctggac agcaagggcc tggagggcag 840
ggtccatacg gtccgggagc atcagccgca tctgcagcaa gcgttacagg acgcggtgat 900
tctccagcca gcgggccagg tcaacaaggc ccaggcggac agggtccgta cggcccaggc 960
gctagtgcag ccgctgctgc cgcaggagga tacggaccgg gtagtggtca gcaaggaccc 1020
ggacagcaag gtccgggaca gcagggaccg ggccaacaag gaccaggggg ccagggaccc 1080
tacgggccag gagcttccgc ggctgccgcg gcagccggag gctatggccc aggtagtggc 1140
caacaaggtc caggccagca aggccccggg caacaagggc cgggtcaaca ggttacaggc 1200
cgtggtgaca gtcctgcctc aggtcctggg cagcagggtc ccggccagca ggggccagga 1260
cagcaaggtc ctggccaaca aggcccagga cagcagggtc cgggtggcca gggtgcttat 1320
ggtccaggcg cttctgcagc agccggtgct gcgggtggtt acggtcccgg tagcggacaa 1380
caggggccag gccaacaggg acccgggcag caaggacctg gccagcaagt gaccggtcgc 1440
ggtgatagcc ctgcatcagg tccagggcaa cagggacctg gtcaacaagg gcctgggcaa 1500
caaggaccag gccaacaagg tccgtatggt ccaggtgcct ccgcagctgc agcagctgct 1560
ggcggatacg gtccaggatc aggtcagcag ggaccagggc aacagggtcc ggggcagcag 1620
ggtcctggtg gtcagggacc gtatggacct ggcgcagcaa gcgcagcagt tagcgttggt 1680
ggctatggac cgcagagcag cagtgttccg gttgccagcg cagttgcaag ccgtctgagc 1740
agtccggcag caagcagtcg tgttagcagt gcagttagca gcctggttag cagcggtccg 1800
accaaacatg cagcactgag caataccatt agcagcgttg ttagccaggt tagcgcaagc 1860
aatccgggtc tgagcggttg tgatgttctg gtgcaggcac tgctggaagt tgttagcgca 1920
ctggtgagca ttctgggtag cagcagcatt ggtcagatta actatggtgc gagcgcacag 1980
tatacccaga tggttggtca gagcgttgca caggcactgg cataa 2025
<210> 52
<211> 674
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 52
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
20 25 30
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
50 55 60
Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly Arg
85 90 95
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
100 105 110
Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser
145 150 155 160
Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr
165 170 175
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly Arg Gly
180 185 190
Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly
195 200 205
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr
210 215 220
Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
225 230 235 240
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro
260 265 270
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
275 280 285
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
290 295 300
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
305 310 315 320
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly
325 330 335
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
340 345 350
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
370 375 380
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Val Thr Gly
385 390 395 400
Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
405 410 415
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
435 440 445
Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
450 455 460
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Val Thr Gly Arg
465 470 475 480
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
485 490 495
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
500 505 510
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly
515 520 525
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly
530 535 540
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Gly
545 550 555 560
Gly Tyr Gly Pro Gln Ser Ser Ser Val Pro Val Ala Ser Ala Val Ala
565 570 575
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
580 585 590
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Lys His Ala Ala Leu Ser Asn
595 600 605
Thr Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
610 615 620
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
625 630 635 640
Leu Val Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
645 650 655
Ala Ser Ala Gln Tyr Thr Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
660 665 670
Leu Ala
<210> 53
<211> 2019
<212> DNA
<213> 十字园蛛
<400> 53
atgcatcatc accaccatca ccatcatcat cacagcagcg gtagcagcgc acgtgcaggt 60
agcggtcagc agggtccggg tcagcaaggc cctggtcaac agggacctgg ccagcaggga 120
ccgtatggtc cgggtgcaag tgcagcagca gccgcagccg gtggttatgg tcctggttca 180
ggccagcaag gtccgagcca acagggtcca ggacaacaag gaccgggtgg tcagggtcct 240
tatggccctg gtgcatcagc tgcggcagcg gcagcaggcg gatatggacc gggttctggg 300
caacaaggtc ctggcggtca aggcccttac ggtccgggta gtagcgctgc tgccgcagca 360
gcgggtggta atggcccagg cagtggacag cagggtgctg gacaacaggg cccaggtcag 420
caaggtccag gtgcatcagc cgctgctgct gcagccggtg gctacggacc aggttctggt 480
cagcaaggac cgggacagca ggggccaggt ggccaaggtc cgtatggacc aggagccagt 540
gctgctgcgg ctgccgctgg cggttacggt ccaggatcag gtcaaggacc cggccaacaa 600
ggccccggtg gacaaggacc atacggtcct ggtgcctccg cagccgcggc tgcagcggga 660
ggatatgggc ctggaagcgg gcagcaggga cccggacaac agggtcccgg gcaacagggg 720
cctggcggac agggtcccta cggacctggc gctagtgcag cggctgcggc cgctggaggc 780
tatggacctg gctacggtca acaagggcca gggcagcagg gtcctggagg ccagggacct 840
tacggcccag gcgcaagcgc tgcaagcgca gcatcaggtg gttacggccc tgggagcgga 900
cagcaaggcc cagggcaaca aggcccaggg gggcaagggc cttatggtcc cggagcgagc 960
gcagcggcgg cagctgccgg aggttacgga ccgggaagtg gtcaacaagg tcccggacag 1020
caaggtcccg gccagcaggg accgggtcaa caaggtccag gcggacaggg accgtatggg 1080
cctggcgcat cagcagctgc cgctgcggct ggcggatatg gccctgggag tggccaacaa 1140
gggcctggcc aacaaggtcc gggtcagcag ggaccagggc agcaggttac cggtcgtggt 1200
gatagtccgg caagcgggcc aggccaacag ggccctggac agcaggggcc tggacagcaa 1260
ggtccgggac aacaagggcc tggtcagcaa gggcctggtg gtcagggtgc ctacggtccg 1320
ggtgcttcag cagctgcagg ggctgccggt ggatatggcc caggctcagg tcaacagggt 1380
cccggtcagc agggtccggg acaacaggga ccaggccaac aagtgacagg tcgcggtgat 1440
tcaccggcat ctggcccagg acagcaagga cctggtcagc agggtccagg ccaacaaggt 1500
cctggccagc agggtcctta tggacccgga gcctcagcag ctgcagcagc cgcaggcggc 1560
tatggtcctg gtagtgggca gcaaggacca ggccagcaag gaccaggaca acagggaccg 1620
ggaggccaag gaccgtacgg acccggtgca gcaagcgcgg cagttagcgt tggtggatac 1680
ggtccgcaga gcagcagcgt tccggttgcc agcgcagttg caagccgtct gagcagtccg 1740
gcagcaagca gtcgtgttag cagtgcagtt agcagcctgg ttagctcagg tccgaccaaa 1800
catgcagcac tgagcaatac cattagcagc gttgtgagcc aggttagcgc aagcaatccg 1860
ggtctgagcg gttgtgatgt tctggtgcag gcactgctgg aagttgttag cgcactggtg 1920
agcattctgg gtagcagcag cattggtcag attaactatg gtgcgagcgc acagtatacc 1980
cagatggttg gtcagagcgt tgcacaggca ctggcataa 2019
<210> 54
<211> 672
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 54
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
20 25 30
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
50 55 60
Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly
85 90 95
Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
100 105 110
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser
115 120 125
Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
130 135 140
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
165 170 175
Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
180 185 190
Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr
195 200 205
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro
210 215 220
Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
260 265 270
Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
275 280 285
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
290 295 300
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln
325 330 335
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
340 345 350
Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
370 375 380
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Val Thr Gly Arg Gly
385 390 395 400
Asp Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
405 410 415
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala
435 440 445
Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
450 455 460
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Val Thr Gly Arg Gly Asp
465 470 475 480
Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
485 490 495
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln
515 520 525
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly
530 535 540
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Gly Gly Tyr
545 550 555 560
Gly Pro Gln Ser Ser Ser Val Pro Val Ala Ser Ala Val Ala Ser Arg
565 570 575
Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser
580 585 590
Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Lys His Ala Ala Leu Ser Asn Thr Ile
595 600 605
Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu Ser Gly
610 615 620
Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala Leu Val
625 630 635 640
Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly Ala Ser
645 650 655
Ala Gln Tyr Thr Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala Leu Ala
660 665 670

Claims (42)

1.一种蛋白质，其为含有重复结构和细胞粘附序列的蛋白质，
所述重复结构由重复单元的3次～15次重复构成，
各重复单元由富含Ala部位和非富含Ala部位连结而成，
各富含Ala部位由8个残基～54个残基的氨基酸序列构成，
各富含Ala部位中的Ala残基的比率为30％以上，
各富含Ala部位在该部位中的任一连续的4个氨基酸残基中也含有至少1个Ala残基，
各非富含Ala部位由4个残基以上的氨基酸序列构成，
各非富含Ala部位中的Ala残基的比率为20％以下，
所述细胞粘附序列包含在选自构成所述重复结构的重复单元中的一个或一个以上的重复单元中，
各细胞粘附序列由含有Arg-Gly-Asp的3个残基～18个残基的氨基酸序列构成。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，所述细胞粘附序列包含在选自构成所述重复结构的重复单元中的两个或两个以上的重复单元中。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，所述蛋白质中所含的所述细胞粘附序列的总数为1个～50个。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其中，各细胞粘附序列被***到非富含Ala部位中或者富含Ala部位与非富含Ala部位的连结部。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，各细胞粘附序列由下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列构成：
(a)序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列；
(b)在序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列中，在除Arg-Gly-Asp以外的位置含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号22、23、24、25、30或31所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性且Arg-Gly-Asp保守的氨基酸序列。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位由8个残基～15个残基的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位由9个残基的氨基酸序列构成。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位分别含有1个以上的Gly残基及Ser残基。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位中的Ala残基的比率为50％以上。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位中的Ala残基、Gly残基及Ser残基的比率合计为90％以上。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的蛋白质，其中，各富含Ala部位由下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列构成：
(a)序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列；
(b)在序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列中含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号7、8、9或10所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的蛋白质，其中，各非富含Ala部位由15个残基～100个残基的氨基酸序列构成。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的蛋白质，其中，各非富含Ala部位中的Ala残基的比率为5％以下。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的蛋白质，其中，各非富含Ala部位中的Gly残基、Ser残基、Gln残基、Pro残基、Tyr残基的比率合计为90％以上。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的蛋白质，其中，
各非富含Ala部位含有选自下述(a)、(b)及(c)中记载的氨基酸序列中的1种或1种以上的氨基酸序列：
(a)序列号11～21所示的氨基酸序列；
(b)在序列号11～21所示的氨基酸序列中含有1～3个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号11～21所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的蛋白质，其中，
各非富含Ala部位含有下述(a)、(b)或(c)中记载的氨基酸序列：
(a)序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列；
(b)在序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列中含有1～10个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加的氨基酸序列；
(c)相对于序列号2的氨基酸编号62～91、101～120、130～151、161～185、195～218、228～257、267～291、301～325、335～369、379～438、448～497或507～536所示的氨基酸序列或它们的部分序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
17.一种组合物，其含有权利要求1～16中任一项所述的蛋白质。
18.根据权利要求17所述的组合物，其为细胞支架材料。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述细胞支架材料用于干细胞的培养。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
21.根据权利要求17所述的组合物，其为细胞培养容器的包被剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述细胞培养容器用于干细胞的培养。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
24.根据权利要求17～23中任一项所述的组合物，其中，还含有其它蛋白质，所述其它蛋白质为除权利要求1～16所述的蛋白质以外的蛋白质。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中的任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
26.一种器具，其具备权利要求1～16中任一项所述的蛋白质。
27.根据权利要求26所述的器具，其为用于医疗或用于研究的器具。
28.根据权利要求26或27所述的器具，其为细胞培养容器。
29.根据权利要求26或27所述的器具，其为细胞支架材料。
30.根据权利要求28所述的器具，其中，细胞培养面用所述蛋白质进行了包被。
31.根据权利要求26～30中任一项所述的器具，其用于干细胞的培养。
32.根据权利要求31所述的器具，其中，所述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
33.根据权利要求26～32中任一项所述的器具，其还具备其它蛋白质，所述其它蛋白质为除权利要求1～16所述的蛋白质以外的蛋白质。
34.根据权利要求33所述的器具，其中，所述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中的任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
35.一种制造培养细胞的方法，其包括：用权利要求26～34中任一项所述的器具培养细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述被培养的细胞为干细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。
38.根据权利要求35～37中任一项所述的方法，其中，组合使用其它蛋白质，所述其它蛋白质为除权利要求1～16所述的蛋白质以外的蛋白质。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述其它蛋白质为以下的(1)～(8)中任一者记载的蛋白质：
(1)使培养基中的成分稳定的蛋白质；
(2)含有使培养基中的成分稳定的氨基酸序列的蛋白质；
(3)具有细胞粘附能力的蛋白质；
(4)含有具有细胞粘附能力的氨基酸序列的蛋白质；
(5)促进细胞增殖的蛋白质；
(6)含有促进细胞增殖的氨基酸序列的蛋白质；
(7)与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的蛋白质；
(8)含有与所述(1)～(6)中的任一蛋白质结合的氨基酸序列的蛋白质。
40.一种基因，其编码权利要求1～16中任一项所述的蛋白质。
41.一种载体，其搭载权利要求40所述的基因。
42.一种宿主，其具有权利要求40所述的基因。
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