CN108884160B - 抗ror1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体‑1(ROR1)的人或人源化抗体或基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段。它还涉及双特异性或多特异性抗体、免疫配体‑药物缀合物、嵌合抗原受体和包含这种嵌合抗原受体的T细胞。

Description

抗ROR1抗体
本发明涉及抗ROR1抗体，包括双特异性和多特异性抗体、靶向ROR1的免疫配体-毒素缀合物以及抗ROR1的CAR和CAR细胞。
引言
对于一些肿瘤疾病，尚未存在有效的治疗方法。对于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和髓性恶性肿瘤，以及包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌在内的实体瘤尤其如此。
本发明的一个目的是提供解决这些疾病的新的治疗方法。
优选实施方案
应当理解，这里公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单独实施方案。在一个实施方案中讨论的特征意味着在本文所示的其他实施方案中也已公开。如果在一种情况下，一个具体特征没有用一个实施方案公开，而是用另一个实施方案公开，本领域技术人员将理解这不必意味着所述特征不想用其他实施方案公开。本领域技术人员将理解，本申请的主旨是公开的所述特征也用于其他实施方案，但仅为清楚并将说明书保持在适当篇幅范围内的目的，因此而未一一枚举。
根据本发明的第一实施方案，提供了人或人源化的抗体、或基于抗体的结合蛋白、或保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、或保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)。
在第二实施例中，还提供了所述第一实施例的免疫配体-药物缀合物，其具有与人或人源化的抗体、或基于抗体的结合蛋白、或保留靶结合能力的修饰的抗体形式、或保留靶结合能力的抗体衍生物或片段共价偶联的功能性部分，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)。该缀合物优选是抗体药物缀合物(ADC)，其优选与小分子量细胞毒素进行缀合，优选是位点特异性的，并且优选通过但不限于在WO2014140317中公开的分选酶-酶介导的缀合技术(SMAC-技术)进行缀合。
在第三实施例中，还提供了携带受体的哺乳动物细胞包含人或人源化的抗体、或基于抗体的结合蛋白、或保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、或保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)。此类哺乳动物细胞优选为免疫***的T细胞，其优选携带嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含人或人源化的抗体、或基于抗体的结合蛋白、或保留靶结合能力的修饰的抗体形式、或保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)。因此，在另一个优选的实施例中，这些哺乳动物细胞是CAR T细胞，其包含人或人源化的抗体、或基于抗体的结合蛋白、或保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、或保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)是细胞表面分子的受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员，其在胚胎和胎儿发育期间高度表达，并且其对于胚胎和胎儿发育是重要的，因为ROR-1敲除小鼠在新生时期死亡(Nomi M et al.(2001)Mol Cell Biol.21,8329-35)。在人出生后的组织中，几乎没有发现ROR1的表达。在脂肪组织中观察到低表达，且在胰腺、肺和中间B细胞亚群中观察到较小程度的表达。然而，重要的是，在几种癌症中已经发现ROR1表达升高，包括血液恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和髓性恶性肿瘤，以及包括神经母细胞瘤、肉瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌和胰腺癌在内的实体瘤。因此，ROR1的表达模式被称为肿瘤-胚胎表达模式，并因此作为特定癌症和肿瘤的靶标具有很高的医学意义(Borcherding N et al(2014)Protein Cell 5,496–502；Hojjat-Farsangi et al(2014)Seminars in Cancer Biology,29,21–31)。
与出生后的组织中ROR1表达的实质缺失一致，当非人灵长类动物用ROR1特异性的细胞毒性T细胞治疗时没有观察到毒性，其表明在人类中ROR1特异性靶向用于癌症治疗是安全的(Berger C et al.(2015)Cancer Immunol Res.3,206-16)。迄今为止，还没有ROR1特异性抗体在临床上批准用于癌症治疗。
为了适用于人类疾病的治疗，靶向ROR-1的抗体和靶向ROR-1的免疫配体-毒素-缀合物应当显示出最小的免疫原性，从而最小化由患者的免疫***将其从***中清除的可能性，并因此导致延长的血清半衰期并因此具有更高的有效性。此外，降低的免疫原性避免了不期望的并且有时甚至危及生命的副作用，如免疫原性反应。
因此，本发明提供了人和人源化的抗ROR-1抗体，预期其导致最小的免疫原性并具有***病症的功效。
在一个具体实施方案中，提供了人源化的抗ROR-1抗体、或基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段。
术语“人源化的抗体”是指含有源自人和非人(例如兔)免疫球蛋白的序列的嵌合抗体，使得基本上所有的CDR区都是非人来源的，而基本上所有的FR区都对应于人免疫球蛋白序列的FR区。在一个实施方案中，抗体已经从啮齿动物或兔亲代抗体中被人源化，即包含来源于啮齿动物或兔的CDR区。
已经基于来自小鼠和兔来源的功能性表征的抗ROR1啮齿动物抗体(命名为R11、R12(均为兔))(WO 2012/075158 A1)和2A2(小鼠)(WO 2010/124188 A1)开发了人源化的抗体，其全部结合ROR1分子的不同细胞外结构域，即Ig、ROR1的卷曲蛋白结构域(Frizzleddomain)和Kringle结构域(Yang J et al.(2011)PLoS ONE 6,e21018；Baskar S et al.(2012)mAbs 4,1-13)。
基于与来自人类抗体库的大量下一代测序数据的序列比对以及选择与人IgG重链和轻链序列具有最大相似性的人框架区，通过专有算法将这些抗体人源化。已经选择了与亲代抗体克隆具有期望的序列同源性的已鉴定的人框架区的集合，并将其与高亲和力啮齿类动物mAb R11、R12和2A2的CDR相结合。
已经基因合成了多达183个预测的人源化的抗体的集合，并且单个IgG重链和轻链的文库已经被稳定地表达并通过使用所描述的转座介导的抗体展示(Transpo-mAb)(Waldmeier et al.(2016)MAbs 8(4):726-740,WO2014013026)展示在哺乳动物细胞的表面上。已经基于ROR1靶向结合有效性选择了人源化的抗体的重链和轻链的各个组合，并分析了最佳克隆以回收序列。基于对更大规模的人源化IgG重链和轻链库的筛选，可鉴定高亲和力的人源化的mAb而无需进一步的亲和力成熟。
在一些情况下，所提供的人源化的抗ROR-1抗体相对于衍生它们的亲代抗体来说，对ROR1的结合亲和力显示出预料不到的重大改进。这是预料不到的，因为抗体的人源化通常会导致亲和力的降低或丧失，这就需要繁琐地通过额外的亲和力成熟来补偿(Baca etal.(1997)J.Biol.Chem.271:10678-84)。
在一个优选的实施方案中，抗体包含至少3个CDR序列：
SEQ ID No 1 CDR1 HC
SEQ ID No 2 CDR2 HC
SEQ ID No 3 CDR3 HC
或者
SEQ ID NO 15 CDR1 HC
SEQ ID NO 16 CDR2 HC
SEQ ID NO 17 CDR3 HC
或者
SEQ ID NO 29 CDR1 HC
SEQ ID NO 30 CDR2 HC
SEQ ID NO 31 CDR3 HC
在另一个优选的实施方案中，抗体包含至少3个CDR序列：
SEQ ID No 4 CDR1 LC
SEQ ID No 5 CDR2 LC
SEQ ID No 6 CDR3 LC
或者
SEQ ID NO 18 CDR1 LC
SEQ ID NO 19 CDR2 LC
SEQ ID NO 20 CDR3 LC
或者
SEQ ID NO 32 CDR1 LC
SEQ ID NO 33 CDR2 LC
SEQ ID NO 34 CDR3 LC
在这两种情况下，应当理解CDR(“互补决定区”)的定义是基于“IMGT对所有物种的所有IG和TR V-REGION的独特编号：对结构和进化的兴趣”。此外，“CDR LC”是指轻链CDR，而“CDR HC”是指重链CDR。
在一个优选的实施方案中，抗体包含至少一个与选自以下的序列具有95％相同性、优选96或甚至97％相同性、更优选98％或甚至99％相同性、最优选100％序列的重链或轻链可变区序列：
SEQ ID NO 9 VR HC
SEQ ID NO 10VR LC
SEQ ID NO 11 VR HC
SEQ ID NO 12 VR LC
SEQ ID NO 13 VR HC
SEQ ID NO 14 VR LC
SEQ ID NO 23 VR HC
SEQ ID NO 24 VR LC
SEQ ID NO 25 VR HC
SEQ ID NO 26 VR LC
SEQ ID NO 27 VR HC
SEQ ID NO 28 VR LC
SEQ ID NO 37 VR HC
SEQ ID NO 38 VR LC
SEQ ID NO 39 VR HC
SEQ ID NO 40 VR LC
SEQ ID NO 41 VR HC
SEQ ID NO 42 VR LC
SEQ ID NO 43 VR HC
SEQ ID NO 44 VR LC
“VR HC”是指重链可变序列，而“VR LC”是指轻链可变序列。
在一个优选的实施方案中，抗体被人源化自
·鼠抗ROR抗体mAb 2A2、
·兔抗ROR抗体mAb R11、和/或
·兔抗ROR抗体mAb R12，
和/或选自由以下组成的组：
·hu2A2b-Q11(也称为msQ11-3)
·hu2A2-D23(也称为msD23-19)
·hu2A2-D16(也称为msD16-7)
优选但不限于具有优于11nM的亲和力
·rbQ11(也称为rbQ11-32)
·rbD4(也称为rbD4-32)
·rbQ12(也称为rbQ12-40)
优选但不限于具有优于15nM的亲和力
·huR12-4
·huR12-7
·huR12-11、和/或
·huR12-16
和/或与以上提及的任何抗体享有至少95％相同性、优选96或甚至97％相同性、更优选98％或甚至99％相同性，并且最优选100％氨基酸序列相同性的抗体。
在一个实施方案中，抗体对人ROR1具有优于1.0nM的亲和力。
在另一个实施方案中，由兔抗ROR抗体mAb R12人源化的抗体具有比其亲代(即兔单克隆抗体R12)更好的亲和力。
在一个优选的实施方案中，抗体具有表1或表2中所示的特征中的至少一个。
根据本发明的又一个实施方案，提供了人或人源化的抗体或基于抗体的结合蛋白、保留了靶结合能力的经修饰的抗体形式、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其
(i)具有对于ROR1的结合亲和力，其至少与以上描述的任一种抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段的结合亲和力一样高或基本上一样高，和/或
(ii)与以上描述的任一种抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段竞争。
在以上描述的抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段的一个实施方案中，受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)是人ROR1。
根据本发明的另一个实施方案，上述权利要求中任一项的基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段是双特异性抗体或多特异性抗体。
术语“双特异性抗体”和“多特异性抗体”是指能够与单个抗原或两种不同抗原上的两种或更多种不同表位结合的抗体，其中一种抗原是ROR1。本发明的双特异性抗体可通过生物学方法，例如体细胞杂交来产生；或遗传方法，例如在生物体中表达编码所需抗体结构的非天然DNA序列来产生；化学方法，例如两种抗体的化学缀合；或其组合(Kontermann，R.E.In:Bispecific Antibodies.Kontermann RE(ed.),Springer Heidelberg DordrechtLondon New York,pp.1 -28(2011))来产生。
化学缀合双特异性抗体产生自两种现有抗体或抗体片段的化学偶联。典型的偶联包括交联两种不同的全长抗体、交联两种不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab')2和交联F(ab')2片段和不同的Fab'片段以产生双特异性F(ab')3。对于化学缀合，可使用氧化再缔合策略。目前的方法学包括使用同型双功能或异型双功能交联试剂(同上)。
异型双功能交联试剂对例如抗体分子上的两个不同的活性基团具有反应性。异型双功能交联试剂的实例包括SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SATA(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧化物)、EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、PEAS(N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮基水杨酰胺)、ATFB、SE(4-叠氮基-2,3,5,6-四氢苯甲酸，琥珀酰亚胺酯)、二苯甲酮-4-马来酰亚胺、二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯甲酰苯甲酸、琥珀酰亚胺酯、碘乙酰胺叠氮化物、碘乙酰胺炔、Click-iT马来酰亚胺DIBO炔烃、叠氮基(PEO)4丙酸、琥珀酰亚胺酯、炔烃、琥珀酰亚胺酯、Click-iT琥珀酰亚胺酯DIBO炔烃、磺基-SBED(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-[生物素酰氨基]-2-(对叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯)、光反应性氨基酸{例如，L-光-亮氨酸和L-光-甲硫氨酸)、NHS-卤代乙酰基交联剂，例如，磺基-SIAB、SIAB、SBAP、SIA、NHS-马来酰亚胺交联剂，例如，磺基-SMCC、SM(PEG)n系列交联剂、SMCC、LC-SMCC、磺基-EMCS、EMCS、磺基-GMBS、GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、MBS、磺基-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、磺基-LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC(N,N'-二环己基碳化二亚胺)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPH和PMPI。
同型双功能交联试剂对分子(例如，抗体)上的相同活性基团具有反应性。同型双功能交联试剂的实例包括DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、o-PDM(邻亚苯基二马来酰亚胺)、DMA(二甲基己二酰亚胺化物)、DMP(二甲基庚二酰亚胺化物)、DMS(二甲基辛二酰亚胺化物)、DTBP(二硫代双丙酰亚胺化物)、BS(PEG)5、BS(PEG)9、BS3、BSOCOES、DSG、DSP、DSS、DST、DTSSP、EGS、磺基-EGS、TSAT、DFDNB、BM(PEG)n交联剂、BMB、BMDB、BMH、BMOE、DTME和TMEA。体细胞杂交是两种不同的杂交瘤细胞系的融合(产生特异性抗体的B细胞和骨髓瘤细胞的融合)，产生能够产生两种不同抗体重链(VHA和VHB)和轻链(VLA和VLB)的细胞杂交瘤。(Kontermann,R.E.In:Bispecific Antibodies.Kontermann RE(ed.),SpringerHeidelberg Dordrecht London New York,pp.1-28(2011))。这些重链和轻链在细胞内随机组合，产生双特异性抗体(与VLA结合的VHA和与VLB结合的VHB)，以及一些非功能性(例如与两个VLB组合的两个VHA)和单特异性(与两个VLA组合的两个VHA)抗体。然后可使用例如两种不同的亲和层析柱纯化双特异性抗体。与单特异性抗体相似，双特异性抗体也可包含Fc区域，其诱导抗原结合下游的Fc介导的效应。通过例如胃蛋白酶消化从双特异性抗体蛋白酶解切割Fc区产生双特异性F(ab')2分子可降低这些效应(同上)。
双特异性抗体也可通过遗传手段产生，例如，体外表达含有对应于所需抗体结构的DNA序列的质粒。参见，例如，Kontermann,R.E.In:Bispecific Antibodies.KontermannRE(ed.),Springer Heidelberg Dordrecht London New York,pp.1-28(2011)。下面更详细地讨论这种双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体可以是二价、三价或四价。如本文所用，“价”、“化合价”或其其他语法变体是指抗体分子中抗原结合位点的数目。
还提供了
a)一种分离的核酸序列或其集合，其编码根据以上描述的抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段，或根据以上描述的双特异性抗体或多特异性抗体，
b)一种载体，其包含至少一个此类核酸序列，
c)一种分离的细胞，其表达根据以上描述的抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段，或根据以上描述的双特异性抗体或多特异性抗体，
d)和/或其包含根据以上描述的一种核酸序列或其集合，或根据以上描述的一种载体，和
e)一种制备根据以上描述的抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段的方法，其包括培养根据以上描述的细胞，和纯化抗体、基于抗体的结合蛋白质、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段。
根据本发明的另一个方面，提供了具有通式A-(L)n-(T)m的免疫配体-药物缀合物，其中
·A是靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)的免疫配体，
·L是接头，
·T是毒素
并且其中n和m是≥1和≤10之间的整数
在该构建体中，(L)n可指几个接头，其形成将一个毒素缀合至一个免疫配体的单一链和/或将几个毒素连接至一个免疫配体的几个接头。同样地，(L)n可表示几个接头，其将相同免疫配体的两个亚结构域缀合至两个毒素分子。
Figure GDA0003938707660000081
因此，所得到的免疫配体-毒素-缀合物将具有≥1且≤10的毒素/免疫配体比率。优选地，n和m是≥1和≤4之间的整数。所得到的免疫配体-毒素-缀合物因此将具有≥1且≤4的毒素/免疫配体比率。
如本文所用，术语“免疫配体”是指定义一个实体、一种药物或一个分子，其对给定靶标(例如受体、细胞表面蛋白、细胞因子等)具有亲和力。这种免疫配体可任选地阻断或抑制激动剂介导的应答，或抑制受体-激动剂的相互作用。然而，最重要的是，免疫配体可充当载体(shuttle)以将负载物(payload)递送至由所述免疫配体识别的靶标所定义的特定位点。因此，靶向受体的免疫配体将其负载物递送至以大量所述受体为特征的位点。
在又一个优选的实施方案中，免疫配体选自以下的至少一种：
·抗体、
·基于抗体的结合蛋白、
·保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、
·保留靶结合能力的抗体衍生物或片段、和/或
·双特异性抗体或多特异性抗体。
“抗体”也同义地被称为“免疫球蛋白”(Ig)，其通常包含四条多肽链，两条重链(H)和两条轻链(L)，且因此是多聚体蛋白或其等同的Ig同系物(例如仅包含一条重链的骆驼抗体、可以来源于一条重链或轻链的单结构域抗体(dAbs))；包括其全长功能性突变体、变体或衍生物(包括但不限于鼠类、嵌合的、人源化的和完全的人抗体，其保留Ig分子的必需表位结合特征，并且包括双重特异性(dual specific)、双特异性、多特异性和双重可变结构域免疫球蛋白；免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)和同种异型。
如本文所用的“基于抗体的结合蛋白”可表示在其他非免疫球蛋白或非抗体衍生组分的情况下含有至少一个抗体衍生的VH、VL或CH免疫球蛋白结构域的任何蛋白质。此类基于抗体的蛋白质包括但不限于(i)结合蛋白的Fc-融合蛋白，包括具有全部或部分免疫球蛋白CH结构域的受体或受体组分，(ii)结合蛋白，其中VH和/或VL结构域与替代的分子支架缀合，或(iii)分子，其中免疫球蛋白VH和/或VL和/或CH结构域以通常不存在于天然存在的抗体或抗体片段中的方式进行组合和/或组装。
如本文所用，“抗体药物缀合物”(ADC)涉及与小分子量活性药物成分(API)偶联的抗体或抗体片段或基于抗体的结合蛋白，包括但不限于毒素(例如包括但不限于微管蛋白抑制剂、肌动蛋白结合剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA嵌入和修饰/破坏药物)、激酶抑制剂或任何干扰特定细胞通路的API，所述特定细胞通路对于细胞的存活和/或对于特定的生理细胞通路是必需的。
如本文所用，“抗体衍生物或片段”涉及包含至少一条衍生自非全长抗体的多肽链的分子，包括但不限于(i)Fab片段，其是由可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CHI)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fa)片段的重链部分，其由VH和CHI结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，其包含单个可变结构域；(vi)分离的互补决定区(CDR)；(vii)单链Fv片段(scFv)；(viii)二价抗体，其是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用过短以至于不容许同一条链上的两个结构域之间进行配对的接头，从而迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点；(ix)线性抗体，其包含与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)；(x)双重可变结构域免疫球蛋白；(xi)免疫球蛋白重链和/或轻链或其突变体、变体或衍生物的其他非全长部分的单个或其任意组合。
如本文所用，术语“经修饰的抗体形式”包括抗体-药物缀合物、聚亚烷基氧化物改性的scFv、单价抗体(monobody)、二价抗体(diabody)、骆驼抗体、结构域抗体、双特异性或三特异性抗体、IgA或由J链和分泌组分连接的两个IgG结构、鲨鱼抗体、新世界灵长类动物框架+非新世界灵长类动物CDR、去除铰链区的IgG4抗体、工程化到CH3结构域中的具有两个额外结合位点的IgG、具有改变的Fc区以增强对Fcγ受体亲合力的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚化的构建体等。
如本文所用，术语“抗体模拟物”是指不属于免疫球蛋白家族的蛋白质，且甚至是非蛋白质(例如适体或合成聚合物)。一些类型具有抗体样β片层结构。“抗体模拟物”或“替代支架”相对于抗体的潜在优点是溶解性更好、组织渗透性更高、对热和酶的稳定性更高以及生产成本相对较低。
另一个优选的实施方案是免疫配体，其包含至少一种如上文公开中所示的对ROR1具有结合能力的抗体或抗体片段。
如本文所用，“免疫配体-药物缀合物”(IDC)涉及包含本文公开的人源化的抗ROR1抗体或基于抗体的结合蛋白的结合部分的分子，其与小分子量活性药物成分偶联(API)，所述小分子量活性药物成分包括但不限于毒素(例如包括但不限于微管蛋白抑制剂、肌动蛋白结合剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA嵌入和修饰/破坏药物)、激酶抑制剂或干扰细胞存活所必需的和/或对于特定生理细胞通路必需的特定细胞通路的任何API。
另一个优选的实施方案是如上所公开的免疫配体-药物缀合物，其包含免疫配体和优选小分子量活性药物成分(API)之间的共价接头。
在另一个优选的实施方案中，所述接头选自以下的至少一种：
·寡肽接头，任选地包含可切割的间隔物，所述间隔物可通过pH、氧化还原电位和/或特定的细胞内酶的变化而被切割，和/或
·马来酰亚胺接头，任选地包含可切割的间隔物，可通过pH、氧化还原电位和/或特定胞内酶的变化而被切割。
在一个优选的实施方案中，接头包括或由选自以下的至少一个组成：寡肽接头(包括可切割和不可切割的寡肽接头)、肼接头、硫脲接头、自脱落接头、琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)接头、马来酰亚胺接头、二硫化物接头、硫醚接头和/或马来酰亚胺接头。
本领域技术人员理解其他接头可能是合适的。此类接头可能是不可切割的，或可通过pH、氧化还原电位或特定的细胞内或肿瘤组织相关酶的变化而被切割。可切割的寡肽接头包括蛋白酶或可基质金属蛋白酶切割的接头。应当理解，接头可包括上述的组合。例如，接头可以是缬氨酸-瓜氨酸PAB接头。
在一个优选的实施方案中，接头包含被分选酶识别的寡肽，所述寡肽包括但不限于选自LPXSGn、LPXAGn、LPXTGn、LAXTGn、LAETGn、LPXTAn或NPQTGn的氨基酸序列，其中n为≥1且≤21的整数，并且X是任何氨基酸。
在又一个优选的实施方案中，接头包含序列LPXTGn的寡肽，其中n为≥1且≤20的整数，并且X为任何天然存在的氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，接头与免疫配体的至少一个亚结构域的C端缀合。
在另一个优选的实施方案中，在缀合之前，
·免疫配体携带使用或缀合至其至少一个亚结构域的C端的分选酶识别标签，以及
·毒素包含长度为1-20个甘氨酸残基的短甘氨酸区段，优选具有3至5个氨基酸的长度。
优选地，分选酶识别标签是：
·LPXTG或LPXAG，其被金黄色葡萄球菌分选酶A识别；
·LPXSG，其被金黄色葡萄球菌分选酶A或来自金黄色葡萄球菌的工程化的分选酶A 4S-9识别；
·LAXTG，且尤其是LAETG，其被来自金黄色葡萄球菌的工程化的分选酶A2A-9识别；
·LPXTA，其被化脓性链球菌分选酶A识别；或者
·NPQTN，其被金黄色葡萄球菌分选酶B识别。
下表显示了识别标签和由其衍生的作为接头的一部分的肽(其中n是≥1且≤21的整数，且X是任何氨基酸)：
Figure GDA0003938707660000111
工程化的分选酶，包括来自金黄色葡萄球菌的A 2A-9和A 4S-9，描述于Dorr BMet al.,PNAS 2014；111,13343-8.,和Chen et al.,PNAS 2011；108(28)；11399-11404中。
作为背景并举例说明分选酶转肽作用的一般概念，例如分选酶A使用寡聚甘氨酸区段作为亲核试剂来催化转肽作用，通过转肽作用寡聚甘氨酸的末端氨基对连接分选酶标签的最后两个C末端残基的肽键产生亲核攻击。这导致该肽键断裂并且在分选酶标签的C末端倒数第二个残基和寡聚甘氨酸肽的N末端甘氨酸之间形成新的肽键，即导致转肽作用。
在分选酶缀合之前，分选酶标签可还在其C末端携带其他标签，如His标签、Myc标签或Strep标签(参见WO 2014/140317的图4a，其内容通过引用并入本文)。然而，由于分选酶标签的第4个和第5个氨基酸之间的肽键在分选酶A介导的缀合时被切割，所以这些附加标签不出现在缀合产物中。
分选酶标签可例如通过基因融合与结合蛋白的C末端或其结构域或其亚基融合，并与之共同表达。在另一个优选的实施方案中，分选酶标签可直接附加到免疫球蛋白轻链或重链的C-末端最后一个天然存在的氨基酸，其在人免疫球蛋白κ轻链的情况下是C-末端半胱氨酸残基，并且在人免疫球蛋白IgG1重链的情况下可以是由人Fcγ1cDNA编码的C-末端赖氨酸残基。然而，另一个优选的实施方案还直接将分选酶标签附加到由人Fcγ1cDNA编码的C-末端倒数第二个甘氨酸残基上，因为通常在哺乳动物细胞中通过翻译后修饰剪掉抗体重链的末端赖氨酸残基。因此，超过90％的天然存在的人IgG1中缺乏IgG1重链的C-末端赖氨酸残基。
因此，本发明的一个优选实施方案是在用于分选酶识别基序标记的Igγ1重链的表达构建体中省略人IgG1重链恒定区的C-末端赖氨酸氨基酸残基。另一个优选的实施方案是在分选酶识别基序标记的Igγ1重链的表达构建体中包含人IgG1重链恒定区的C-末端赖氨酸氨基酸残基。
在另一个优选的实施方案中，分选酶标签可附加到人免疫球蛋白IgG1重链的C-末端，其中由人Fcγ1cDNA编码的C-末端赖氨酸残基被赖氨酸以外的氨基酸残基取代，以防止分选酶与所述C-末端赖氨酸残基的ε-氨基基团发生无收益的反应导致重链间交联。
我们之前已经描述过，在某些情况下(例如在Igκ轻链的C-末端，参见：Beerlietal.(2015)PloS One 10,e131177)，在结合蛋白的C-末端和分选酶标签之间添加附加的氨基酸是有益的。已经显示这可提高负载物与结合蛋白的分选酶缀合效率。在Igκ轻链的情况下，观察到通过在Igκ轻链的C-末端最后的半胱氨酸氨基酸与分选酶五肽基序之间添加5个氨基酸提高了缀合动力学，使得Igκ轻链和Ig重链的C-末端可以类似的动力学缀合(参见：Beerli et al.(2015)PloS One 10,e131177)。因此，另一个优选的实施方案是任选地在结合蛋白或抗体亚基的C-末端最后的氨基酸与分选酶标签之间加入≥1个且≤11个氨基酸。
此外，免疫配体可包含分选酶标签的C端、其他标签(例如但不限于His标签、Myc标签和/或StrepII标签)。参见WO 2014140317 A2以获得更多细节，其主题通过引用并入本文。
在另一个优选的实施方案中，毒素选自以下中的至少一种：
·美登木素生物碱、
·奥瑞他汀、
·蒽环类，优选PNU衍生的蒽环类
·卡奇霉素、
·tubulysin
·倍癌霉素
·放射性同位素
·包含毒素负载物的脂质体、
·蛋白毒素
·紫杉烷，和/或
·吡咯苯二氮卓类物质
优选的美登木素生物碱毒素的实例在图1和2中示出。本文公开的蒽环类衍生物(也称为“PNU”)是PNU-159682的衍生物，其是蒽环霉素奈莫柔比星的代谢物并且首次由Quintierei et al.2005公开。PNU-159682在图5中示出。图3(a)中描述了优选的蒽环类衍生物。
包含蒽环类衍生物的免疫配体药物缀合物在WO 2016102697和要求其优先权的申请中公开，其内容通过引用并入本文。
优选地，免疫配体-药物缀合物包含两种或更多种不同的毒素。以这种方式，通过避免针对包含在免疫配体-药物缀合物中的单一毒素的抗性可增强细胞杀伤活性。
在另一个优选的实施方案中，免疫配体-药物缀合物具有如图8或图12所示的细胞杀伤活性。
在另一个实施方案中，免疫配体-药物缀合物通过分选酶介导的(i)携带一个或多个分选酶识别标签的免疫配体和(ii)携带寡聚甘氨酸标签的一种或多种毒素的缀合来产生。
根据本发明的另一个方面，提供了上述公开中的任一个免疫配体-药物缀合物的生产方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供以上所列出的免疫配体，所述免疫配体携带分选酶识别标签，
b)提供携带寡聚甘氨酸标签的一种或多种毒素，以及
c)通过分选酶介导的缀合将免疫配体和毒素进行缀合。
在WO 2014140317中详细公开了通过分选酶或断裂内含肽将免疫配体缀合至负载物的方法，其主题通过引用并入本文。
根据另一个实施方案，提供了ROR1特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)根据以上描述的至少一种抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式或抗体衍生物或片段，或
b)根据以上描述的双特异性或多特异性抗体，
其与至少一个跨膜区和至少一个细胞内结构域融合或缀合。
嵌合抗原受体(CAR)，有时也被称为人造T细胞受体，是工程化的受体，其将任意的特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；通过逆转录病毒载体促使其编码序列的转移。受体被称为嵌合的，因为它们由来自不同来源的部分组成。
CAR是一种用于治疗癌症的潜在候选药物，采用一种称为过继细胞转移的技术。从患者身上获取T细胞并进行修饰以使得它们表达对患者特定癌具有特异性的CAR，所述CAR特异性地结合癌细胞特异性的抗原(就像ROR1一样)。然后可识别并杀伤癌细胞的T细胞被再次引入患者体内。
原型CAR的结构是模块化的，旨在适应各种功能性结构域，并从而能够选择T细胞的特异性和受控活化。在本发明的上下文中，CAR包含衍生自靶向ROR1的抗体、基于抗体的结合蛋白、经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段的抗体样结合结构域。此类实体可以是但不限于例如单链可变片段(scFv)，其将单克隆抗体的重链和轻链可变区二者的特异性和结合残基组合在单条多肽链中，与至少一个跨膜区和至少一个胞内结构域融合或缀合。
优选地，所述跨膜区包含CD8a跨膜结构域。优选地，所述CAR进一步包含置于跨膜结构域和抗体、基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的经修饰的抗体形式或抗体衍生物之间的铰链区。优选地，所述胞内结构域包含T细胞受体信号传导结构域。更优选地，所述信号传导结构域包含或衍生自CD3-ζ链的ζ链。优选地，所述胞内结构域进一步包含T细胞共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
T细胞共刺激分子的优选胞内信号传导结构域选自：4-1BB、CD-28、OX40和/或CD278/ICOS。特别优选两个或多个这些结构域的组合。
根据本发明的另一个实施方案，提供了包含这种嵌合抗原受体的细胞。
所述细胞优选为工程化的T细胞，也被称为“CAR T细胞”。CAR T细胞是装备有CAR的基因工程化的T细胞，其胞外识别单元由抗体衍生的识别结构域组成，并且其胞内区来源于淋巴细胞刺激部分。通过用这种嵌合受体装备T细胞，以非HLA限制性方式将工程化的细胞以预定义的特异性重定向至任何期望的靶抗原。使用逆转录病毒或慢病毒载体或转座因子将CAR构建体在体外引入给定患者的外周淋巴细胞的T细胞中。将产生的CAR-工程化的T细胞输注回患者体内后，它们流动、到达其靶位点并且在与其靶细胞或组织相互作用时，它们被活化并发挥其预定的效应子功能。CAR方法的治疗靶点包括癌细胞和HIV感染的细胞，或自身免疫效应子细胞。或者，所述细胞优选是工程化的天然杀伤细胞(NK细胞)。
本发明的另一个方面是根据以上描述的权利要求中任一项的基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段的用途，根据以上描述的双特异性或多特异性抗体，根据以上描述的免疫配体-药物缀合物，或根据以上描述的CAR或细胞用于治疗以下患者的用途：
·患有肿瘤疾病的患者，
·具有患肿瘤疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤疾病的患者。
在一个优选的实施方案中，所述肿瘤疾病是选自以下中的至少一种：
·血液肿瘤，例如淋巴瘤和白血病，如慢性淋巴细胞白血病((CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性骨髓性白血病(AML)，和
·实体瘤，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含根据以上描述的抗体或基于抗体的结合蛋白、保持靶结合能力的经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段，根据以上描述的双特异性或多特异性抗体，根据以上描述的免疫配体-药物缀合物，或根据上述描述的CAR或细胞以及一种或多种药学上可接受的成分。
根据本发明的另一方面，提供了一种在体外或在患者体内杀伤表达ROR1的细胞或抑制其生长的方法，该方法包括向细胞施用药学上有效量或剂量的(i)根据以上描述的抗体或基于抗体的结合蛋白、保持靶结合能力的经修饰的抗体形式、抗体衍生物或片段，根据以上描述的双特异性或多特异性抗体，根据上述描述的免疫配体-药物缀合物，或根据上述描述的CAR或细胞，或(ii)根据以上描述的药物组合物。
优选地，其中表达ROR1的细胞是癌细胞，优选为血液肿瘤，例如淋巴瘤和白血病，如慢性淋巴细胞白血病((CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤MCL)、急性骨髓性白血病(AML)，或实体瘤，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
进一步优选地，ROR1是人ROR1。
实验和附图
尽管已经在附图和以上的描述中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述被认为是说明性的或示例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。在实践所要求保护的本发明时，那些本领域技术人员通过研究附图、公开内容和所附权利要求可理解并实现所公开的实施方案的其他变型。在权利要求中，词语“包含”不排除其他元素或步骤，并且不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。在相互不同的从属权利要求中提及某些特征这一单纯事实并不表示这些特征的组合无法有利地使用。权利要求中的任何附图标记不应当被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列都从N端至C端示出；本文公开的所有核酸序列都以5'->3'示出。
实验结果
通过Transpo-mAb展示筛选产生和选择人源化的抗-ROR1抗体
为了使人源化的小鼠2A2(Baskar S et al.(2012)mAbs 4,1-13)和两种兔单克隆抗体(R12和R11(Yang J et al.(2011)PLoS ONE 6,e21018)具有对癌细胞表面标记ROR1的特异性，我们已经决定通过首先将亲代抗体序列通过专有算法与含有用于人IgG抗体的人可变区序列的下一代测序数据的专有数据库进行比对来将所述抗体的可变区人源化。基于所述专有算法，鉴定出最佳匹配，且亲代mAb的CDR用计算机技术移植到选定的人VH和VL框架中。这产生了用于mAb 2A2的VH的64个人源化的VH序列的计算机预测和用于mAb 2A2的VL的49个人源化的VL序列的计算机预测。对于R11，计算机已经产生了101个VH的人源化变体和82个VL的人源化变体。最后，对于R12，预测了25个人源化VH和25个人源化VL序列。如本文所述，已经克隆了可转座的IgG重链和轻链表达载体的文库。如本文所述，载体文库已稳定转座到L11宿主细胞中，以通过转座产生细胞文库，其中各个细胞表达人源化的ROR1 IgG重链和轻链的单一组合。通过FACS，基于细胞与ROR1重组抗原的结合(图9(a))，通过单细胞FACS分选选择单个结合物(binder)并且通过SPR筛选来自单个克隆的上清液以获得高亲和力结合物(图9(b))。使用单一浓度测量法确定60个(2A2)和30个(R11)细胞克隆上清液的ROR1亲和力。如本文所述，随后我们选择从显示最高亲和力的每种人源化物的那5个克隆中回收序列。通过瞬时转染入HEK293T细胞对各个HC/LC对进行序列回收和验证以及通过ELISA对抗原结合上清液的进行分析之后，我们选择更大规模地表达和纯化显示出最佳结合的那三种mAb(数据未显示)。
为了R12克隆的人源化，我们选择通过ELISA筛选L11细胞克隆上清液以获得最有希望的克隆。为了根据它们的抗原结合强度对克隆进行评分，我们确定了它们各个的抗原结合:IgG-滴度比(图10)。随后，我们选择回收来自那些显示出最高抗原结合:IgG-滴度比的那十六个细胞克隆的序列，即显示出标准化到IgG滴度的最高结合。通过将相应抗体表达构建体瞬时转染入HEK293T细胞对各个HC/LC对进行序列回收和验证以及通过ELISA分析上清液的抗原结合:IgG滴度比之后，使用从瞬时转染获得的HEK293T上清液和包括来自编码亲代mAb R12的表达构建体瞬时转染入HEK293T细胞的上清液作为平行参考，我们通过表面胞质团共振(SPR)着手测量在ELISA中显示出最高的抗原结合:IgG滴度比的那八种mAb的亲和力。该分析表明分离的人源化的抗-ROR1 mAb的亲和力显著优于那些亲代mAb的亲和力(表2)。为了证实该观察结果，在HEK293T细胞中大规模表达三种人源化的R12 mAb，进行纯化并通过SPR用这些纯化的mAb反复测定亲和力(图13)。
该分析证实人源化与亲代mAb R12的单价亲和力相比显著增加超过5倍。
因此，用于顶级人源化的抗ROR1人源化的mAbs的多循环表面胞质团共振(SPR)表明对于2A2和R11而言选定的人源化的抗-ROR1 mAb的亲和力与相应亲代mAb的亲和力处于相同范围内(图9(c)和表1)，或者对于R12而言人源化的抗-ROR1 mAb的亲和力甚至显著更高(表2和图13)。
这一发现是非常令人惊讶的，因为抗体人源化通常导致结合亲和力的显著减少或完全丧失，因而必须通过随后的亲和力成熟来重新获得。
人源化程度的分析
还分析了这些克隆之间的人源化程度。为此，我们确定了每条链的框架区与那些人种系序列的百分比相似性，所述人种系序列与人源化mAb的整个可变区序列最密切相关(图11)。总体而言，文库和分离的mAb的平均人源化程度与已经得到临床批准的人源化抗体相当(图11)。
用人源化的ROR1 mAb评估ADC的体外细胞杀伤活性
为了评估分离的人源化的抗体克隆作为抗体-药物缀合物(ADC)的效力，表达抗体并将其纯化为LPETG-标记的形式以允许使用SMAC-technologyTM缀合蒽环衍生的毒素(图6)。与图6所示的细胞稳定药(cytostatic drug)缀合的基于2A2的抗ROR1抗体(PNU-EDA-Gly5)有效地影响ROR1阳性697ALL细胞系的细胞存活力，而ADC与未缀合抗体的冷竞争反应显著降低细胞毒性，表明细胞毒性确实是靶向介导的(图8(b))。基于人源化形式的ADC显示高度相似的细胞杀伤效率以及靶向特异性。同样，基于亲代和人源化的R12抗体的ADC能够特异性地和有效地杀伤ROR1阳性人697ALL癌细胞(图12(b))以及过表达人ROR1的鼠癌细胞(EMT6-ROR1)，但不能杀伤不表达人ROR1的亲代细胞系(EMT6)(图12(c))。
ADC及其体内功效
与用同种型对照ADC处理的那些小鼠相比，用SMAC缀合的基于hu2A2b-Q11的ADC处理的小鼠显示出延长的存活期(图8(c))。具体而言，用基于hu2A2b-Q11的ADC处理的小鼠的中值存活时间为28.3天，而同种型对照组为23.5天。各组之间没有观察到显著的体重减轻差异(数据未显示)。
实施例
以下部分描述了如何产生本文公开的抗ROR1抗体的实验细节。
产生基于EBNA的嵌合抗体表达构建体
产生亲代抗-ROR1小鼠mAb 2A2(Baskar S et al.(2012)mAbs 4,1-13)、兔mAbR12和兔mAb R11(Yang J et al.(2011)PLoS ONE 6,e21018)作为如下具有人恒定区的嵌合全长IgG1抗体。通过总基因合成(GenScript,Piscataway,USA)，使用MNFGLRLIFLVLTLKGVQC作为前导序列产生包含侧翼限制性位点5’NotI/3’-NheI(VH)和NotI/BsiWI(Vkappa)或NotI/KasI(Vlambda)的可变区编码序列。通过总基因合成(GenScript,Piscataway,USA)产生携带附加的c-末端标签(IgH链标签：LPETG-G-WSHPQFEK；IgL链标签:GGGGS-LPETG-G-WSHPQFEK)的用于可溶性抗体表达的人IgH-γ1和IgL-κ(2A2和R11)或IgL-λ恒定区序列，其包括侧接的限制性位点5’NheI/3’BstBI(IgH-γ1)和5’BsiwI/3’BstBI(IgL-κ)或5’KasI/3’BstBI(IgL-λ)。抗体可变区和恒定区片段根据它们的侧翼限制性位点分别进行双重消化并且通过连接组装在表达载体pCB14b中(图14)，所述表达载体事先用NotI/BstBI限制性酶进行双重消化而线性化。pCB14b是游离型哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)的衍生物，其携带EBV复制起点并编码EBV核抗原(EBNA-1)以允许染色体外的复制，并含有嘌呤霉素选择标记以替代原始潮霉素B抗性基因。图15显示了用于重链(分别为2A2和R12，分别为图15(a)和(c))、κ轻链(2A2，图15(b))和λ轻链(R12，图15(d))表达的基于pCB14b的表达构建体的质粒图谱。R11构建体(κ轻链)类似于2A2构建体，但是携带R11可变区。
抗原的表达和纯化
StrepII标记的ROR1-胞外结构域如下产生：编码人ROR1(NP_005003)的胞外结构域的核苷酸序列的N-末端与信号序列(MNFGLRLIFLVLTLKGVQC)融合，且C-末端与编码strepII-标签(GWSHPQFEK)的序列融合(图16)。通过总基因合成(GenScript，Piscataway，USA)产生具有侧翼5’NotI和3’HindIII位点的全部核苷酸序列，将其组装到专有的哺乳动物表达载体pEvi5中，pEvi5通过Evitria(Schlieren,，瑞士)的NotI/HindIII限制性酶双重消化而线性化，并通过DNA测序进行验证。蛋白质的表达在适应悬浮的Evitria(Schlieren，瑞士)的CHO K1细胞中进行。通过离心和无菌过滤(0.2μm)收获经转染的CHO-K1细胞的集合的上清液，然后用StrepTactin柱子(IBA GMH,Goettingen,德国)进行基于FPLC的亲和纯化。
IgG的PiggyBac转座子表达载体的构建
产生质粒骨架和抗体序列的所有DNA合成由GenScript(Piscataway，USA)进行。根据(Yusa K et al.(2011)Proc Natl Acad Sci USA 108,1531-1536)的高活性PiggyBac转座酶(hyPB)的氨基酸序列针对鼠表达进行密码子优化，用侧翼限制性位点合成并克隆到瞬时表达载体pcDNA3.1上(图17)。用于产生可转座抗体表达构建体(pPB)的骨架由具有侧翼限制性位点的模块化部分组装，所述侧翼限制性位点合成或衍生自经序列验证的市售载体，并且在专利WO 2014013026 A1中详细描述。
如下通过两步或三步克隆将抗体ORF组装到转座载体骨架中：使用5’NotI/3’NheI(IgHV)和5’NotI/3’BsiWI(IgκV)或5’NotI/3’KasI(IgλV)限制性位点引入抗体可变区连同前导序列MNFGLRLIFLVLTLKGVQC，与使用5’NheI/3’BstBI(IgHC-γ1)或5’BsiWI/3’BstBI(IgKC)或5’KasI/3’BstBI(IgLC)限制性位点的恒定区片段在同一阅读框内。
人源化的ROR-1IgG重链和轻链表达文库的构建
兔抗ROR1抗体R11和R12(Yang J et al.(2011)PLoS ONE 6,e21018)和鼠抗-ROR1抗体2A2(Baskar S et al.(2012)mAbs 4,1-13)的人源化的框架区已经与来自健康供体的通过下一代测序(NGS)衍生的数百万人VH和VL序列比对，并且通过专有算法，已经选择了与啮齿类亲代mAb相比最为同源的人框架。选定的框架已通过专有算法用计算机技术与啮齿动物抗-ROR1 mAbs R11、R12和2A2的亲代mAb的CDR进行组装。
选定的人可变区连同前导序列MNFGLRLIFLVLTLKGVQC由Gen9,Inc.(Cambridge,USA)合成。
为了2A2的人源化，合成了64个VH x 49VL变体，为了人源化R11，合成了101个VH x82VL变体，以及为了将R12人源化，总共合成了25个VH x 25VL变体。
将合成的VHs和VLs的等分试样合并至等摩尔量并使用包含NotI限制性酶识别位点的正向引物univ-NotI-SP-F，NotI限制性酶识别位点用于随后VH和VL序列文库的定向克隆。
(GAGGAGGCGGCCGCCATGAACTTTGGG)
和包含NheI限制性酶识别位点的反向引物huCG1-B，NheI限制性酶识别位点用于随后VH序列文库的定向克隆。通过PCR进行扩增。
(AAGACCGATGGGCCCTTGGTG)
反向引物huCK-B
(GAAGACAGATGGTGCAGCCAC)
用于包含BsiWI限制性酶识别位点的Vκ序列文库的扩增，BsiWI限制性酶识别位点用于随后Vκ序列文库的定向克隆。
反向引物huCL-B
(GGAAACAGAGTCACGCTTGG)
用于包含KasI限制性内切酶识别位点的Vλ序列文库的扩增，KasI限制性内切酶识别位点用于随后Vλ序列文库的定向克隆。
将PCR扩增的文库片段进行柱纯化，用NotI/NheI(IgHV)或NotI/BsiWI(IgκV)或NotI/KasI(IgλV)进行消化，并通过双向(HC构建体)或3向克隆(LC构建体)将其克隆到上述转座载体中。通过用NotI/NheI消化的pPB-Hygro-HCg1-gen(图18(a))制备HC构建体的载体片段。通过用NotI/BstBI限制酶消化pPB-Puro-LC(图18(b))制备用于HC构建体的载体片段。通过全基因合成产生包括侧翼限制性位点5’BsiWI/3’-BstBI(Cκ)和5’KasI/3’-BstBI(Cλ)的恒定区序列并克隆到pUC57(GenScript，Piscataway，USA)中。用于组装文库的恒定区片段通过用BsiWI/BstBI(产生κ恒定区片段)或KasI/BstBI(产生λ恒定区片段)消化含有κ或λ恒定区的相应质粒的DNA maxi-preps来产生。将文库连接物转化到预先培养1小时的Neb5-α电感受态细胞(Neb，Ipswich，USA)中，在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的选择性LB-培养基中扩增过夜，并且使用NucleoBond Xtra Maxi Plus试剂盒(Macherey&Nagel,Dueren,德国)分离质粒DNA。通过将预培养物的系列稀释液涂布选择性琼脂平板(滴定板)上来确定文库大小，并计算获得的克隆数以估计文库复杂性。使用引物pPBseq13(GGCCAGCTTGGCACTTGATG)，通过限制性消化和可变区的测序来分析来自滴定板的至少12个克隆。
最佳人源化的ROR1 mAb的表达、展示和鉴定
为了展示人源化抗体文库，使用L11鼠preB细胞，其代表用Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)转化的从RAG-2缺陷小鼠分离的preB细胞系63-12的自身产生的亚克隆(ShinkaiY et al.(1992)Cell,68(5),855–867)。将细胞在补充有2％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素、0.1mg/ml链霉素(Amimed,BioConcept Ltd.,Allschwil,瑞士)和50μM b-巯基乙醇(Amresco,Solon,美国)的SF-IMDM的培养基中在螺旋瓶(Sarstedt,Nümbrecht,德国)中在37℃、7.5％ CO2中培养。
EMT6细胞(教授A.Zippelius(巴塞尔大学)的馈赠)以及293T细胞都在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素b(Amimed)的DMEM中在37℃、5％CO2下生长。697细胞在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素b(Amimed)的RPMI中在37℃、7.5％CO2下生长。
表达人源化的抗-ROR1 IgG文库的L11细胞的转座和选择：
电穿孔前一天，L11细胞以0.2E+6个细胞/ml的密度接种，第二天获得对数期生长细胞。整个电穿孔程序在室温下进行。1200rpm离心6分钟来收集细胞，并重悬于纯RPMI培养基中至8E+7细胞/ml的浓度。每杯中，将25μg的总DNA稀释于400μlRPMI中(如图S2B中所示使用HC/LC/转座酶重量比)，并将400μl细胞悬液与稀释的DNA混合并转移至0.4cm间隙基因脉冲小杯(BioRad,Hercules,USA)中。电穿孔用配备有设置为300V和950μF的电容扩充仪的BioRad GenePulser II来完成。在杯中温育5-10分钟以使孔闭合后，将细胞在完全SF-IMDM生长培养基中洗涤一次，重悬并接种到T175组织培养瓶中，完全生长培养基总体积为64ml。为了进行选择，同时加入1μg/ml嘌呤霉素和800μg/ml潮霉素(分别为0240.4和CP12.2；CarlRoth,Karlsruhe,Germany)，并且允许选择进行4-5天而不更换培养基或传代培养，直到完成选择。
细胞文库的FACS染色和FACS分类
将细胞在FACS缓冲液(补充有2％FCS的PBS)中以1E+7细胞/ml的浓度在冰上进行染色。洗涤步骤在1300rpm下离心3分钟沉淀细胞，再重悬于5倍染色反应体积的FACS-缓冲液中，再次沉淀并重悬于1倍染色反应体积的FACS缓冲液中来进行。
为了分析表面抗体的表达，细胞用1:200稀释的Ig-κLC-APC标记的抗体(MH10515,Life Technologies,Carlsbad,USA)染色30分钟。将细胞洗涤一次并用FACSCalibur仪器(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，USA)通过流式细胞术进行分析。
对于表达IgG文库的细胞文库的染色，加入预先确定限制浓度的抗原(0.25μg/mlROR1-strep)和1:250稀释的抗人IgG(Fcγ特异性)PE(ebioscience 12-4998-82)，并将细胞在暗处于冰上孵育30分钟。在洗涤细胞一次后，使用1:500稀释的Strep-mAb classicOyster 645(2-1555-050iba,Goettingen,Germany)检测与细胞结合30分钟的strep-标记的抗原。最后一次洗涤后，使用细胞过滤器盖FACS管(BD Falcon)过滤细胞。分选在FACSAriaII仪器上进行(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,USA)。
通过ELISA筛选表达抗ROR1 IgG的L11克隆
通过在4℃用包被缓冲液(100mM碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液)稀释的抗原包被Nunc-Immuno MaxiSorp 96孔板(Thermo Scientific,Waltham,USA)过夜，用ELISA进行抗原结合分析。对于夹心ELISA，将平板在4℃用包被缓冲液稀释的2μg/ml AffiniPure F(ab')2片段驴抗人IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,USA)包被过夜。包被后，用PBS/0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤平板两次，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)(Carl Roth,Karlsruhe,Germany)的PBS-T在37℃封闭1小时，并用PBS/T再洗涤5次。将L11克隆上清液预稀释3倍，而将来自293T细胞的上清液预稀释50倍。使用稀释至0.5μg/ml的亲代mAb制作标准曲线。加入3.5倍系列稀释的样品，并将平板在37℃孵育1小时。用PBS/T洗涤5次后，在含有1％BSA的PBS/T中以10’000倍稀释加入HRPO缀合的F(ab)2抗人FC-γ(Jackson Immunoresearch,West Grove,USA)，并将平板在37℃孵育1小时。最后，用PBS/T洗涤平板5次，且加入50μlSigmafast OPD过氧化物酶底物((Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)。加入50μl 2MH2SO4终止反应。测量490nm处的吸光值。使用已知浓度的标准品的OD50值和使用通过4点曲线拟合模型确定的样品计算EC50。
通过表面等离子体共振(SPR)分析亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)测定亲和力，并使用Biacore Evaluation T200 V2.0软件评估数据。为了捕获mAb，将山羊α-人Fc-γ特异性IgG(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)共价固定在CM5芯片(GE Healthcare,#BR-1005-30)上。
为了测量L11克隆上清液，用完全SF-IMDM细胞培养基将抗体稀释至0.3μg/ml，并以10μl/min的流速捕获120s。在运行缓冲液中将ROR1-strep稀释至40nM。在30μl/min的流速下测量结合120s，随后测量解离200s。由于在较晚的时间点形成高位平台，曲线使用30s解离进行拟合。捕获水平范围为29.1RU至57.7RU。
为了确定选定的基于2A2和R11的人源化的克隆的抗ROR1亲和力并与亲代mAb进行比较，用运行缓冲液将纯化的mAb稀释至0.3μg/ml，并以10μl/min的流速捕获120s。用2倍系列稀释液将ROR1-strep在运行缓冲液中进行稀释，浓度范围为20nM至2.5nM。在30μl/min的流速下测量结合120s，且随后测量解离200s。由于在较晚的时间点形成高位平台，曲线使用30s解离进行拟合。捕获水平范围为29.1RU至57.7RU。
为了使用瞬时HEK293T上清液初步测定huR12克隆的亲和力和亲代R12，将IgG表达载体瞬时转染入293T细胞，并通过ELISA定量上清液中的IgG的滴度。为了SPR，将上清液用运行缓冲液(HBS-EP+pH 7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20))稀释至1μg/ml IgG，并以30μl/min的流速捕获200s。用2倍系列稀释液将ROR1-strep在运行缓冲液中进行稀释，浓度范围为20nM至2.5nM。在30μl/min的流速下测量结合120s，且随后测量解离1000s。捕获水平范围为26.9RU至54.1RU。
为了使用纯化的IgG测定huR12克隆亲和力和亲代R12，用运行缓冲液(HBS-EP+pH7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20))将mAb稀释至2μg/ml IgG，并以30μl/min的流速捕获200s。用2倍系列稀释液将ROR1-strep在运行缓冲液中进行稀释，浓度范围为1.25nM至20nM。在30μl/min的流速下测量结合120s，且随后测量解离1000s。捕获水平范围为26.9RU至54.1RU。
所有测量都是在25℃下进行。所有曲线使用RI＝0的1:1结合模型进行拟合。使用100mM H3PO4以30μl/min的流速再生90s。
从显示出强ROR1结合特异性的L11克隆回收和鉴定VH和VL序列
使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)从在24孔板中生长的～2E+6细胞中提取RNA，并根据生产商说明书使用随机九聚体用ProtoScriptII反转录酶(Neb,Ipswich,USA)进行反转录。使用Q5 DNA聚合酶(Neb,Ipswich,USA)通过正向引物EF1aNotI_F(CCATTTCAGGTGTCGTGAGC)和针对VH的反向引物CG-revseq-1(GTTCGGGGAAGTAGTCCTTG)以及针对VL的反向引物Intron-rev-1(GTGGATGTCAGTAAGACCAATAGGTGCC)通过PCR来扩增可变区。根据生产商说明书通过柱纯化(Macherey&Nagel,Dueren,德国)纯化PCR产物，用限制性酶消化并通过琼脂糖凝胶纯化进行纯化。将回收的可变区与人Ig-γ1或Ig-κ恒定区分别通过双向或3向克隆一起克隆到pCB14b中。使用测序引物CMVseq2(GCAGTGTAGTCTGAGCAGTAC)通过Sanger测序(在瑞士Balgach的Microsynth AG上进行)对几个细菌克隆的可变区进行测序，并使用Geneious Software(Biomatters,New Zealand)将其与文库序列进行比对。
重组IgG抗体在293T细胞中的表达
通过将基于pCB14b的表达构建体转染至HEK-293T细胞中并收获细胞上清液来进行重组抗体的表达。
对于瞬时抗体表达，使用Lipofectamine LTX plus(LifeTechnologies,Carlsbad,USA)在6孔板中转染细胞。每孔转染2.5μg总DNA，并在第二天加入新鲜生长培养基，培养4天。将上清液无菌过滤并储存于-20℃直至分析。
对于大规模的半稳定抗体表达，使用Lipofectamine LTX plus在10cm培养皿中转染细胞，通过使用2μg/ml嘌呤霉素(0240.4,Carl Roth,Karlsruhe,德国)选择进行富集，扩大到用聚-L赖氨酸包被的14cm培养皿中并保持在含有161μg/ml N-乙酰-L-半胱氨酸、10mg/ml L-谷胱甘肽和1μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12无血清培养基(Gibco)中。每周收获两次含有抗体的上清液，无菌过滤并存储于4℃下直至纯化。使用
Figure GDA0003938707660000231
纯化仪(GELifesciences)通过FPLC进行纯化。在上清液通过Amsphere蛋白A柱(JWT203CE,JSR Micro,Sunnyvale,USA)后，然后用PBS洗涤，用pH 2.5 0.1M甘氨酸洗脱抗体并立即用pH8.0 1MTris中和。使用Amicon Ultra-4离心过滤器(Merck Millipore)与PBS进行缓冲液交换。
产生过表达人ROR1靶抗原的EMT-6细胞乳腺癌细胞
通过转座产生过表达人ROR1抗原的鼠EMT6细胞。使用含有嘌呤霉素选择标记的PiggyBac转座表达载体产生用于表达全长人ROR1(NP_005003.2)的表达构建体(pPB-PGK-Puro-ROR1)(图19)。该载体通过用单独的磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)驱动的选择标记的表达取代IRES驱动的抗生素选择标记的表达而得到。以与对于L11细胞相同的方式，用pPB-PGK-Puro-ROR1表达载体和PiggyBac表达载体pcDNA3.1-mPB(图17)对EMT6细胞进行电穿孔，除了将EMT6细胞沉淀重悬于RPMI中至5E+6cells细胞/ml，并且使用20μg总DNA(pPB-PGK-Puro-ROR1：转座酶＝3:2)。电穿孔后，将细胞接种在6孔板上并使用3μg/ml嘌呤霉素进行6天的选择。通过如下转染和选择的细胞染色来分离单细胞克隆：将细胞用在FACS缓冲液(PBS/2％FCS)中稀释的2μg/ml抗ROR1抗体2A2(小鼠-人IgG嵌合体)在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，使用在FACS缓冲液中1:200稀释的PE缀合的Fc特异性抗人IgG在冰上检测一抗。最后一次洗涤后，使用FACSAriaII仪器和FACSDiva软件(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,USA)将单细胞分选到96孔板中。细胞扩增后，通过上述染色和流式细胞术分析验证克隆来同源地表达抗原。
分选酶介导的抗体缀合
基本上如所描述的，进行分选酶介导的抗体缀合(Beerli et al.,PloS One,10(7),e0131177,2015)。简言之，在3mM分选酶A存在下，在50mM HEPES、150mM NaCl、1mMCaCl2、10％甘油，pH 7.5中，在25℃下将分选酶标记的mAbs[10μM]与寡甘氨酸修饰的毒素[200μM]孵育3.5h。通过使其通过用25mM HEPES、150mM NaCl、pH7.5平衡的rProtein AGraviTrap柱(GE Healthcare)来终止反应，随后用20柱体积(CVs)的洗涤缓冲液(25mMHEPES pH 7.5、150mM NaCl、10％v/v甘油)洗涤。结合缀合用5CVs的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸、50mM NaCl，pH 2.5)洗脱，将0.5CV部分收集到含有25％v/v 1M HEPES pH8的管中以中和酸性。根据制造商说明书使用ZebaSpin脱盐柱(GE Healthcare，Thermo)合并和配制含蛋白质的部分。基于mAb 2A2和R11的嵌合和人源化形式的ADCs在不含Ca2+和Mg2+(Amimed-Bioconcept)的PBS中配制。基于嵌合mAb R12的ADCs在20mM HEPES，pH6.8、175mM蔗糖、0.02％Tween20中配制，而基于人源化R12 mAb的ADCs在15mM组氨酸，pH6.0、175mM蔗糖、0.02％Tween20中配制。
体外细胞杀伤试验
基本上如所描述的，在细胞杀伤试验中研究ADCs的细胞毒性(Beerli et al.,PloS One,10(7),e0131177,2015)。简言之，将细胞接种于含75μL生长培养基的96孔板中，于37℃含7.5％CO2气氛的增湿培养箱中生长。细胞以1’000细胞/孔(EMT6及其衍生克隆)或10'000个细胞/孔(用于测试在697细胞上的2A2和hu2A2ADC)或75'000个细胞(用于在697个细胞上测试huR12-4ADC)接种于96孔板中。第二天，加入25μL在生长培养基中的每种ADC的3.5倍系列稀释液，所得最终ADC浓度从20μg/mL到0.02ng/ml。对于竞争性，ADC系列稀释在含有浓度为200μg/mL的未缀合mAb(“comp”)的生长培养基中进行。再过4天后，将培养板从培养箱中取出并在室温下平衡。大约30分钟后，小心地从每个孔中取出50μL培养基并用50μL
Figure GDA0003938707660000241
发光溶液(Promega，Cat.No G7570)代替。以450rpm振荡培养板5分钟，然后在黑暗中非振荡下孵育10分钟，在Tecan Spark 10M上以每孔250毫秒的积分时间测量荧光。
在NOD-SCID小鼠中人B细胞白血病细胞的播散型异种移植模型(697)
研究了基于与图6的甘氨酸修饰毒素缀合的SMAC-缀合的hu2A2b-Q11的抗体药物缀合物(ADC)的功效，并将其在携带源自人697白血病癌细胞的肿瘤的雌性NOD-SCID小鼠的播散型异种移植模型中与用同种型对照-ADC(曲妥珠单抗，靶向HER2)治疗的组进行比较。在研究第0天，用697个肿瘤细胞(5×106细胞/动物，在200μL PBS(Dulbecco`s磷酸盐缓冲盐水中))接种12只9周龄的小鼠，每只体重至少20g。在PBS中配制的测试ADC在第7、14和21天以1.0mg/kg给药(i.v.)小鼠，一组6只小鼠，在每次给药ADC前20小时给药小鼠IgG(Privigen IVIG(CSL Behring，Lot.4335500037)，30mg/kg)。在一组6只小鼠的相同条件和方案下，给药一种同种型对照ADC(HER2靶向曲妥珠单抗，与图6的甘氨酸修饰毒素缀合的SMAC)。任何表现出中度疼痛、中度窘迫或任何程度痛苦的临床症状的动物都会受到人道安乐死。此外；根据欧洲和丹麦在实验研究中关于动物的立法，如果任何动物表现出超过研究特定人道终点限制的临床症状，则将其人道安乐死。在整个研究中每周测量三次每只动物的体重。使用软件PRISM进行数据分析。
附图
图1：用于SMAC-technologyTM免疫配体缀合的Gly5修饰的美登素毒素的化学结构。
在图1的上部显示美登木素生物碱(maytansinoid)是含有所谓的SMCC接头的DM1([N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素]，其中寡聚甘氨酸肽(Glyn)，以便允许通过SMAC-technologyTM进行缀合。该SMCC接头仅是SMAC-technologyTM缀合的免疫配体毒素缀合物的可选组分，并且对于负载物的缀合无关紧要。
可以任选地包括其他任选的接头结构，如美登木素生物碱负载物DM4([N20-脱乙酰基-N20-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素)的SPDB接头，而不是DM1，参见图2。
在图1的下半部分，美登木素生物碱是美登素本身，其是未缀合形式具有图2(a)的结构，可用于生成本文所述的寡聚甘氨酸肽(Glyn)衍生物，已经形成了本文分析的免疫配体美登素缀合物的基础。
图2：可以在本发明的上下文中使用的三种美登木素生物碱。图2(a)：美登素，图2(b)：DM1([N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素]，图2(c)：DM4([N20-脱乙酰基-N20-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素])。
图3(a)：可以与根据本发明的免疫配体-毒素-缀合物一起使用的蒽环霉素(PNU)衍生物。该衍生物可以在其波浪线处包含化学结构，该化学结构包含与所述蒽系衍生物缀合的寡甘氨酸肽(Glyn)，使得寡甘氨酸(Glyn)肽具有游离氨基末端，并且其中n是≥1和≤21之间的整数。衍生物衍生自图5所示的具有式(v)的蒽环霉素PNU-159682。
图3(b)：寡聚甘氨酸肽(Glyn)通过乙二氨基接头(EDA)与蒽环衍生物缀合，如图3(a)所示，乙二氨基接头通过第一酰胺键与蒽环衍生物缀合，同时通过第二酰胺键、所述乙二氨基接头和寡甘氨酸肽与寡甘氨酸肽的羧基末端缀合。
图4(a)：可以与根据本发明的免疫配体-毒素-缀合物一起使用的另一种蒽环霉素(PNU)衍生物。该衍生物可以在其波浪线处包含化学结构，该化学结构包含与所述蒽环衍生物缀合的寡甘氨酸肽(Glyn)，使得寡甘氨酸(Glyn)肽具有游离氨基末端，并且其中n是≥1和≤21之间的整数。衍生物衍生自图5所示的具有式(v)的蒽环霉素PNU-159682。
图4(b)：寡聚甘氨酸肽(Glyn)通过乙二氨基接头(EDA)与蒽环衍生物缀合，如图4(a)所示，乙二氨基接头通过第一酰胺键与蒽环衍生物缀合，同时通过第二酰胺键、所述乙二氨基接头和寡甘氨酸肽与寡甘氨酸肽的羧基末端缀合。
图5：现有技术中(例如，WO2009099741，或Quintieri L et al(2005)Clin CancerRes.11,1608-17)中所述的PNU-159682的结构。
图6：用于SMAC技术的PNU-EDA-Gly5的结构，如本文实施例中公开的，使用分选酶与C末端LPETG分选酶标记的单克隆抗体缀合。
图7：位点特异性分选酶介导的抗体缀合(SMAC-技术)的示意图。单克隆抗体需要用C-末端LPXTG分选酶标签来产生。需要产生毒素负载物以包含连续一段数量的甘氨酸残基(n≥1且≤21，优选n≥3且≤10，最优选n＝5)的寡聚甘氨酸肽区段(Glyn-区段)。分选酶A来自金黄色葡萄球菌，特异性识别LPXTG五肽基序并催化寡聚甘氨酸肽区段向LPXTG的苏氨酸-甘氨酸肽键的转肽化，从而在苏氨酸和N-末端甘氨酸之间产生新的稳定肽键的寡甘氨酸区段。
图8：评估人源化2A2抗体的性能并与抗体-药物缀合物(ADC)形式的亲代嵌合mAb的效力进行比较。为了产生ADCs，抗体表达重链和轻链，C-末端用包含分选酶A识别基序的序列标记，并使用分选酶介导的缀合(WO2014140317)缀合至Gly5修饰的蒽环类抗菌肽PNU159682-衍生物上，然后在使用表达ROR1的ALL癌细胞系的体外杀伤试验中进行测试。697表达的ROR1用2A2抗ROR1抗体染色显示，并用流式细胞术分析(图8(a))。当进行细胞杀伤时，嵌合2A2-PNU和人源化形式都有效地杀伤了697个细胞，并且这种效应是靶向特异性的，因为它可以与未缀合的抗体竞争(“冷竞争反应”)。处理四天后，使用发光细胞活力测定法对活细胞进行定量。每个数据点表示重复的平均值，误差线表示SD(图8(b))。在用人源化697ALL细胞系建立的播散型小鼠模型中，在体内评估了人源化2A2 ADC的功效。显示了Kaplan-Meyer存活曲线，并与用同种型对照处理的组进行比较(图8(c))。用人源化2A2ADC处理的小鼠相对于对照显示出延长的存活期。
图9：Transpo-mAb对小鼠2A2和兔R11抗ROR1抗体的人源化。可转座的人源化文库由64个VH x 49VL(小鼠)和101个VH x 82VL(兔)序列组成，并且使用DNA重量比4:2:1(HC：LC：转座酶)进行转座。细胞文库通过抗生素选择富集抗体表达，并在预先确定的限制浓度下使用可溶性抗原(ROR1-strep)标记抗原结合。使用荧光团标记的抗strep标签抗体(StrepMAB-645)检测抗原结合。为了使抗体表面表达水平归一化，文库用抗IgG-PE共染色。然后通过FACS分离抗原结合单细胞。图9(a)显示了在分选前立即分析的针对抗原结合(x轴)和抗体表面表达(y轴)分析的人源化细胞文库的流式细胞术图。单细胞分选后，扩增克隆上清液，从而产生通过SPR筛选的含有抗体的培养上清液。图9(b)显示了显示由单细胞分选的克隆上清液(单体)或纯化的亲代单克隆抗体(一式三份)通过SPR测定的ka和kd的等亲和力图。通过RT-PCR回收显示最佳KD的5个克隆的抗体序列，并通过ELISA解卷积/验证。序列不匹配文库设计没有进一步测试。来自该分析的前3个克隆在293T细胞中表达、纯化并通过SPR测定亲和力。图9(c)显示了每个筛选的这些纯化的前3个mAbs的等亲和力图。
图10：通过Transpo-mAb对兔R12抗体的人源化。可转座人源化文库由25个VH x25VL序列组成，并且使用0.25:0.125:1的DNA重量比(HC：LC：转座酶)转座到L11细胞中。用人源化R12 cDNA文库转座的细胞通过抗生素选择富集抗体表面表达，然后单细胞分选抗原结合。扩增产生的克隆并通过ELISA分析培养上清液。所示为通过ELISA平行分析抗原结合和IgG滴度的单细胞克隆上清液的散点图。将在96孔板中生长的克隆上清液的系列稀释物直接用于评估与用限制浓度的ROR1包被的ELISA板的结合以最小化亲合力效应。IgG水平通过夹心ELISA测定。使用已知浓度的亲代mAb R12获得的标准曲线计算EC50值。选择那些具有最高ROR1结合：IgG滴度比的16个克隆用于抗体可变区序列回收。
图11：产生的人源化抗体与临床批准的人源化mAb与人种系基因的比较。对指定抗体的可变区进行Ig-Blast数据库检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，以获得最接近的人种系序列，以及确定框架区1、2和3内的序列相同性。在所有三种框架中与人种系的平均相同性被认为是人源化等级的量度，并以百分比表示。对于文库，显示了文库内所有序列的平均值。FDA批准状态和参考人源化抗体序列，并从http://imgt.org/中检索。
图12：人源化R12抗体的性能和与抗体-药物缀合物(ADC)形式的亲代嵌合mAb的效力的比较。为了产生ADC，使用包含c-末端分选酶A识别基序的重链和轻链表达抗体，并且使用分选酶介导的缀合(WO2014140317)将抗体与Gly5修饰的蒽环霉素(如图6所示)缀合。使用表达内源性水平的ROR1的人697ALL细胞(图8(a))和使用过表达人ROR1的鼠EMT6细胞克隆(EMT6-ROR1克隆6、EMT6-ROR1克隆14)或亲代EMT6细胞(EMT WT)，细胞在体外杀伤试验中测试所得ADCs。为了验证EMT6细胞变体上抗原表面表达的存在与否，细胞用2μg/ml 2A2抗ROR1抗体染色，随后通过流式细胞术分析(图12(a))。为了评估产生的ADCs的效力，将人ALL癌细胞(697)以及过表达人ROR1(EMT6-ROR1克隆6、EMT6-ROR1克隆14)或亲代EMT6细胞(EMTWT)的鼠EMT6细胞暴露于ADCs中4天，并使用基于发光的细胞活力测定(分别为图12(b)和(c))定量细胞活力。在所有情况下，当用人源化的基于R12的ADCs处理时，表达ROR1的细胞的细胞活力降低(与ROR1表达正相关)，而用对照ADCs处理时仅在最高剂量下导致非特异性杀伤。
图13：使用纯化的抗体比较通过SPR测定的人源化和亲代R12mAb的亲和力。所示的三种人源化R12mAb在HEK293T细胞中大规模表达，通过蛋白A亲和层析纯化并进行SPR分析以测定对可溶性ROR1-strep的亲和力。使用山羊α-人Fc-γ特异性IgG捕获抗体。将ROR1-strep用运行缓冲液稀释进行2倍系列稀释，浓度范围为1.25nM至20nM。测量120s内的结合，随后测量1000s内的解离。捕获水平范围为26.9RU至54.1RU。该分析证实人源化与亲代mAbR12的单价亲和力相比显著增加超过5倍。
图14：在HEK293T细胞中用于瞬时或半稳定抗体表达的基于EBNA的表达载体pCB14b。所示为载体的主要组分和用于所述克隆的限制性位点。
图15：可转座抗体表达构建体。所示为载体的主要组分和用于所述克隆的限制性位点。(a)可转座2A2重链表达载体。(b)可转座2A2轻链表达载体。(c)可转座R12重链表达载体。(d)可转座R12轻链表达载体。
图16：Strep标记的人ROR1的序列。显示的是人ROR1的胞外域的氨基酸序列，N-末端用strep标签(WSHPQFEK)标记。
图17：用于瞬时表达高活性PiggyBac转座酶(hyPB)的构建体。
图18：用作骨架以产生可转座重链文库的载体。所示为载体的主要组分和用于所述克隆的限制性位点。(a)用于***人源化重链可变区片段的载体。使用NotI/NheI位点引入重链可变区片段。(b)用于***人源化轻链可变区片段以及κ或λ型恒定s区片段的载体。将用NotI/BsiWI消化的κ轻链可变区片段连同用BsiWI/BstBI消化的κ轻链恒定区片段一起引入用NotI/BstBI线性化的该载体中。将用NotI/KasI消化的λ轻链可变区片段连同用KasI/BstBI消化的λ轻链恒定区片段一起引入用NotI/BstBI线性化的该载体中。
图19：用于表达全长ROR1的可转座载体。所示为载体的主要组分和用于所述克隆的限制性位点。
序列
Figure GDA0003938707660000291
Figure GDA0003938707660000301
参考引用
本说明书包含对分选酶介导的抗体缀合(SMAC)的一些参考。该技术在WO2014140317中有充分披露，其内容通过引用结合于此以用于实现目的。
Figure GDA0003938707660000321
表1
Figure GDA0003938707660000331
表2
序列表
<110> 恩比伊治疗股份公司
<120> 抗ROR1抗体
<130> ND40470
<160> 55
<170> Excel Makro
<210> 1
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<213> artificial
<220>
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<213> artificial
<220>
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Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> artificial
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> artificial
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC hu2A2-D16, humanized from 2A2
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
<220>
<223>CDR3 LC R11
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1 5 10
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC chimeric mAb R11
<400> 21
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC chimeric mAb R11
<400> 22
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser
85 90 95
Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 138
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC rbQ11, humanized from R11
<400> 23
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Ile
35 40 45
Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Asp Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 24
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC rbQ11, humanized from R11
<400> 24
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Ser Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Lys
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly
100 105 110
Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC rbD4, humanized from R11
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC rbD4, humanized from R11
<400> 26
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser
85 90 95
Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC rbQ12, humanized from R11
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
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100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 110
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<213> artificial
<220>
<223>VR LC rbQ12, humanized from R11
<400> 28
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser
85 90 95
Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR1 HC R12
<400> 29
Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR2 HC R12
<400> 30
Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR3 HC R12
<400> 31
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR1 LC R12
<400> 32
Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR2 LC R12
<400> 33
Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>CDR3 LC R12
<400> 34
Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val
1 5
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC Chimeric mAb R12
<400> 35
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC Chimeric mAb R12
<400> 36
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr
100 105 110
<210> 37
<211> 121
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC huR12_4, humanized from R12
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC huR12_4, humanized from R12
<400> 38
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC huR12_7, humanized from R12
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC huR12_7, humanized from R12
<400> 40
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC huR12_11, humanized from R12
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR LC huR12_11, humanized from R12
<400> 42
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Gly Phe
100 105 110
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>VR HC huR12_16, humanized from R12
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ala Ala Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<212> PRT
<211> 112
<213> artificial
<220>
<223>VR LC huR12_16, humanized from R12
<400> 44
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Tyr Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Glu Lys Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Gly Phe
100 105 110
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>forward primer univ-NotI-SP-F
<400> 45
gaggaggcgg ccgccatgaa ctttggg
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>reverse primers huCG1-B
<400> 46
aagaccgatg ggcccttggt g
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>Reverse primer huCK-B
<400> 47
gaagacagat ggtgcagcca c
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>Reverse primer huCL-B
<400> 48
ggaaacagag tcacgcttgg
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>primer pPBseq13
<400> 49
ggccagcttg gcacttgatg
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>forward primer EF1aNotI_F
<400> 50
ccatttcagg tgtcgtgagc
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>reverse primers CG-revseq-1
<400> 51
gttcggggaa gtagtccttg
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>Intron-rev-1
<400> 52
gtggatgtca gtaagaccaa taggtgcc
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>sequencing primer CMVseq2
<400> 53
gcagtgtagt ctgagcagta c
<210> 54
<211> 19
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<213> artificial
<220>
<223>leader sequence
<400> 54
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 55
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<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>strep tag
<400> 55
Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5

Claims (26)

1.人或人源化的抗体、基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，其靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)，并且其包含三个重链CDR序列：
SEQ ID NO.29CDR1 HC,
SEQ ID NO.30CDR2 HC,
SEQ ID NO.31CDR3 HC,和
三个轻链CDR序列：
SEQ ID NO.32CDR1 LC,
SEQ ID NO.33CDR2 LC,
SEQ ID NO.34CDR2 LC，并且
其包含如下的重链可变区序列和轻链可变区序列：
SEQ ID NO.37(VR HC)和SEQ ID NO.38(VR LC)，或
SEQ ID NO.39(VR HC)和SEQ ID NO.40(VR LC)，或
SEQ ID NO.41(VR HC)和SEQ ID NO.42(VR LC)，或
SEQ ID NO.43(VR HC)和SEQ ID NO.44(VR LC)。
2.如权利要求1所述的抗体，其由如下的重链可变区序列和轻链可变区序列组成：
SEQ ID NO.37(VR HC)和SEQ ID NO.38(VR LC)，或
SEQ ID NO.39(VR HC)和SEQ ID NO.40(VR LC)，或
SEQ ID NO.41(VR HC)和SEQ ID NO.42(VR LC)，或
SEQ ID NO.43(VR HC)和SEQ ID NO.44(VR LC)。
3.如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，其中所述受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)是人ROR1。
4.如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，其中所述抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段具有的靶结合亲和力(KD)≤110pM。
5.如权利要求1所述的基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，其是双特异性抗体或多特异性抗体。
6.分离的核酸或其集合，其编码如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，或如权利要求5所述的双特异性抗体或多特异性抗体。
7.载体，其包含至少一种如权利要求6所述的核酸。
8.分离的细胞，其表达如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，或如权利要求5所述的双特异性抗体或多特异性抗体，和/或其包含如权利要求6所述的核酸或其集合，或如权利要求7所述的载体。
9.产生如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，或如权利要求5所述的双特异性抗体或多特异性抗体的方法，其包括培养如权利要求8所述的细胞，并纯化所述抗体、基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段。
10.具有通式A-(L)n-(T)m的免疫配体-药物缀合物，其中：
·A是靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(ROR1)的免疫配体，
·L是接头，
·T是毒素，
并且其中n和m是≥1和≤10之间的整数，并且其中所述免疫配体是如权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、保留靶结合能力的抗体衍生物或片段，或如权利要求5所述的双特异性抗体或多特异性抗体。
11.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述接头是选自以下的至少一种：
·寡肽接头，
·马来酰亚胺接头，任选地包含可切割的间隔物，所述间隔物可通过pH、氧化还原电位和/或特定细胞内酶的变化而被切割。
12.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述接头包含选自以下序列的寡肽：LPXSGn、LPXAGn、LPXTGn、LAXTGn、LAETGn、LPXTAn或NPQTGn，其中n为在≥1和≤21之间的整数，且X是任何氨基酸。
13.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述接头缀合至所述免疫配体的至少一个亚结构域的C端。
14.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，其中在缀合之前，
·所述免疫配体携带用于或偶联至所述免疫配体的至少一个亚结构域的C端的分选酶识别标签，以及
·所述毒素包含短甘氨酸区段，其长度为1-20个甘氨酸残基。
15.如权利要求14所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述毒素包含短甘氨酸区段，其长度为3至5个氨基酸残基。
16.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述毒素选自以下：
·美登木素生物碱，
·奥瑞他汀(auristatin)，
·蒽环类，
·calcheamicin，
·tubulysin，
·倍癌霉素，
·放射性同位素，
·包含毒素负载物的脂质体，
·蛋白毒素，
·紫杉烷，和/或
·吡咯苯二氮卓类物质。
17.如权利要求16所述的免疫配体-药物缀合物，其中所述毒素是PNU衍生的蒽环类。
18.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，所述免疫配体-药物缀合物通过分选酶介导(i)携带一个或多个分选酶识别标签的免疫配体与(ii)携带寡聚甘氨酸标签的一种或多种毒素缀合而产生。
19.如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物的生产方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如权利要求10中所列的免疫配体，所述免疫配体携带分选酶识别标签，
b)提供携带寡聚甘氨酸标签的一种或多种毒素，以及
c)通过分选酶介导缀合的方法缀合所述免疫配体和所述毒素。
20.ROR1特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1所述的抗体、基于抗体的结合蛋白、或抗体衍生物或片段，或如权利要求5中所述的双特异性或多特异性抗体，其融合或缀合至至少一个跨膜区和至少一个胞内结构域。
21.细胞，其包含权利要求20所述的嵌合抗原受体。
22.如权利要求1所述的基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，如权利要求5所述的双特异性或多特异性抗体，如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，或如权利要求20或21中所述的CAR或细胞，在制备用于治疗具有以下的患者的药物中的用途：
·患有肿瘤疾病的患者，
·具有患肿瘤疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤疾病的患者，
其中所述肿瘤疾病是选自以下的至少一种：
·血液肿瘤，其选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和急性髓性白血病(AML)，以及
·实体瘤，其选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
23.药物组合物，其包含如权利要求1所述的抗体或基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，如权利要求5中所述的双特异性或多特异性抗体，如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物或如权利要求20或21中所述的CAR或细胞，以及一种或多种药学上可接受的成分。
24.在体外杀伤或抑制表达ROR1的细胞生长的方法，所述方法包括向所述细胞施用药学有效量或剂量的(i)如据权利要求1所述的抗体或基于抗体的结合蛋白、抗体衍生物或片段，如权利要求5中所述的双特异性或多特异性抗体，如权利要求10所述的免疫配体-药物缀合物，或如权利要求20或21中所述的CAR或细胞，或(ii)根据权利要求23中所述的药物组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述表达ROR1的细胞是癌细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述ROR1是人ROR1。
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